פרוטוקול זה יכול לשמש ולפתח עוד יותר כדי לנתח כיצד קרינה מייננת משפיעה על גיוס תאים סרטניים, מה שמוביל להבנה טובה יותר של הישנות סרטן. אורגנואידים ממאריים הם מודלים רבי עוצמה. הם מחקים מאפיינים בסיסיים של vivo, אך הם מאפשרים בידוד קל של משתנים ביולוגיים.
השימוש בצלחות הידבקות נמוכות שולל אתגרי זרימת העבודה הקשורים למטריס חלבונים. חולי סרטן שד משולש שלילי חווים הישנות אזורית מקומית בשיעורים גבוהים יותר לאחר הטיפול. לימוד האופן שבו קרינה משפיעה על התנהגות הגידולים ותאי החיסון יוביל לתובנות חשובות על מנגנוני הישנות.
הפגנת מיקרוסקופיה קונפוקרטית של האורגנואידים היא חוויאר גומז, סטודנט לתואר שני במעבדת סילברה בטיסטה. התחל הליך זה עם הסרת בלוטות החלב בטן ו inguinal מעכברים הקריבו כמפורט בפרוטוקול הטקסט. 45 דקות לאחר הקרנת הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מניחים בלוטות החלב בצלחת תאים סטריליים 35 מ"מ וטחון עם אזמלים.
טחון עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיעה חתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר מאשר כ מילימטר מרובע אחד באזור. עכשיו להעביר את הרקמה לתסמת קולגן בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. השתמש 10 מיליליטר של פתרון קולגן לכל עכבר.
מניחים את צינורות המדגם באמבט מים במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מערבולת במשך חמש שניות כל 10 דקות. העיכול הושלם כאשר פתרון הקולגנס מעונן. סובבו את הפתרון המתעכל ב-450 פעמים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
עכשיו נצפו שלוש שכבות. העל-טבעי מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מים, והתחתית היא גלולה. גלולה מופיע אדום, כפי שהוא תערובת של תאי אפיתל, תאים בודדים stromal, ותאי דם אדומים.
יש לציפוי מראש של כל הפיפטות, טיפים לפיפט וצינורות צנטריפוגה עם פתרון BSA לפני המגע על ידי הוספה והסרה של פתרון BSA. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, אם כי יש לסנן אותו באופן סטרילי לפני כל ניסוי. להתאוששות נוספת, מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי מצופה BSA של 15 מיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר את שכבת השומן. צנטריפוגה המדגם ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאף את supernatant, משאיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי למנוע שאף את גלולת התא.
עכשיו שאף את השכבה המים מהצינור עם גלולה המקורית. מוסיפים 10 מיליליטר של DMEM/F12 לצינור עם גלולה המקורית, ומעבירים לצינור השני. פיפטה במרץ לשלב ולתלות מחדש את שני כדורי.
לאחר צנטריפוגה ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את העל-טבעי והוסיפו ארבעה מיליליטר של DMEM/F12 לצינור. מוסיפים 40 מיקרוליטרים של deoxyribonuclease להשעיה בעדינות ללחוץ ביד במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף שישה מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות.
לאחר צנטריפוגה הצינור ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאף את העל-טבעי לסימן 0.5 מיליליטר. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות. עכשיו צנטריפוגה הצינור על ידי פועם ל450 פעמים G ועצירת ארבע שניות לאחר שהגיע למהירות ש.
חזור על שלבי הכביסה שלוש פעמים נוספות כדי לטהר אורגנואידים באמצעות התברואה צנטריפוגלית. גלולה צריך עכשיו להיות צבע לבן המורכב רק אורגנואידים אפיתל. תן שימוש חוזר לכדור ב-10 מיליליטר של DMEM/F12.
פיפטה ביסודיות כדי ליצור פתרון הומוגני. מעבירים 50 מיקרוליטרים לצלחת פטרי 30 מ"מ ותצוגה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב 20X. לספור את מספר האורגנואידים עם מונה ספירה.
פיפטה 50 מיקרוליטרים של אורגנואידים לתוך כל באר של צלחת הידבקות נמוכה. הוסף 150 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל-200 מיקרוליטרים. בזהירות להחליף את המדיום כל יומיים.
שמור על מקרופאגים גולמיים בעלי תווית GFP או D-tomato 264.7 במדיה DMEM בתוספת 10%FPS ו- 1%פניצילין-סטרפטומיצין. זרע את התאים לתוך המדיום האורגנואידי בצפיפות הרצויה. השתמש בניגודיות פאזה של תאים חיים ובהדמיה פלואורסצנטית כדי לפקח על חדירת מקרופאג' לאורך זמן.
הסר מדיום אורגנואיד מה בארות על ידי שאספירה בזהירות. תקן את הדגימות עם פורמלין עם 10%-חיץ ניטרלי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את האורגנואידים קבוע שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS.
אם תרצה, דגימות קבועות ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד עבור כתמים נוספים. לאחר שטיפה, לחלחל אורגנואידים קבוע במשך חמש דקות. חסום את האורגנואידים הקבועים עם סרום עיזים רגיל של 5% ב- PBST של 0.1% למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני שטיפה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
הדגירה אורגנואידים קבועים עם אנטי ציטוקראטין-14, E-cadherin, או חלבון צומת הדוק אחד, ב 1% NGS ב PBST במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות PBST. עכשיו להדק את האורגנואידים עם נוגדן משני נגד ארנב עזים עם 1% NGS PBST במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
מכסים בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר שטיפה כבעבר, השתמש בצבע הגרעיני כדי להכתים גרעינים במשך כחצי שעה. לשטוף את האורגנואידים מוכתמים במשך חמש דקות PBS שלוש פעמים.
אם אתה משתמש בשקופית תא, תמוקם עם פתק כיסוי. לאחסן את האורגנואידים עטופים בנייר כסף בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. אורגנואידים מוקרנים יכולים להיות מתורבתים בצלחות הידבקות נמוכות, או בתוך קרום המרתף, אבל הצמיחה המהירה ביותר התרחשה בצלחות הידבקות נמוכה.
אורגנואידים סותמים מחדש את מאפייני בלוטת החלב. מבנים הדומים מורפולוגית לתעלות ולאונות נצפו. מגמות הצמיחה הצביעו על כך שכאשר אורגנואידים נזרעו מיד לאחר העיכול והמיון, אורגנואידים שאינם מוקרנים גדלו מהר יותר מאשר אורגנואידים מוקרנים, ככל הנראה עקב מעצר צמיחת תאים כתוצאה ממנגנונים של תיקון נזק לדנ"א.
אורגנואידים הביעו מאפייני אפיתל, אשר הוערכו באמצעות כתמים immunofluorescent. אורגנואידים מוקרנים הביעו סמני אפיתל. ציטוקרטין-14, סמן של מיופיתליום, בא לידי ביטוי בחוזקה על פני השטח של אורגנואידים מוקרנים.
בנוסף, E-cadherin וחלבון צומת הדוק אחד באו לידי ביטוי בתוך צמתים הסלולר של אורגנואידים. חלבונים אלה חיוניים להיתוך התא הנכון. לאחר ההקרנה, אורגנואידים המשיכו לשמור על מאפייני האפיתל שלהם.
כתמים פלואורסצנטיים של אורגנואידים יכולים להיות חזותיים בתוך צלחות הידבקות נמוכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. עם זאת, ההדמיה הברורה ביותר הושגה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת תוקנה חושבה על ידי חיסור הרקע, ונורמליזציה לפי אזור אורגנואיד.
גידול אורגנואידים בצלחות הידבקות נמוכה של 96 בארות גם פישט את הניסויים בתרבות ה-Co. כאשר זרע בריכוזים אופייניים בלוטת החלב, קולוקליזציה מקרופאג גדל עם אורגנואידים מוקרנים. בעת ביצוע הליך זה, הדברים החשובים ביותר שיש לזכור הם לא לעכל יתר על כן את האורגנואידים, ולטהר כראוי את ההתברמות הצנטריפוגלית.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים בתרבות השיתוף. אורגנואידים יכולים להיות מתורבתים במשותף עם תאים סרטניים, תאים חיסוניים אחרים, ותאים סטרומה כדי לשחזר את microenvironment מוקרן הקשורים הישנות. שיטה זו תהיה חשובה להערכת האופן שבו נזק לרקמות נורמלי משפיע באופן ספציפי על הדינמיקה של תאי החיסון, ובסופו של דבר ישמש להבנת מנגנוני גיוס תאים סרטניים.
אורגנואידים החלב יש מנגנונים מובהרים של התפתחות בלוטת החלב, יש מחדש חזק סרטן השד במבחנה. אנו מקווים כי המודל שלנו מספק תובנות על גיוס תאים סרטניים הנגרמים על ידי קרינה.
