ישנם יותר מ -100 שינויים שונים של RNA, שני שליש מהם מתילציות. פרוטוקול זה מספק שיטה לניתוח רגיש ומדויק של פעילות כותב מתילציה RNA. טכניקה קלה לשימוש זו מאפשרת לנו לכמת ולהדמיין RNA מתילציה ללא שימוש בנוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים.
הפגנת ההליך תהיה סמנתה שלטון, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את הבדיקה RNA 100 מיקרוליטר מתילטרנספראז בצינור 1.5 מיליליטר על קרח, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. Vortex הצינור לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש שניות כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור.
דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, נקה את התגובה באמצעות טיהור עמודות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את ספירת ההטיה הנוזלית, הגדר את ארון התקשורת של ספירת ההיתוך עם בקבוקון אחד לכל דגימה, בקבוקון אחד למדידת רקע ובקבוקון אחד לבדיקת ההחלקה.
מלאו את הבקבוקונים בחמישה מיליליטר של פתרון ספירת תבליט. הוסף 10 מיקרוליטרים של כל דגימת RNA רדיואקטיבית אלוט לתוך בקבוקון אחד. מהדקים את המכסה ומערבבים בעדינות.
כדי להכין את בקבוקוני מבחן ההחלקה, יש לשפשף ביסודיות צמר גפן על כל המשטחים והציוד המשמשים במהלך ההליך. מוסיפים את המטילים האלה לבקבוקונים המלאים בתתווית תוסף, ומהדקים את המכסה. כדי להפעיל את הדגימות על מונה ההצטיינים, פתח את מכסה המנוע של המונה, הכנס את ארון התקשורת למכונה וסגור את מכסה המנוע.
בחר ספירת ארון תקשורת בודד. בחר בחר תוכנית משתמש. בחר או צור תוכנית המודדת טיטוריום למשך 60 שניות והתן ללחץ על ארון תקשורת של Count.
חזור על ספירת ההטיה שלוש פעמים. לאחר מכן, להכין ולהפעיל מחדש ג'ל פוליאקרילמיד urea denaturing, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבר 20 מיקרוליטרים של חומר RNA רדיואקטיבי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטרים של חיץ טעינת ג'ל 2X.
לאחר הכנת הסולם, הדגירה את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לשטוף את בארות של הג'ל פעם נוספת מיד לפני הטעינה מדגם על ידי חיץ pipetting ממיכלי ג'ל למטה לתוך בארות של הג'ל. לאחר מכן, לטעון 20 microliters של הסולם מוכן, 20 microliters של הדגימות, ו 20 microliters של חיץ 1X ג'ל טעינה לתוך הנתיבים של הג'ל.
הפעל את הג'ל ב 100 וולט במשך 60 עד 180 דקות, בהתאם לאחוז פוליאקרילמיד. לאחר שהג'ל סיים לפעול, הסר את הג'ל מהקלטת והצב אותו בקופסה המכילה 50 מיליליטר של חיץ TBE 1X עם חמישה מיקרוליטרים של כתם ג'ל חומצת גרעין רגיש במיוחד. דגירה על נדנדה במשך חמש דקות כדי להכתים את RNA.
לאחר מכן, מוציאים בזהירות את הג'ל מהתיבה, ומ מניחים אותו על טרנסילומינטור UV של מערכת ההדמיה ג'ל עם הבאר למעלה ואת הסולם בצד שמאל. למקד את המצלמה על הג'ל, להפעיל את אור UV, ולצלם את הג'ל. לאחר מכן, כבה את חשיפת UV ושמור את התמונה כקובץ TIFF.
מניחים את הג'ל בחזרה לתוך התיבה, להסיר את TBE, ולתקן את הג'ל עם 50 מיליליטר של פתרון תיקון על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, בעדינות להעביר את הג'ל לקופסה שחורה טרייה המכילה 25 מיליליטר של פתרון שיפור האוטוביוגרפיה. דגירה על הנדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
מרימים בעדינות את הג'ל, ומ מניחים אותו עם הפנים כלפי מטה על גיליון של ניילון נצמד עם בארות למעלה ואת הסולם בצד ימין. מניחים שני גיליונות של נייר כרומטוגרפיה על גב הג'ל, ולהפוך את הערימה כולה. מחממים מראש את מייבש הג'ל ל-80 מעלות.
מזיזים את כיסוי הפלסטיק על מייבש הג'ל לאחור. הכנס את הערימה כולה מתחת לכיסוי הפלסטיק, והזז את כיסוי הפלסטיק בחזרה למטה כדי ליצור חותם. יבש את הג'ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר מכן, לכבות את מייבש ג'ל, בעדינות להסיר את הערימה. הסר את נייר העטיפה והכרומטוגרפיה השני. מקליטים את נייר הכרומטוגרפיה הנותר עם הג'ל המיובש בקלטת אוטוביוגרפיה.
בחדר חשוך, הוסף גיליון אחד של סרט אוטוביוגרפיה. אחסן את הקלטת ב 80 מעלות צלזיוס שליליות, ולפתח את הסרט בזמן המתאים, בהתאם לעוצמת האות. לאחר שהסרט מפותח, מניחים אותו על גבי הקלטת ולהשתמש סמן מעבדה כדי לסמן בזהירות את ארבעת הקצוות של הג'ל, כל באר, ואת המיקום של XC ו BB צבעים.
סרוק את הסרט ברזולוציה של 300 או 600 פיקסלים לאינץ', ושמור את התמונה כקובץ TIFF. במחקר זה, בדיקת נוגדנים ללא הוכח לנתח פעילות RNA מתילטרנספראז. ריצה טיפוסית מתגובת שעתוק במבחנה עם פולימראז T7 RNA של RNA גרעיני קטן 7SK מראה RNA קצר יחסית מובנה מאוד.
ישנן להקות לא רצויות מרובות, קצרות ואותר מ- 7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירועי אתחול או סיום אקראיים של שעתוק. בגלל זה, טיהור ג'ל בעקבות תגובת שעתוק במבחנה חשוב להשיג מדגם RNA נקי. בשלב זה, RNA של עניין יכול להיות מזוהה על ידי מיקומו יחסית לסולם ומטוהר על ידי טיהור ג'ל.
RNA ייצוגי methyltransferase לבדוק באמצעות הגבול התחתון של RNA מומלץ ריכוזי חלבון מוצג כאן. בדיקה זו מאפשרת הן תוצאות כמותיות מספירת ההטיה, והן תוצאות איכותיות מההתדרדרות האוטו-רדיום. כאן, מתילרנספראז RNA ידוע מתילאט 7SK מוצג להיות מסוגל גם מתילאט U6. יתר על כן, כפי שהוצג לאחרונה עבור 7SK, מחייב של היסטון H4 כדי MePCE גם מעכב מתילציה U6.
ניתן לראות זאת הן בספירת הנצנוץ והן ב autoradiogram, מראה את החוסן של פרוטוקול זה. RNA רגיש להשפלה, לכן הקפד להשתמש ריאגנטים ללא RNase ולנקות ביסודיות את כל המשטחים והציוד. RNA שכותרתו רדיואקטיבית המתקבלת מהערכה זו methyltransferase ניתן להשתמש ישירות כדי להעריך פעילות RNA demethylase או פעילות מחייבת RNA על ידי מסמן שינוי ניידות אלקטרופורטית, למשל.
שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבדוק את ההשפעה של גורמים שונים על פעילות RNA מתילטרנספראז, כולל מוטציות נקודתיות וטיפולי מעכבי מולקולות קטנות. שיטה זו משתמשת בחומר רדיואקטיבי, כדי להיות בטוח ללבוש את PPE המתאים, ולהיות זהיר במהלך טיפול סילוק של חומרים רדיואקטיביים.
