עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הפרויקט עבור פיתוח מחקר חדשני על ותרופות לסרטן (P-ישירות) (15cm0106102h0002, והספקה) לבין הפרוייקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-צור) (16 ס"מ 01061150001, והספקה) מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED; קרן המדע טקדה (עיון); מענק של הקרן לחקר סרטן הנסיכה Takamatsu (13-24520, עיון); ו JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16K07133 (עיון).

1. מגיב ההתקנה
<ol><li>
ריאגנטים המשמשים לסנכרון תא
	<ol>
<li>כדי להפיק בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) המכילה תימידין 2.5 מ מ, לפזר 30.28 מ"ג של תימידין לכל 1 מ ל מים כיתה תרביות רקמה כדי להכין תימידין 125 מילימטר. Filtrate הפתרון עם יחידת מסנן 0.22 μm מזרק. להוסיף 1 מ"ל של תימידין הטרי 125 מילימטר לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) העובר סרום שור (FBS).</li>
		<li>כדי ליצור DMEM המכיל 0.1 μg/mL של nocodazole, להמיס nocodazole ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) להכין 5 μg/μL nocodazole. להוסיף 1 µL של 5 µg / µL nocodazole לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.</li>
		<li>כדי ליצור DMEM המכיל 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד, להוסיף 1 µL של דימתיל סולפוקסיד לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ריאגנטים המשמש IP-RdRP assay
	<ol>
<li>להכין פירוק מאגר ת 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.4) ו- 0.5% (vol/כרך) Nonidet P-40 (NP-40). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין 5 x מאגר אצטט: 50 מ מ חומצה 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic (HEPES)-קו (pH 7.8), אצטט אשלגן 500 מ מ, 20 מ מ MgCl2. חנות הכימית בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הכנת מאגר אצטט x 1: 1 של מאגר לשטוף, 10% (vol/כרך) גליצרול, 0.1% (vol/כרך) טריטון x X-100 ו 0.06 פרוטאז מעכב קוקטייל, חומצה ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-חינם. להכין מאגר שטיפת 1 ביום של שימוש או יום לפני השימוש. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין AGC פתרון: 1-מאגר אצטט, 10% (vol/כרך) גליצרול ו- 0.02% (wt/כרך) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonat (בחורים). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כדי ליצור פתרון AGC המכיל 2 מ מ CaCl2, להוסיף 100 µL של 1 מ' CaCl2 לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כדי ליצור פתרון AGC המכיל 3 מ מ bis אתילן גליקול (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA), להוסיף 375 µL של 0.4 מ' EGTA (pH 7.5) לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין שטיפת מאגר x 2: 1 אצטט מאגר בחורים 0.02% (wt/כרך). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין פתרון HMD: 0.2 מ' HEPES-קו (pH 7.8), 40 מ מ MgCl2 ו- 2 מ מ dithiothreitol (DTT). חנות הכימית ב-20 ° C. הערה: פתרון HMD צריך להתחדש לפחות שלושה חודשים.</li>
		<li>להכין 2 x מאגר Proteinase K: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות). חנות הכימית ב-20 ° C.</li>
		<li>להכין 2 x טעינת מאגר: 95% (vol/כרך) formamide, EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) ג כתום לאחסן הכימית ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הלה תאים
הערה: להכין הלה תאים מסונכרן mitotic שלב (מניפולציות) או חלוקת באופן אסינכרוני (unmanipulated). התרבות התאים בנוכחות 5% CO2 ב 37 º C.
<ol><li>
סינכרון של הלה בתאים מיטוזה
	<ol>
<li>צלחת עונה 1 פרק 106 תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.</li>
		<li>יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכילה תימידין 2.5 מ"מ ו- 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>רוחצים את התאים שלוש פעמים עם 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) (-), את התרבות התאים עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS במשך 6 שעות.</li>
		<li>החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.1 µg/mL של nocodazole ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.</li>
		<li>לנער את המנה תרבות בעדינות, ולאחזר את תגובת שיקוע המכילות את התאים mitotic מנותקת. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של תאים הלה unmanipulated
	<ol>
<li>צלחת עונה 1 פרק 106 תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.</li>
		<li>יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים אחר 30 אבני.</li>
		<li>החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.</li>
		<li>לאסוף את התאים על ידי trypsinization באמצעות 0.7 מ של טריפסין (2.5 g/L) המכיל 1 מ מ EDTA. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ה-IP-RdRP Assay
<ol><li>חלבון A-agarose חרוז הכנה
	<ol>
<li>העבר 1 מ"ל (מיטה נפח 500 µL) של זיקה שרף צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>µL 800 פירוק מאגר א להוסיף החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים (סה כ שלושה שוטף).</li>
		<li>להוסיף µL 800 פירוק מאגר של החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לסובב את הצינור למשך הלילה (או לפחות 4 שעות) ב 4 ° C-מטרף רוטרי.</li>
		<li>Centrifuge את הצינור ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 500 µL פירוק מאגר של החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תא lysate
	<ol>
<li>(אופציונלי) אם התאים מוקפאים בשלב 2, המקום, להפשיר את התאים קפוא בקרח עד התאים הופכים רופף.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל ל- PBS (-). Centrifuge הדגימה ב x 1,450 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Lyse התאים באמצעות פירוק כקרח מאגר (mL 1 פירוק מאגר A לכל עונה 1 פרק 107 של התאים) על ידי pipetting עדין.</li>
		<li>Sonicate המדגם צינור 1.5 מ עם התנאים הבאים; הגברה של sonicator ב- 25%, וכל sonicate 10 s.</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב x 20,400 g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע. העברת 1 מ"ל כל של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL. התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>מראש נקה את lysate מהשלב 3.2.6 על-ידי הוספת µL 40 (חרוז נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים לכל 1 מיליליטר lysate. מערבבים היטב בעזרת היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולסובב את הדגימה למשך 30 דקות ב 4 º c</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב x 13,000 g עבור 1 דקות ב 4 ° C, ולשחזר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 40 µL (מיטה נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים, 10 µg של נוגדנים נגד טרט (שיבוט: 10E9-2)8 לתוך מאושר מראש lysate. לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים, לסובב את הדגימה ב 4 ° C בלילה.</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם שטיפת מאגר 1: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 1 החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, וכן לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים פעם עם AGC לאודנום מ מ 2 CaCl2: להוסיף 1 מ"ל של קובי, לאודנום מ"מ 2 CaCl2 עד החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להתייחס את החרוזים עם נוקלאז Micrococcal (MNase): להכין לתערובת התגובה MNase המתוארות בטבלה 1. Resuspend את החרוזים ב- 60 µL של תערובת התגובה MNase על ידי pipetting עדין. נתנער המדגם בעדינות (20 עד 25 סל ד) מסתובב של פטיפון של מטרף השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 15 דקות ב 25 º C. הערה: חשוב מאוד להשתמש של שייקר גלית ולעקוב בקפדנות את המהירות המותרת בשלב זה. סוג אחר של והאסטרטג, כגון מערבלים מסתובב, אינן מומלצות.</li>
		<li>Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים פעמיים עם פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA: להוסיף 1 מ"ל של פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA כדי החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים פעם אחת עם שטיפת מאגר 2: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 2החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. לשמור את החרוזים על הקרח תוך הגדרת RdRP התגובה. התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP התגובה
	<ol>
<li>להכין תערובת התגובה RdRP צינור חדש כפי שמתואר בטבלה 2.</li>
		<li>להוסיף 6 µL של α -32P] UTP (3,000 Ci mmol) תערובת, לערבב היטב על ידי pipetting. הערה: ATP [α -32P], [α -32P] CTP או α -32P] GTP יכול לשמש עבור התגובה במקום [α -32P] UTP.</li>
		<li>להוסיף 1 µL של תבנית ה-RNA (µg 1/µL) התערובת, לערבב היטב על ידי pipetting. הערה: כדי ליצור וזמינותו RdRP, התבנית RNA הבאים מומלץ: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Resuspend את החרוזים עם 20 µL של תערובת התגובה RdRP מהשלב 3.4.3 על-ידי pipetting.</li>
		<li>לנער את הדגימה בעדינות (20 עד 25 סל ד) ב מסתובב של פטיפון של מטרף בלב של מוניטורים מסוג peltier עבור 2 h ב- 32 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להוסיף תערובת התגובה 5.4 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) ו- 45.4 µL 2 x Proteinase K המאגר. לערבב על ידי pipetting וללחוץ (20 עד 25 סל ד) הדגימה על מסתובב השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להוסיף 109.2 µL של מים נטולי RNase המדגם.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. מערבבים היטב בעזרת מערבולת ולאחר מכן centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
		<li>הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (ה-pH = 5.2), 4 µL של משקעים ושמני 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר. התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase. הערה: בגדר מהשלב 3.4.11 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול RNase
	<ol>
<li>Resuspend בגדר של שלב µL 3.4.11 ב 20 RNase ללא מים.</li>
		<li>להכין תערובת התגובה RNase צינור חדש כמפורט בטבלה3.</li>
		<li>להוסיף µL 180 של תערובת התגובה RNase המדגם, וכן דגירה הצינור עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להוסיף µL 2.3 למען חברה דמוקרטית 10% (vol/כרך) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.</li>
		<li>להוסיף 2 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.</li>
		<li>להוסיף µL 205 של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. לערבב היטב על ידי מערבולת, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש.</li>
		<li>הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2), 4 µL נושאת משקעים, 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר. הערה: בגדר מהשלב 3.5.9 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה בג'ל ו- autoradiography
	<ol>
<li>Resuspend הדגימה עם µL 20 RNase ללא מים.</li>
		<li>הוסף 20 µL של 2 x טעינת מאגר.</li>
		<li>להרתיח המדגם 10 דקות ב 95 ° C. למחוץ את הדגימה על הקרח.</li>
		<li>הפעל את הג'ל. במקרה גודל התבנית הוא nts 34 (ראה גם שלב 3.4.3), 7 מ' אוריאה - 10% ג'ל לזיהוי משמש denaturing בג'ל.</li>
		<li>יבש את הג'ל עם ג'ל מייבש.</li>
		<li>לחשוף את הסרט מיובשים-הג'ל בתוך קלטת רנטגן עם מסך המגביה ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins.">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li><li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human.">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li><li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription.">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).</li><li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+the+nucleus:+roles+for+small+RNAs+in+transcription,+epigenetics+and+beyond.">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li><li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production.">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA.">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance.">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li><li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase.">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li><li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin.">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li><li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization.">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

IP-RdRP וזמינותו היא שיטה רגיש כדי לזהות RdRP הפעילות של טרט אנושי. חלבון טרט מתבטא מאוד mitotic תאים הלה, שבו טרט טפסים RdRP מורכבים8,9,10. הדבר מצביע על כי תאים הלה mitotic הם חומר אופטימלית כדי לזהות RdRP פעילות. ב פרוטוקול המתואר לעיל, תאים הלה mitotic ו בלתי-מסונכרנות כלולים חיובי, דוגמא שלילית, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 1A, RdRP assay מוצרים מהתבנית RNA המומלצת בתאים הלה mitotic להראות אותות רדיואקטיבי רחבה בין 20-30 nt. בנוסף הלה תאים, יש לבצע את הבדיקה עם סוגים שונים של שורות תאים, ואנו מצא כי ניתן לשנות את דפוס אות ב סוגי תאים שונים9: הופעה כלשהי אות חזק רק בסביבות 30 nt, הופעה כלשהי דפוס פעולה דומה עם הלה תאים. אנו אמורה גם לבצע את הבדיקה עם תבניות RNA חוץ 34 nt תבנית8, קצר, ארוך (~ 300 nt) RNAs עם רצפים שונים, והשיג בהצלחה RdRP מוצרים מתבניות אלה אם כי ייתכן עדיפות מסוימת. למשפט הראשון, עם זאת, אנו ממליצים להשתמש הלה תאים שלב mitotic ואת התבנית nt רנ א 34. RdRPs ליצור זוגיות גדילי RNA פריימר תלוית והן של פריימר תלויית האופן11. דיווחנו כי טרט המשמרת את המאפיין7,האנושי RdRP9; טרט מסנתז dsRNA מתבנית RNA עם מבנה 3'-foldback דרך הגב-לקרקע מנגנון7. עבור תבנית nt רנ א 34, טרט מסנתז גדילים משלימים ללא שימוש תחל9. במיוחד לזהות מוצרים RdRP מסונתז באופן שאינו תלוי-פריימר, קרי דה נובו מסונתז RNA מוצרים, [α -32P] NTP יכול להיות מוחלף עם [γ -32P] NTP ב התגובה RdRP9.
טיפול MNase של טרט מכלולים חיסוניים על חרוזים הוא שלב קריטי להשגת התוצאות הרצויות. אם הטיפול MNase מתבצע זמן רב מדי או ייבוש אינטנסיבי, המוצרים RdRP יופחת במידה ניכרת. כדי למנוע בעיות של כאלה, אנו ממליצים לפעול אך ורק לפי התקנון בקפידה. פתרון HMD הוא גורם קריטי נוסף להצלחה. אם אתה מוצא האותות חלשים מאוד, החלף את הפתרון HMD אחד מוכן לאחרונה.
לאורך כל הפרוטוקול, אחד צריך לקחת כדי למנוע זיהום RNase. Ribonuclease הטיפול צריכה להתבצע עם ציוד ייעודי. לאחר הדחת את Ribonuclease, אחד צריך לבטל עצות, צינורות עם RNase באופן מיידי, לחסל RNase עם פתרון מיוחדים (למשל RNase שקט) ושנה מטעי.
טרט אינטראקציה עם לא רק TERC אלא גם סוגים רבים של RNAs אנדוגני, דיווחנו חלק מהם7. שינוי ב- IP-RdRP וזמינותו, כגון וזמינותו IP-RdRP ללא טיפול MNase, יספקו רשימה מלאה של תבניות RNA אנדוגני עבור פעילות הקשורים טרט RdRP מדריך bioinformatic על תכונות רצף שלהם. אנחנו בהצלחה החלת פרוטוקול זה רקמות lysate. כי טרט מתבטאת במגוון של רקמות רגיל, הגידול, וזמינותו זה עשוי להיות שימושי לחקור קאנונית הפונקציה אנזימטי של טרט בן אנוש

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מוכרת היטב יחידת משנה קטליטי של טלומראז, והארכת זה טלומר באמצעות רכיב ה-RNA טלומראז (TERC), תבנית ספציפית רנ א1. למרות טרט polymerizes telomeric DNA כמרכיב של טלומראז, הניתוחים פילוגנטי מבניים מצביעים על כך טרט קשורה קשר הדוק עם תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs), כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז מניות תחומים עם אלה polymerases2,3,4. RdRP הוא האנזים מייצר גדיל RNA משלים לתבנית RNA. האנזים מקודד לא רק וירוסים אלא גם אורגניזמים מודל, כגון צמח, שמרים, תולעת, ותורם כפול גדילי סינתזה RNA מאת RdRP גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional ג'ין להחרשת אלה אורגניזמים5,6 . למרות RdRP אנושי נעדר כבר הרבה זמן, מצאנו RdRP פעילות אנושית טרט ב 20097.
תחילה אנחנו אישר RdRP הפעילות של טרט עם חלבון רקומביננטי7ולאחר מכן הוקמה assay רגיש במבחנה כדי לזהות RdRP פעילות של טרט אנדוגני8. . הנה, נדגים את במבחנה RdRP assay (IP-RdRP assay) עבור טרט אנדוגני. שיטה זו מתחיל עם immunoprecipitation (IP) של טרט אנדוגני, ואחריו במבחנה RdRP תגובה, שבו ribonucleotides רדיואקטיבי משולבים גדילי RNA המתהווה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:464px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:155px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">044-29765</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin mixed solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>32777-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline (PBS(-))</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymidine</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07147-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08904-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31333-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35434-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>18321-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25223-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Protein A Plus Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td align="right">22812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17514-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium acetate</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>28405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete, EDTA-free</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06731-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>2910A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15214-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07957-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14128-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG507H</td>
			<td>Use fresh RI for the assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase inhibitor</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>SIN-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 M Sodium acetate</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-90081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td align="right">9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase One Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>02873-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide, deionized</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16345-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15130-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orange G</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25401-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>SCA-325DRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>EX-135</td>
			<td>For step B)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., KUBOTA</td>
			<td align="right">3740</td>
			<td>For step 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125</td>
			<td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>MX-305</td>
			<td>For step 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator</td>
			<td>e.g., Panasonic</td>
			<td>MIR-154-PJ</td>
			<td>Set a rotary shaker inside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotary shaker</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>RT-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator&#160;</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>BR-43FL</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 7.7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MINI WAVE</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>WEV-03</td>
			<td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>HB-80</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Block incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>BI-516S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) היא יחידה משנית קטליטי של טלומראז, זה מאריך טלומר באמצעות פעילות ה-DNA פולימראז תלוי-RNA. למרות טרט נקרא בשם של רוורס טרנסקריפטאז, ניתוח פילוגנטי מבניים של טרט מדגימים כי טרט חבר polymerases ימני, מתייחס תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs) כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז. אנחנו קודם כל לזהות RdRP הפעילות של טרט האדם שיוצר RNA משלים לעמוד על תבנית ללא קידוד RNA ותורמת RNA להשתיק בתאים סרטניים. כדי לנתח את הפעילות אנזימטי קאנונית הזו, אנחנו שפותחה RdRP assay עם טרט רקומביננטי בשנת 2009, לאחר מכן הוקמה במבחנה RdRP וזמינותו של טרט אנדוגני. כתב יד זה, אנו מתארים את השיטה השנייה. בקצרה, מכלולים חיסוניים טרט מבודד מן התאים, מודגרות עם תבנית ה-RNA ו- rNTPs כולל rNTP רדיואקטיבי עבור RdRP התגובה. כדי למנוע RNA חד-גדילי, התגובה מוצרים מטופלים עם RNase ואני המוצרים הסופיים הם ניתחו עם לזיהוי בג'ל. Radiolabeled מוצרים RdRP ניתן להבחין autoradiography לאחר חשיפה לילה.

עם התבנית המומלצת RNA, מוצרים RdRP רדיואקטיבי הם נצפו בין 20-30 נוקלאוטידים (nt) באופן ספציפי בתאים הלה בשלב mitotic לאחר חשיפה לילה (איור 1 א'). בדרך כלל, עוצמת האות של המוצרים RdRP מדגים שתי הפסגות הממוקמים בסביבות 25 nt ו- 30 nt ב consonance עם התפלגות גודל של המוצרים מאושרות על ידי הדור הבא רצפי9. בניגוד mitotic תאים, הלה תאים ללא סינכרון להפגין כמעט היעדר nt 20 – 30 המוצרים רדיואקטיבי. אותות סגלגל, הממוקמות מתחת 20 nt כל הדגימות, הן נשתל לא ספציפית.
במקרה זה יש רק ~ 30 nt מוצר עם האות חלש בתאים הלה mitotic, הוא מציין כי התגובה RdRP לא עלו יפה. לדוגמה, אם MNase הטיפול מבוצע בערך, באופן בלתי הולם, עוצמת אות בהלה mitotic תאים יתקצר באופן משמעותי (איור 1B). RdRP התגובה הופיעה עם פתרון HMD הישן גם מפחית את המוצרים (איור 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> איור 1 : נציג RdRP מוצרים של טרט אנדוגני בתאים הלה mitotic. (א) שלוש תוצאות נציג של IP-RdRP וזמינותו בתאים הלה מטופלים עם nocodazole (מניפולציות) או דימתיל סולפוקסיד (unmanipulated). 34 מסונתז כימית nt RNA שימש כתבנית. (B) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם טיפול MNase לא הולם. (ג) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם פתרון HMD טריים או ישן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ריאגנטים</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוקלאז micrococcal, U 20/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר נוקלאז micrococcal, 10 x</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase ללא מים</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: MNase התגובה רכיב לערבב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ריאגנטים</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>חברים, 0.07% (wt/כרך)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון HMD</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 מ מ</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 מ מ</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0.4 מ מ</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 מ מ</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase מעכב, U 40/µL</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase ללא מים</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: RdRP התגובה רכיב לערבב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ריאגנטים</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase אחד Ribonuclease, U 10/µL</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מאגר התגובה, 10 x</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase ללא מים</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: Ribonuclease התגובה רכיב לערבב.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.7K Views.  National Cancer Center Research Institute. טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

Video: Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...