אנו מציעים שיטה לוויסות פעילות פולימראז באמצעות גורמי שעתוק חומצת גרעין מלאכותית. ארכיטקטורה רגולטורית גנים זו יכולה לשמש אבן בניין למכשירים גנטיים במבחנה בעתיד. על ידי קשירת תחום כריכת DNA לפולימראז T7 RNA, טכניקה זו משלבת את המדרגיות של מעגלים מבוססי DNA, עם הפונקציונליות של מעגלי שעתוק.
התחל על ידי ביצוע תשעה דילול של oligonucleotide BG נטוש יחיד לנפח סופי של 50 microliters של מים מזוקקים כפולים, מחמש לאחד עד חמישה יחסים, כפי שצוין בטבלה. הכן תערובת תגובה אחת עבור כל דילול על ידי ערבוב שני microliters של חיץ SNAP עם ארבעה microliters של BG אוליגונוקלאוטיד, וארבעה microliters של SNAP T7 RNAP. הכן את בקרת הרנ"א על ידי החלפת האוליגונוקלאוטיד במים מזוקקים כפולים, ובקרת ה- DNA על ידי החלפת SNAP T7 RNAP במים מזוקקים כפולים.
הגדר 11 תגובות על-ידי הוספת שני מיקרוליטרים של כל דגימה לארבעה מיקרוליטרים של חיץ SNAP, ושני מיקרוליטרים של צבע טעינת חלבונים לכל דגימה. מחממים את התגובות במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס, לפני טעינת שני microliters של כל מדגם על ג'ל חלבון זגוך ארבעה עד 12% במשך 35 דקות של אלקטרופורזה ג'ל על קרח ב 200 וולט. בסוף הריצה, לשטוף את הג'ל עם שלושה חילופי מים על שייקר לפחות 10 דקות לכל לשטוף, ואחריו חומצת גרעין מכתים עם צבע ציאנין במשך 15 דקות.
דמיין את הג'ל במערכת הדמיית ג'ל מתאימה, והכתים שוב את הג'ל עם 20 מיליליטר של כחול קומאסי. לאחר שעה, דה כתם עם מים מזוקקים כפולים לפחות שעה אחת לפני הדמיה הג'ל שוב. לטיהור SNAP T7 הקשור לאוליגונוקלאוטיד, ראשית, הכינו חיץ חצץ אלוטציה על ידי ערבוב 50 מיקרוליטרים של עקבות טוחנת אחת, עם 100 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן, עם 850 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים.
לאחר מכן, מקם עמודת חילופי יונים אחת לכל דגימה לצינורות צנטריפוגה בודדים של שני מיליליטר, ושטוף את העמודים עם מאגר טיהור על ידי צנטריפוגה עד שכל המאגר נפרץ מכל עמודה. לדלל כל דגימה עם מאגר טיהור במאגר טיהור של שלושה לאחד ליחס מדגם, ולטעון 400 מיקרוליטרים של מדגם לכל עמודה. כאשר כל המאגר נפרץ כפי שהודגם, לאסוף ולתייג את הזרימה דרך עבור כל מדגם.
לשטוף את העמודים שלוש פעמים עם 400 microliters של חוצץ טיהור לכל לשטוף עד כל המאגר כבר eluted לכל לשטוף, איסוף ותיוג הזרימה דרך לפי הצורך. לאחר הכביסה האחרונה, לאסוף את החלבון eluted על ידי הוספת 50 microliters של חוצץ elution למרכז העמודה, ו centrifuging את העמודה שלוש פעמים עד כל 50 microliters של חוצץ כבר eluted. לאסוף ולתייג את חמקן לאחר כל צנטריפוגה, לאגד את חמקן לתוך צינור יחיד לאחר centrifugation האחרון, תוך השארת נפח קטן של כל לחמוק לניתוח ג'ל.
למדוד את הספיגה של aliquots האלוט הנותרים ב 260 ו 280 ננומטר, ולהוסיף גליצריל לדגימות ביחס של אחד לאחד עבור מינוס 20 מעלות אחסון עד השימוש בהם. השתמש ביחידת מסנן צנטרילית 500 מיקרוליטר 30 קילודלטון כדי לאגור את המוצר האלוט הכולל עם מאגר אחסון 2x. ולמדוד את הספיגה כפי שהודגם.
לאחר מכן להוסיף גליסול למוצר ביחס של אחד לאחד עבור מינוס 20 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להעריך את האלוטות על ידי SDS-PAGE, הפעל את הדגימות בסולם חלבונים מתאים על ג'ל זגמי 4 עד 12% למשך 35 דקות ב 200 וולט, או עד שחזית הצבע נודדת לסוף הג'ל. כדי להדגים את פעילות הבקרה לפי דרישה של הרנ"פ קשור, מערבבים 2.4 מיקרוליטרים של כל תבנית עם חמישה מיקרוליטרים של חישול פי 5, ו-14.2 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים.
לדגור על כלוב DNA כפול תקוע מיקרומולרי אחד ב 75 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. ותבנית ה-DNA של האפטאמר הירוק של האמר המקדם והמלצ'יט באותו אופן כמו המצוין בטבלה. בסוף הדגירה, הוסף את SNAP T7 RNAP קשור לכלוב ה- DNA התקוע הכפול ביחס טוחנת אחת עד חמש לריכוז סופי של RNAP ננומולרי 500.
לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימה על קרח, ומערבבים 2.5 מיקרוליטרים של 10x במאגר תמלול במבחנה עם מיקרוליטר אחד של 25 מילימולרי ריבונוקלאוזיד טריפוספט, מיקרוליטר אחד של ירוק מלאכיט מילימולרי אחד, 2.5 מיקרוליטרים של תערובת כלוב RNAP, 2.5 מיקרוליטרים כל אחד מגורמי שעתוק מיקרומולרי אחד A ו- B oligonucleotides גדילים, ושלושה מיקרוליטרים של תבנית אפטאמר ירוקה מילימילילית אחת ב-10 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים. ב 15 microliters של מים מזוקקים כפולים, להגדיר תגובה שנייה המכילה 2.5 microliters של 10x במאגר תמלול במבחנה, microliter אחד של 25 מילימילימטרים ריבונוקלאוזיד טריפוספט, מיקרוליטר אחד של מילימטר אחד ירוק מלכיט, 2.5 microliters של תערובת כלוב RNAP, ושלושה microliters של תבנית aptamer ירוק malachite מילימולר. כדי להגדיר תגובה המכילה חוצץ בלבד, לערבב 2.5 microliters של 10x במאגר תמלול במבחנה, מיקרוליטר אחד של תערובת טריפוספט ריבונוקלאוזיד 25 מילימולר, מיקרוליטר אחד של ירוק מלאכיט מילימטרי אחד, ושלושה מיקרוליטרים של תבנית aptamer ירוק מלאכיט מילימילימטר אחד ב 17.5 microliters של מים מזוקקים כפולים.
כאשר כל התגובות הוכנו, העבר כל תגובה ללוח 384 באר, ונטר את תמלול האפטאמר הירוק המלכי על קורא לוחות פלואורסצנטי במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס ב 610 ננומטר עירור, ופליטת 655 ננומטר. בסוף הקריאה, מניחים את הצלחת על קרח, ומפעילים את מוצר ה-RNA מכל באר בג'ל פוליאקרילי 12%TBE-אוריאה ב-70 מעלות צלזיוס TBE חוצץ ב-280 וולט למשך 20 דקות, או עד שחזית הצבע מגיעה לסוף הג'ל. לאחר מכן, להכתים את הג'ל עם כתם חומצת גרעין צבע ציאנין במשך 10 דקות על שייקר מסלולית, לפני הדמיה כפי שהודגם.
ביטוי מוצלח וטיהור של חלבון SNAP T7 RNAP רקומביננטי ניתן לאשר באמצעות SDS-PAGE. לאחר SDS-PAGE, הפעילות אנזימטית יכולה להיות מאומתת על ידי תגובת תמלול במבחנה. צימוד מוצלח של אוליגונוקלאוטידים פונקציונליים BG ניתן לאמת באמצעות 18%denaturing TBE-urea PAGE.
בהשוואה לאוליגונוקלאוטיד שלא שודר, התוספת של ה- BG moiety לאוליגונוקלאוטיד מגדילה את משקלו המולקולרי. כפי שנצפה זה ג'ל כתם ציאנין מייצג כדי לאשר טיהור T7 RNAP קשור DNA מעודף BG אוליגונוקלאוטידים, הזרימה הראשונית דרך שבר הכיל בעיקר עודף BG אוליגונוקלאוטיד, כמו גם חלק קטן של פולימראז הקשור ל- DNA כי לא נקשר שרף חילופי cation. שברי דילול הבריכה הכילו רק את הרצועה היחידה של אוליגו RNAP הנגרמת על ידי צבע ציאנין המחייב את חבל האוליגונוקלאוטיד, כאשר נתיב המוצר המרוכז מציג את אותו הדבר, אך רצועת כהה יותר המסמלת ריכוז גבוה מוצלח.
אותם דפוסים נצפים על ידי כתמים כחולים Coomassie, עם שינוי ניידות ג'ל קטן נצפתה בקרת RNAP לא מצומד. כאן, אות פלואורסצנטי המיוצר בסוף תמלול במבחנה בקינטיקה בזמן אמת מוצגים. בניתוח זה נצפתה הפעלה של פי 336 באות פלואורסצנטיות, המדגימה שליטה חזקה בפעילות הפולימראז.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לשטוף ביסודיות SDS את הג'ל לפני כתמי חומצת גרעין. הסיבה לכך היא STS יהיה ללכוד את הצבע בג'ל, וכתוצאה מכך אות רקע גבוה. החלת השיטה שלנו על מעגל גנים גדול עם מפלים מרובים תראה את המדרגיות ואת קומפוזיציה של מערכת שעתוק קשור.
טכניקה זו משמשת כיום לפיתוח מעגלי גנים המסוגלים לחישוב בסגנון רשת עצבית.
