Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

MG נתמך על ידי מענקים K08DK101608 ו- R03DK111473 חולים מכוני הבריאות הלאומיים, מרץ של מטבעות קרן מענק מס 5-FY17-79, הילדים גילוי מכון וושינגטון אוניברסיטת וילדים בסנט לואיס, המחלקה לרפואת ילדים בבית באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה, סנט לואיס. האירו נתמך על-ידי R01DK104946 (PI: סילברמן), סנט לואיס לילדים ואוניברסיטת גילוי מכון וושינגטון של הילדים החולים.

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על-ידי גם אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס אכפת חיה מוסדיים, שימוש הוועדה (פרוטוקול 20160187) או טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פיטסבורג, שימוש הוועדה (פרוטוקול 14103918). המעי הדק העובר האנושי-פחות מ 24 שבועות ההיריון הושג בהתאם להנחיות רכש באוניברסיטת פיטסבורג רקמות אנטומיים לאחר אישור ועדה מוסדית (פרוטוקול PRO14100537) מאוניברסיטת פיטסבורג בריאות מדעי בנק עור דרך מערכת מתווכת הוגנת. חלב אם אנושי בטל מזוהה או חלב מפוסטר התורם הושג עם ויתור על הסכמה מן האוניברסיטה של הועד המוסדי פיטסבורג.
1. קריפטה בידוד והקמת Enteroids עכברים Neonatal או המעי הדק האנושי מוקדמת
<ol><li>הכנה מדיה הערה: המדיה צריך להיות מוכן בשכונה ביום שלפני קריפטה בידוד.<ol>
<li>להכין 1.11 L תרבות המדיה. מתחילים עם 1 ליטר בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין ולהוסיף 110 מ ל סרום שור עוברית (FBS) (הריכוז הסופי 10%), 11 mL אינסולין סטרילי, פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 1.1 mL (סופי בריכוז 0.1%).</li>
		<li>להכין תערובת PBS-אנטיביוטיקה 500 מ"ל. מתחילים עם 500 מ ל 1 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 10% FBS ולהוסיף 5 מ"ל גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), ו- 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%).</li>
		<li>הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #1. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. תוסיף 600 µL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (הריכוז הסופי 10 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).</li>
		<li>הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. להוסיף 300 EDTA 0.5 M µL (ריכוז סופי 5 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).</li>
		<li>להכין 50 מ ל קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. למדוד 33.4 מ ל 1 x מתקדם DMEM/F-12 ולהוסיף 10 מ"ל FBS (ריכוז סופי 20%).<ol>
<li>להוסיף 500 µL פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), 500 µL L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), 500 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), 2.5 µL N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane מ' 1 חומצה sulfonic (HEPES) (ריכוז סופי מ מ 0.05), 500 µL 100 מ מ N-אסטילסיסטיין (ריכוז סופי 1 מ מ), 500 µL 100 x N-2 תוספת 1 מ"ל 50 x תוספת ללא סרום (למשל, B-27) פחות ויטמין A, 500 µL 1 מ מ 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין 1 מ"ל קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה. קודם להכין 1 מ"ל של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. להוסיף 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a (ריכוז סופי 100 ng/mL), 1 µL µg 100/mL הראש (ריכוז סופי 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (ריכוז סופי 500 ng/mL) ו- 0.5 µL 100 µg/mL EGF (ריכוז סופי 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>קריפטה בידוד
	<ol>
<li>המקום solubilized תמצית קרום המרתף (ראה טבלה של חומרים) על הקרח להפשיר לפני תחילתו. הערה: קרום המרתף לשמור על הקרח או שזה פולימריזציה.</li>
		<li>בהתאם בפרוטוקול אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש עבור עכברים גדול מ- 14 ימים של גיל, המתת חסד עכברים עם שתי שיטות של המתת חסד עם השני להיות הליך פיזי כדי להבטיח מוות. הערה: עבור עכברים מתחת לגיל 14 ימים של גיל, עריפת ראש זה הליך רגיל באמצעות מספריים.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים ומספריים, עושים חתך אנכי למטה האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, עבור לכל אורכה של הבטן. בלו המעי הדק מהקיבה אל המעי עם מספריים ולהסיר את מצע המעי עם מלקחיים. הערה: בת שבוע שני זכר ונקבה C57BL/6J העכבר הגורים, כל גרם במשקל 5.5-7, שימשו לבידוד הקריפטה. ניתן להשתמש בכל גיל או גודל העכבר לבידוד הקריפטה.</li>
		<li>כדי להתכונן המעי הדק שנקטפו זה עתה קריפטה בידוד, מיקום המעי ישר, וחותכים את המעי longitudinally לכל אורכו באמצעות מספריים. הערה: העכבר והמעי האנושי ניתן להכין באופן דומה.</li>
		<li>שרפרף נקי מחוץ המעי ע י ניעור בעדינות המעי הלוך בצלוחית מלא PBS-אנטיביוטיקה תערובת באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>להוסיף 30 מ של התא שיבוש התקשורת #1 צינור חרוטי 50 מ. לחתוך את המעי לחתיכות באורך 0.5 ס מ ישירות לתוך הצינור. הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.</li>
		<li>בעוד הרקמות על ניעור, להשיג לוחות 24 או 48-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור ה-RNA, דנ א או בידוד חלבון. שימוש שקופיות הקאמרית 8-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור כל הר הדמיה קונפוקלי.</li>
		<li>בשכונה, להוסיף µL 15 של קרום המרתף כל הבאר של צלחת 24 או 48-ובכן. אם משתמש קאמרית שקופיות, להוסיף µL 9 של קרום המרתף לתחתית של כל תא. הערה: להתאים את עוצמת הקול של קרום המרתף בהתאם לגודל צלחת במידת הצורך.</li>
		<li>התפשטה במהירות קרום המרתף עם קצה פיפטה כך קרום המרתף יוצר שכבה דקה בתחתית הבאר. מקם את הצלחת ב 37 ° C בחממה במשך 30 דקות לאפשר קרום המרתף פולימריזציה. הערה: כוכים לא מייחסים אם קרום המרתף לא שכבה דקה או אם קרום המרתף מכיל בועות אוויר.</li>
		<li>לאחר 15 דקות על מטרף, לסנן את הרקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. למחוק את הזרימה.</li>
		<li>להוסיף 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2 צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור.</li>
		<li>הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.</li>
		<li>לאחר 15 דקות על ניעור, לסנן רקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. תמשיך לזרום דרך בשלב זה, למקרה תשואה נמוכה בשלבים מאוחר יותר. הערה: כל זרימה דרך צינורות חייב להישמר בקירור.</li>
		<li>להוסיף 15 מ"ל DMEM עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור. נמרצות לנער את הצינורית ביד עבור מסנן ס' 10 דרך מסננת 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה. חזור עד הזרימה מכיל חלקיקים אין.</li>
		<li>בשכונה, לסנן את הזרימה מהשלב הקודם לתוך חדש 50 מ ל חרוט צינור באמצעות מיקרומטר 70 strainers העכבר רקמות או strainers 100 מיקרומטר עבור רקמה אנושית. הערה: יש נוספת strainers בכוננות, שופכים לאט כמו strainers יסתום עם פסולת.</li>
		<li>Centrifuge את הצינור ב- g 200 x עבור 8 דקות 4 ° C ובמקום ישירות בתוך דלי קרח בשכונה. להסיר את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה מבלי להפריע בגדר. Resuspend גלולה עם הסכום הרצוי של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. הערה: כוכים מועשר הם השכבה 'חולית' של בגדר. כל טוב דורשת 250 µL של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.</li>
	</ol></li>
	<li>הקמת enteroids
	<ol>
<li>צלחת את התערובת התקשורת התת-קרקעי ישירות על קרום המרתף.</li>
		<li>בדוק כוכים עם מיקרוסקופ כדי להבטיח בתהליך בידוד היה מוצלח. הערה: כדורים של תאים והתאים הם הרצויה. כ-100 כוכים בודדים הם מצופה לכל טוב.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לאפשר כוכים לדבוק קרום המרתף. הערה: הדגירה הזה הוא עם הקריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.</li>
		<li>אט-אט להסיר את התקשורת עודף כוכים נכשל לצרף באמצעות פיפטה P-200. הערה: נא לא להפריע קרום המרתף כפי יכול להפוך ניתק את כוכים המצורפת.</li>
		<li>לאט לאט להוסיף 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה כל טוב. הערה: עבור 24-, צלחות 48-ובכן, או חדר שקופיות, 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה מספיקה.</li>
		<li>להחליף את המדיה כל יומיים עם טרי קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 5 ימים לפני טיפולים כדי לאפשר החזקה אופטימלית וצמיחה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. העכבר השד חלב אוסף
<ol><li>להפריד סכר C57BL/6J מניקות לאחר לידה 7-12 ימים הגורים שלה במשך 6 שעות לפני חליבה.</li>
	<li>עזים ומתנגד הסכר מניקות עם איזופלוריין באמצעות קונוס האף ולפקח זריקה תת עורית של אוקסיטוצין-0.15 IU/ק"ג משקל גוף. להמתין 3 דקות לפני מנסה לחלוב את ההליך.</li>
	<li>לנקות עטינים עם 70% אתנול לפני חליבה הליך ותנו יבש.</li>
	<li>שואבים חלב עטינים של אחד בכל פעם באמצעות משאבת השד אנושי חשמלי עם צינורות סיליקון בגודל שיתאים עטינים של העכבר לתוך צינור אוסף 5 מ. הערה: משאבות לשדיים אופטימלי יש שתי הגדרות, עבור מהירות ועוד אחד בשביל שאיבה. עדיף להתחיל עם ההגדרות הנמוך של כל אחד ולהגדיל שניהם לאט עד החלב מופק. באופן אידיאלי, התשואה הכולל יהיה ~ µL 500 - 1 מ"ל חלב אם העכבר לכל סכר מניקות.</li>
	<li>חלב אם מיד aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: להימנע ההקפאה/ההפשרה מחזורים.</li>
	<li>לטפל enteroids ביום 5 עם µL 50/מ"ל חלב אם העכבר לכל mL קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. כל הר צביעה של Enteroids
<ol><li>
הכנה של ריאגנטים
	<ol>
<li>להכין PBS 1 x 16 מ"ל לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS x 1 לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 24 mL PBS Tween (PBST הוא 0.1% Tween 20 x 1 ב PBS) לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 10% חמור נורמלית בסרום (NDS) ב- 0.1% PBST (10% NDS/PBST) לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 4 מ ל 1% NDS ב- 0.1% PBST (1% NDS/PBST) לכל 8 בארות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 1
	<ol>
<li>וארוקן את טיפולי ולשטוף enteroids עם PBS. הוסף 250 µL 4% מחברים לכל טוב. מניחים על מסובב עבור h 1-2-4 מעלות צלזיוס. להסיר 4% מחברים עם פיפטה.</li>
		<li>תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: זה אפשרי לאחסון צלחת ימים 1-2-4 ° C, במידת הצורך.</li>
		<li>להוסיף 250 µL/טוב 0.1% טריטון X-100. תקופת דגירה של h 1 הסר RT. 0.1% טריטון X-100 עם פיפטה.</li>
		<li>תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב למשך 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>מוסיפים 250 µL/טוב 10% NDS/PBST. תקופת דגירה של 45 min-הסר RT. 10% NDS/PBST עם פיפטה.</li>
		<li>להוסיף 250 נוגדן ראשוני µL/טוב, מדולל 1/250 ב 1% NDS/PBST, וכן דגירה בין לילה ב 4 º C. הערה: דילול נוגדן האופטימלי משתנה בהתאם ליצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 2
	<ol>
<li>רחץ לפחות 5 פעמים במשך 4-5 קמ"ש עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב ב 4 ° C בין כל כביסה.</li>
		<li>מוסיפים נוגדן µL/טוב משני 250, מדולל 1/1000 ב 1% NDS/PBST. לעטוף את הצלחת בנייר, דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 3
	<ol>
<li>להוסיף גרעיני µL/טוב 250 כתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) למשך 15 דקות. הערה: להחזיק את הצלחת בחשכה.</li>
		<li>לשטוף 6 פעמים עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב 10 דקות ב 4 ° C בין כל כביסה.</li>
		<li>הר coverslip-הקאמרית שקופיות עם טעינת מדיה.</li>
		<li>תמונות עם 40 X מיקרוסקופ קונפוקלי אובייקטיבית ועיבוד באותה מידה בעורך גרפיקה רסטר (ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li><li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotising+enterocolitis.">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li><li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li><li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States:+a+pediatric+cost+analysis.">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li><li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants.">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis.">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium.">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li><li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling.">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis,+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants.">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats.">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+2'-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine.">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li><li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats.">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li><li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells.">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li><li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant.">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li><li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat.">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li><li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+collecting+milk+from+mice.">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li><li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves'+muntjac+deer.">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

המחברים אין מה לגלות שאין ניגודי אינטרסים.

האפיתל במעי מורכב יחוברו הסלולר רבים אחראים למתן מארח הגנה מפני פתוגנים, שמירה על שלמות מחסום המעיים, ואני יכול להפרץ בפתוגנזה של כמה מחלות. בעוד מודלים בעלי חיים יכולים לסכם כמה היבטים של המחלה, הדגם ex-vivo של enteroids נגזר מן המעי הדק בעכברים ובבני אדם מספק פלטפורמה כדי לבדוק את ההשפעות של...

דלקת מעי נמקית (NEC) הוא הגורם המוביל למוות ממחלות במערכת העיכול אצל פגים, להשפיע על כמעט 1 ב 10 תינוקות שנולדו לפני 29 שבועות ההיריון1,2,3. חצי של התינוקות עם התקדמות NEC הצורה החמורה ביותר, איפה הישרדות 10-30% רק4,5. בארצות הברית, 2-3 מיליארד USD/שנה משוערת מושקעים בטיפול בתינוקות עם NEC6,7, עדיין לא שיעור ההישרדות ולא טיפול השתנה במשך 30 השנים האחרונות. בפתוגנזה של NEC מאופיין על ידי פגיעה במעיים, ליקויי הרירית המרפא8,9,10,11, עם זאת, המסלולים איתות המובילים החמירה תגובה דלקתית ומנגנונים כדי להפוך את הדלקת נשארים שהיישום מובן.
הממשל של חלב אם אנושי נמצאה להיות האסטרטגיה רק מגן נגד NEC בפגים. אנחנו הראו בעבר כי חלב אם מגן מפני התפתחות NEC באמצעות עיכוב של הקולטן אגרה דמוי קולטן החיסון מולדים 4 (TLR4) של האפיתל במעי באמצעות הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) איתות לשביל11. תוספת של חלב האם על נוסחת NEC ניסיוני attenuated את התגובה דלקתית אצל NEC כפי שמתואר על ידי עיכוב של אפופטוזיס enterocyte ושיקום של התפשטות enterocyte באופן הייתה תלויה גדילה עוריות פקטור (EGF) ו- EGFR11. במחקר אחר, זה הוצג כי טונות, רכיב אחר של חלב אם, תורמת טבעה מגן על ידי להתכוונן זלוף מעיים, לעומת פורמולה, אשר לוקה בחסר חנקתי, עשוי לתרום שכיחות מוגברת של NEC ב הנוסחה האכלת תינוקות12,13. תרכובות אחרות נוכח חלב אם הוכחו להיות מעורב ההגנה נגד NEC כוללים oligosaccharides חלב, L-ארגנין, גלוטמין, לקטופרין14,15,16, 17,18,19. רכיבים אלה מועילות של חלב האם לחשוף את נחיצות השימוש במניעה של NEC, אך גם להדגיש את החשיבות של לימוד המנגנון, איתות המסלולים ואפקטים הסלולר מעורבים כמה חלב היא תיווכה את ההגנה נגד NEC .
סדר כדי להמשיך לחקור תכונות ההגנה של חלב אם במודל של עכברים של NEC, פיתחנו שיטה חדשנית, קל לשימוש על ידי העכבר איזה חלב אם יכול להיות מופק של סכר anesthetized באמצעות חשמל בשד האנושי משאבת11,12 . אסטרטגיה זו של רכישת חלב אם העכבר הוא יתרון, לא רק כי הם השד אנושי משאבות זמינות ולא יעילה על הרכש של חלב אם, אלא גם כי שיטה זו מאפשרת ניתוח חלב השד ספציפית. כתוצאה מכך, אנו יכולים להשוות את ההשפעות של חלב אם העכבר עם אלה של חלב אם אנושי ביטוי כמו גם מפוסטר חלב האדם תורם מבנק חלב במודלים תלויי מין. טכניקה זו מאפשרת לצורך המחקר של רכיבי חלב השד ביחס התרומה שלהם כלפי מניעת NEC. חוקרים אחרים פיתחו שיטות שאיבת חלב השד, לעומת זאת, שיטות אלה נמצאים ידנית, מצריכים בדרך כלל אחד או יותר מעבדה חבר21,20,22. כאן מוצגת טכניקת קל זה יכול להיות מנוצל על ידי שינוי משאבה השד חשמלי אנושי לאסוף חלב מן העכבר. טכניקה זו ניתן להחיל גם למינים אחרים.
לחקור בצורה הולמת את איתות המסלולים מעורב עם NEC, דגם מערכות נדרשים להעריך את כל סוגי תאים שונים ידוע להיות מושפע מתהליך המחלה. כאן נדון אחד כזה מערכת מודל - enteroids - ואת הקמתן של העכבר והמעי הדק אנושי. Enteroids מעיים אנושיים (HIEs) לספק בפרט משמעותי ההבטחה, כי הם מציעים חדשני, מגוונת מבחינה גנטית שמחוץ האנושי מודל לסייע בחקר התהליכים הקשורים pathophysiological המתרחשים במערכת העיכול 23. Enteroids יש כבר מצאו להיות תרבותי לטווח ארוך שיכול להיות קפוא עבור שימוש מאוחר יותר23ו בניגוד האנושי Organoids מעיים (HIOs), אשר תרבויות מפותחות מתאי גזע inducible pluripotent, enteroids נוצרות מתאי גזע בתוך כוכים מעיים מבודד24. Enteroids דורשים תחזוקה פחותה, יכול להיות נגוע במהירות25, ניתן ליצור בקלות מאז כוכים מעיים מובדלים יותר מאשר HIOs23. לכן, HIEs מציעים יתרונות רבים על פני שיטות קיימות כי לפיתוח שהפגינו ספציפיים לאזור ההלחנה ופונקציונליים מאפייני האפיתל אנוש במערכת העיכול23. השימוש enteroids הוא בחירה יעילה ביותר כאשר צריך מודל אנושי של המעי, עם הדבקות ספציפיים לאזור מגבלות וחוסר נוחות השימוש. כאן אנחנו מדגימים את הטכניקה של בידוד ושמירה על ראשי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids עכברים, בפגים אנושי.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

אדם קטן enteroids מעיים הם נגזרת של כוכים ומכילים כאשר גדל בגומחת תאי גזע כל סוגי תאים אפיתל. ויכולת ליצור אנושי enteroid ex-vivo תרבות מערכות חשובות פתופסיולוגיה מעיים דגם וכדי ללמוד את התגובות הסלולר מסוים מעורב. בשנים האחרונות, enteroids מן בעכברים ובבני אדם להיות מתורבתים, passaged, שהופקד משם לשימוש עתידי במעבדות מספר ברחבי העולם. הפלטפורמה enteroid יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים ותרופות שונות ואת מה ההשפעות הן המופעל על סוגי תאים שונים במעי. . הנה, פרוטוקול להקמת העיקרי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids נגזר עכברים neonatal, מוקדמת במעי האדם הינו מסופק. יתר על כן, מערכת תרבות זו enteroid היה מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של חלב אם ספציפית. חלב אם העכבר ניתן להשיג ביעילות באמצעות משאבה בשד האנושי שונה, ניתן להשתמש בעכבר ביטוי חלב לניסויים מחקר נוסף. כעת נדגים את ההשפעות של העכבר ביטוי, אנושי, התורם חלב על הגדילה ועל התפשטות enteroids נגזר neonatal עכברים או המעי הדק האנושי מוקדמת.

תחילה חיפשנו לחקור אם הביע האדם חלב או חלב מפוסטר התורם היה השפעה על enteroids במעיים קטן. אכן, חלב אם אנושי, התורם חלב מוגברת הצמיחה של העכבר neonatal (איור 1 א'), enteroids מוקדמת האדם נגזרת (איור 1B).
מאז חלב אם אנושי מוגבר...

Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת התרבות enteroid העכבר neonatal או מוקדמת במעי האדם, כמו גם שיטה יעילה כדי לאסוף חלב עכברים.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K Views.  Washington University School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת התרבות enteroid העכבר neonatal או מוקדמת במעי האדם, כמו גם שיטה יעילה כדי לאסוף חלב עכברים.

Video: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Bioengineering

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Cancer Research

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Developmental Biology

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biology

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...