פרוטוקול זה שימושי עבור בידוד enteroid בתרבות בנוסף לחקירת התפשטות התא ואת ההישרדות enteroids. מדענים יכולים ליישם טכניקה זו על enteroids תרבות וללמוד את ההשפעה של תרופות ציטוקינות דלקתיות על תאי אפיתל המעי במבחנה. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול במים של מחלות מעי דלקתיות.
אנו מיישמים שיטה זו כדי למצוא כמה ציטוקינות טיפוליות. שיטה זו מספקת תובנות על התפשטות אפיתל המעי והישרדות;בנוסף זה עשוי לשמש גם אורגנואידים, מתורבת סביב רקמות אחרות מאשר המעי. כדי לבודד קריפטות מעיים ולבצע תרבות enteroid, להשתמש במטלות רקמות ולמצוא מספריים איריס לנתח כשמונה סנטימטרים של ileum מעכבר בר בן שמונה שבועות המתת דם.
השתמש מזרק עם מחט האכלה gavage לשטוף את ileum עם כ 40 מיליליטר של קרח קר פוספט-Buffered מלוחים, ואז לחתוך לאורך עם מספריים ולפתוח את ileum. חותכים את האיליום לחתיכות קטנות ומ מניחים אותם לחמישה מיליליטר של DPBS קר כקרח סטרילי בצינור חרוט 15 מיליליטר. ואז לנענע את הדגימה במשך חמש דקות על קרח.
השתמש בבקר פיפטה כדי לשאפת את ה- DPBS ולהחליף אותו ב- 10 מיליליטר של מאגר קר אחד. לאחר נדנדה במשך 30 דקות על קרח, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשווסף חיץ אחד ולהחליף עם 10 מיליליטר של חיץ קר 2. לאחר מכן יש ללחוץ במשך 2-3 דקות ביד בערך 80 שייק לדקה.
לאחר רעידות, לבדוק טיפה עשרים מיקרו ליטר של חיץ שני תוכן תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שיש קריפטות עם תאים פאנית פרטניים. סנן מאגר שני תכנים עם מסננת תאים סטריליים של 70 מיקרון ואאסוף את המאגר המסונן בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. פיפטה 20 מיקרוליטרים של סינון על השקופית כדי לספור את הקריפטות.
העבר נפח מספיק של המאגר המסונן שני תכנים כדי להבטיח כי ישנם כ 500 קריפטות לכל באר. לסובב למטה ב 150 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן בזהירות שאף את supernatant. תפזרו מחדש את הקריפטות ב-50 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף לכל 500 קריפטות.
פיפטה למעלה ולמטה דואגת להימנע מבועות. מניחים טיפה של 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ותערובת קריפטה במרכז באר אחת של צלחת 24 באר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפוך את מטריצת קרום המרתף.
לאחר 30 דקות של פולימריזציה, בזהירות להוסיף 600 microliters של מדיה minigut לכל באר. מחזירים את הצלחת לאנקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ כל יום, מחליפים את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים. כדי לעבור את enteroids, מניחים את צלחת תרבות הרקמה על קרח, שאף את התקשורת, ולהוסיף מיליליטר אחד של DPBS קר לכל באר.
השתמשו בקצה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצה. מעבירים את הדגימה דרך מזרק אינסולין מיליליטר אחד ומטה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מסתובב למטה במשך חמש דקות ב 150 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, להשתמש פיפטה כדי להסיר את DPBS.
להשעות מחדש את enteroids ב 50 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל באר. מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום המרתף כדי פולימריזציה. לאחר מכן, שכבו כל באר עם 600 מיקרוליטרים של מדיה ENR והחזירו את הצלחת לאנקובטור.
לגדל enteroids במשך חמישה עד שבעה ימים לפני עובר אותם לתוך צלחת חדשה 24 באר באמצעות יחס פיצול של אחד עד שניים. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של בינוני ENR לכל באר, ולאחר מכן להתבגר enteroids במשך ארבעה עד חמישה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קבוצת הביקורת של enteroids מטופלים ואת הקבוצה הניסיונית של enteroids שטופלו חמישה ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין-22.
הכן לפחות שלושה שכפולים עבור כל קבוצה. הוסף 600 מיקרוליטרים של מדיום EdU לכל באר של enteroids למעט אחד גם להשתמש כבקרה שלילית עבור חיסור רקע. דוגרים את הצלחת במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
כדי לקצור enteroids מטריצת קרום המרתף, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשאוף מדיום EdU ולשטוף פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DPBS. השתמשו בקצה פיפטה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצת קרום מרתף מוצקים.
מעבירים את הדגימה לצינור 15 מיליליטר ומסתובבים למטה פי 300 G במשך חמש דקות לפני השלכת העל-טבעי. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אנזימי דיסוציאציה של תאים ודגירה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה P200 כדי לצנרת למעלה ולמטה ולשבור enteroids לתאים בודדים.
לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום הנשר המשונה של Dulbecco המכיל נסיוב חזיר עוברי של 10%, ופעמה חוזרת ונשנית עם קצה פיפטה P1000. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ושואפים את העל טבעי, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. כדי לבצע קיבעון ו permeabilization של תאים, תחילה להעביר את ההשעיה התא לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, להסתובב למטה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי.
אנחנו משהים את התאים במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ולתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, שאף את supernatant עם קצה פיפטה. לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS, ולסובב שוב למטה כדי להסיר את supernatant.
תן שימוש חוזר בתאים עם מיליליטר אחד של 0.5% פעילי שטח לא יוניים, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת התאים עם DPBS כמו קודם. כדי לזהות את EdU, להוסיף 100 microliters של קוקטייל תגובה לכל צינור 1.5 מיליליטר. תדליקו מחדש את התאים, ותגנו עליהם מפני אור, הדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, בעדינות לשאוף את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה להוסיף 0.5% לא יוני פעילי שטח חדירה לכל צינור לשטוף פעם אחת בטמפרטורת החדר. בעקבות צנטריפוגה כמו קודם, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. לסנן את התאים המתווסכלים עם מסננת 40 מיקרון ולאסוף את התאים המסוננים בצינור חרוט 15 מיליליטר.
בצע עובדות על זיהוי מכונה בהקדם האפשרי. בחר את הערוץ והמתח המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה. עבור אסטרטגיית gating, לצייר FSC-A לעומת SSC-A העלילה פסאודוקולור ולהפיץ את רוב התאים לטווח הנראה של מפת הנקודות על ידי התאמת המתח.
בחר את אוכלוסיית התאים כ- R1 ואל תכלול את פסולת התא בפינה השמאלית התחתונה. מאוכלוסיית תא R1, להקים FSC-A לעומת FSC-H העלילה פסאודוקולור. הגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים המוגדרים כ- R2 ולא לכלול גושי תאים.
מאוכלוסיית תא R2, להקים את עוצמת הפלואורסצנטיות לעומת התוויית מספר תא ולהשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלואורסצנטי הוא אזור תא חיובי המיועד R3.Compare היחס של תאים חיוביים אלה EdU בין קבוצות הניסוי והבקרה. קריפטות מעיים קטנות היו מבודדות ותרבותיות כזכיות במטריצת קרום המרתף.
Enteroids התחילו ליצור ניצנים יומיים לאחר הבידוד. ביום השישי, לאנתנואידים היו הרבה ניצנים עם הרבה פסולת בלומן. האסטרואידים היו מוכנים לעבור בשלב זה.
Enteroids טופלו IL-22 במשך 3 ימים, לאחר מכן DNA סינתטי היה מסומן עם EdU באדום כדי להצביע על התפשטות התא. IL-22 enteroids מטופלים הציגו מספר גדל של תאים חיוביים EdU. IL-22 גדל תאים מתרבים מ 40.1% ל 83.5% כפי שנותחו על ידי ציטומטריה זרימה.
IL-22 טיפול גם הגדיל את המוות התאי enteroids מסומן על ידי כתמי יודיד פרופידיום באדום. IL-22 עלה בתאים מתים מ-4.9% ל-16.2% כפי שניתח על ידי ציטומטריית זרימה. במהלך התקדמות בידוד הקריפטה יש צורך לרעוד הוגן לאחר הוספת חיץ כדי להבטיח מספיק קריפטות מזועזעות.
אנו ממליצים לבדוק את התוכן תחת מיקרוסקופ. בעקבות הליך זה, אנו יכולים גם לכמת את סוגי האפיתליאלים המובחנים ואת enteroids באמצעות שיטה ספציפית שיטה זו תסייע לחוקרים לחקור דיפרנציאלי אפיתל מעיים enteroids. לאחר התפתחותה שאלה זו סוללת דרך לחוקרים בתחום הגסטרואנטרולוגיה לחקור את השאלות ההתפתחותיות או הפתולוגיות בחיתוך.
