Bu eser kısmen proje tarafından kanser tedavi (P-doğrudan) (15cm0106102h0002, km) ve proje üzerinde yenilikçi araştırma geliştirme için kanser araştırma ve tedavi evrim (P-oluşturma) (16 cm 01061150001, km) için Japonya ajansından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED için; Takeda Bilim Vakfı (Y.M.); Grant Prenses Takamatsu kanser araştırma fonu (13-24520, Y.M.); ve JSP'ler KAKENHI Grant numarası JP16K07133 (Y.M.).

1. reaktif Kur
<ol><li>
Hücre eşitleme için kullanılan reaktifler
	<ol>
<li>Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) 2.5 mM timidin içeren üretmek için doku kültürü sınıf su 125 mM timidin hazırlamak için 1 mL başına timidin 30.28 mg geçiyoruz. Çözüm 0,22 mikron şırınga filtre birimi olan filtrate. 1 mL taze hazırlanmış 125 mM timidin % 10 (vol/vol) fetal Sığır serum ile (FBS) takıma DMEM 50 mL başına ekleyin.</li>
		<li>0,1 μg/mL nocodazole içeren DMEM üretmek için dimetil sülfoksit (5 μg/μL nocodazole hazırlamak için DMSO) nocodazole geçiyoruz. 5 µg 1 µL Ekle / µL nocodazole DMEM 50 mL başına % 10 (vol/vol) FBS ile desteklenmiştir.</li>
		<li>DMSO %0,002 (vol/vol) içeren DMEM üretmek için DMSO 1 µL % 10 (vol/vol) FBS ile desteklenmiş DMEM 50 mL başına ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IP-RdRP tahlil için kullanılan reaktifler
	<ol>
<li>Lizis arabellek A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) hazırlamak ve %0,5 (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>5 x asetat arabellek hazırlamak: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic asit (HEPES)-KOH (pH 7.8), 500 mM potasyum asetat ve 20 mM MgCl2. Reaktif oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Hazırlamak yıkama arabellek 1: 1 x asetat arabellek, % 10 (vol/vol) gliserol, % 0,1 (vol/vol) Triton X-100 ve 0,06 x proteaz inhibitörü kokteyl, ethylenediamenetetraacetic asit (EDTA)-ücretsiz. Yıkama arabellek 1 gün kullanım ya da gün kullanmadan önce hazırlamak. Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>AGC çözüm hazırlamak: 1 x asetat arabellek, % 10 (vol/vol) gliserol ve %0.02 (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (çocuklar). Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>2 mM CaCl2içeren AGC çözüm üretmek için 100 µL 1 M CaCl2 50 mL AGC çözeltisi ekleyin. Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>3 mM etilen glikol bis (b-aminoethylether) içeren AGC çözüm üretmek için-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA), 0.4 M EGTA (pH 7.5) 375 µL başına 50 mL AGC çözeltisi ekleyin. Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Yıkama arabellek 2: 1 x asetat arabellek ve %0.02 (wt/vol) çocuklar hazır olun. Reaktif 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>HMD çözüm hazırlamak: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7.8), 40 mM MgCl2 ve 2 mM dithiothreitol (DTT). Mağaza-20 ° C'de reaktif Not: HMD çözüm en az üç ay içinde yenilenmelidir.</li>
		<li>2 x İndinavir K arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA ve %1 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). Mağaza-20 ° C'de reaktif</li>
		<li>Arabellek yükleme x 2 hazırlamak: %95 (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA ve %1 (wt/vol) turuncu G. saklamak-20 ° C'de reaktif</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HeLa hücreleri hazırlanması
Not: HeLa hücreleri hazırlamak eş zamanlı mitotik faz (manipüle) veya zaman uyumsuz olarak bölme (unmanipulated). Varlığında % 5 CO2 37 ° C'de hücreler kültür
<ol><li>
Eşitleme HeLa hücreleri mitoz
	<ol>
<li>Plaka 1 x 106 HeLa hücreleri ile 10 mL % 10 (vol/vol) 10 cm kültür tabak içinde FBS ile takıma DMEM.</li>
		<li>İki gün sonra kaplama, orta 10 mL 2.5 mM timidin ve % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM ile değiştirin. 24 h için hücreleri kültür.</li>
		<li>Hücreleri üç kez 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) (-) ile yıkama ve 10 mL % 10 (vol/vol) FBS 6 h için içeren DMEM hücrelerle kültür.</li>
		<li>Orta nocodazole ve % 10 (vol/vol) FBS 0.1 µg/mL içeren DMEM 10 mL ile değiştirin ve 14 h için hücreleri kültür.</li>
		<li>Kültür çanak yavaşça salla ve müstakil Mitotik hücre içeren süpernatant almak. IP-RdRP tahlil için hücre saymak.</li>
		<li>490 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Not: Hücre Pelet-80 ° C'de saklanabilir</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Unmanipulated HeLa hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Plaka 1 x 106 HeLa hücreleri ile 10 mL % 10 (vol/vol) 10 cm kültür tabak içinde FBS ile takıma DMEM.</li>
		<li>İki gün sonra kaplama, orta 10 mL % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM ile değiştirin. 30 h için hücreleri kültür.</li>
		<li>Orta %0,002 (vol/vol) DMSO ve % 10 (vol/vol) FBS içeren DMEM 10 mL ile değiştirin ve 14 h için hücreleri kültür.</li>
		<li>Hücreleri tarafından 0.7 mL 1 mM EDTA içeren tripsin (2.5 g/L) kullanarak trypsinization toplamak. IP-RdRP tahlil için hücre saymak.</li>
		<li>490 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Not: Hücre Pelet-80 ° C'de saklanabilir</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP tahlil
<ol><li>Protein A-özel boncuk hazırlık
	<ol>
<li>1 mL (yatak hacmi 500 µL) 1.5 mL microcentrifuge tüp benzeşme reçine aktarın. Vasıl 800 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Lizis arabelleği A 800 µL boncuk için ve de tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Vasıl 800 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Bu iki kez (Toplam üç yıkama) tekrarlayın.</li>
		<li>İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından karıştırın, lizis arabelleği A 800 µL boncuk için ekleyin. Tüp 4 ° c üzerinde döner bir shaker gecede (veya en az 4 h için) döndürün.</li>
		<li>Tüp vasıl 800 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Lizis arabelleği A 500 µL boncuk için ve de tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Boncuk 4 ° C'de depolayın</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre lysate hazırlanması
	<ol>
<li>(İsteğe bağlı) Hücreler 2. adımda donduruldu varsa yerleştirebilir ve hücreler gevşek olana buz dondurulmuş hücrelerdeyse çözülme.</li>
		<li>Hücreleri bir kez PBS (-) 10 mL ile yıkayın. 1.450 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Buz gibi lizis arabellek (1 mL) lizis arabelleği 1 x 107 hücrelerin A hücrelerle nazik pipetting tarafından parçalayıcı.</li>
		<li>Aşağıdaki koşullar ile 1,5 mL tüp örnekte solüsyon içeren temizleyicide; ayarla sonicator amplifikasyon % 25 ve 10 için solüsyon içeren temizleyicide s.</li>
		<li>Örneği ' 20,400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant toplamak. 1 mL her süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın. Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>3.2.6. adımdaki lysate 40 µL (boncuk Cilt 20 µL) ekleyerek alışım protein A-özel boncuk lysate 1 mL başına önceden temizleyin. İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından mix ve örnek 4 ° C'de 30 dk için döndürme</li>
		<li>13.000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kurtarmak.</li>
		<li>40 µL (yatak hacmi 20 µL) alışım protein A-özel boncuk ve anti-insan TERT antikor 10 µg ekleyin (klon: 10E9-2)8 önceden temizlenmiş içine lysate. İyi tüp birkaç kez ters çevirme tarafından mix ve örnek 4 ° c gece boyunca döndürmek.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Boncuk yıkama arabelleği 1 ile yıkayın: yıkama arabellek 1 1 mL için boncuk ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C'de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Bu üç ek kez tekrarlayın.</li>
		<li>Boncuklar, bir kez 2 mM CaCl2içeren AGC çözüm ile yıkayın: AGC çözüm 2 mM CaCl2 boncuk için içeren 1 mL ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C'de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Boncuk Micrococcal nükleaz (MNase) ile tedavi: Tablo 1' de açıklanan MNase reaksiyon karışımı hazırlayın. Boncuk MNase reaksiyon karışımı 60 µL içinde nazik pipetting tarafından resuspend. Örnek hafifçe bir pikap Peltier tipi kuluçka 25 ° C'de 15 dakika ayarla bir shaker üzerinde (20-25 rpm) sallamak Not: Dalgalı bir shaker kullanıp kesinlikle hız sınırı Bu adımda takip etmek çok önemlidir. Çalkalayıcılar, dönen mikserler gibi diğer tür tavsiye edilmez.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Boncuk iki kez 3 mM EGTA içeren AGC çözüm ile yıkayın: AGC çözüm 3 mM EGTA boncuk için içeren 1 mL ekleyin, karıştırın de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C'de 5 min için döndürme 3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Boncuk bir kez yıkama arabelleği 2 ile yıkayın: yıkama arabellek 2 1 mL ekleyinboncuk için mix de tüp ters çevirme tarafından ve örnek 4 ° C'de 5 min için döndürün 3300 x g 4 ° C'de 0,5 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Buz üstündeki RdRP reaksiyonu ayarlanırken tutun. Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP tepki
	<ol>
<li>RdRP reaksiyon karışımı yeni bir tüp Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>[α -32P] 6 µL eklemek UTP (3.000 CI/mmol) karışımı ve de pipetting tarafından mix. Not: [α -32P] ATP, [α -32P] CTP veya [α -32P] GTP [α -32P] yerine tepki için kullanılabilir UTP.</li>
		<li>1 µL şablonunun RNA ekleyin (1 µg/µL) karışımı ve de pipetting tarafından mix. Not: aşağıdaki RNA şablon RdRP tahlil oluşturmak için önerilir: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>3.4.3. adımdaki RdRP reaksiyon karışımı 20 µL ile boncuk pipetting tarafından resuspend.</li>
		<li>Örnek hafifçe bir pikap türü peltier kuluçka 32 ° C'de 2 h için ayarla bir shaker üzerinde (20-25 rpm) sallamak</li>
		<li>5.4 µL İndinavir k (20 mg/mL) ve 2 x İndinavir K arabelleği 45,4 µL tepki karışıma ekleyin. Pipetting tarafından mix ve Peltier tipi kuluçka 37 ° C'de 30 dk için ayarla bir pikap üzerinde örnek (20-25 rpm) sallamak</li>
		<li>Su RNase free 109.2 µL örnek için ekleyin.</li>
		<li>Asit fenol kloroform 200 µL örnek için ekleyin. Gönderen de vortex mix ve 21,100 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
		<li>3 M sodyum asetat 20 µL ekleyin (pH = 5,2), 4 µL yağış taşıyıcı ve etanol sulu faz için 250 µL. Karıştırma için iyi tüp sallamak, sonra 21,100 x g 4 ° C'de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
		<li>Pelet 300 µL-20 ° C'de depolanan soğuk % 70 (vol/vol) etanol ile yıkayın Örneği ' 21,100 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant atın ve Pelet kuruması. Dikkat: RNase free koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. Not: Adım 3.4.11 Pelet-20 ° C'de en az 2 gün saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase tedavi
	<ol>
<li>Pelet kimden adım 3.4.11 20 µL RNase free su resuspend.</li>
		<li>RNase tepki karışımı yeni bir tüp Tablo 3' te açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Örnek için 180 µL RNase tepki karışımı ekleyin ve 37 ° C'de 2 h için tüp kuluçkaya</li>
		<li>(Vol/vol) % 10 SDS 2.3 µL için örnek eklemek ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
		<li>2 µL İndinavir k (20 mg/mL) için örnek eklemek ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
		<li>Asit fenol kloroform 205 µL örnek için ekleyin. Mix de tarafından girdap, sonra 21,100 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Sulu faz için yeni bir tüp aktarın.</li>
		<li>3 M sodyum asetat (pH 5.2), yağış taşıyıcı 4 µL ve etanol sulu faz için 250 µL 20 µL ekleyin. Karıştırma için iyi tüp sallamak, sonra 21,100 x g 4 ° C'de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
		<li>Pelet 300 µL-20 ° C'de depolanan soğuk % 70 (vol/vol) etanol ile yıkayın Örneği ' 21,100 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant atın ve Pelet kuruması. Not: Adım 3.5.9 Pelet-20 ° C'de en az 2 gün süreyle saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Jel Elektroforez ve autoradiography
	<ol>
<li>Örnek 20 µL RNase free su ile resuspend.</li>
		<li>Arabellek yükleme x 2 20 µL ekleyin.</li>
		<li>Örnek 95 ° C'de 10 dakika kaynatın Buz üzerinde örnek ezmek.</li>
		<li>Jel çalıştırın. (Ayrıca bkz: adım 3.4.3) 34 nts şablon boyutu olması durumunda, 7 M üre - %10 polyacrylamide jel jel elektroforez denaturing için kullanılır.</li>
		<li>Bir jel kurutma makinesi ile jel kuru.</li>
		<li>Kurutulmuş jel-80 ° C'de kuvvetlenmesine bir ekran ile bir X-ray kaset içinde film maruz</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins.">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li><li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human.">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li><li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription.">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).</li><li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+the+nucleus:+roles+for+small+RNAs+in+transcription,+epigenetics+and+beyond.">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li><li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production.">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA.">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance.">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li><li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase.">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li><li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin.">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li><li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization.">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

IP-RdRP tahlil insan TERT RdRP etkinliğini algılamak için duyarlı bir yöntemdir. TERT protein yüksek mitotik HeLa hücreleri TERT RdRP karmaşık8,9,10formlar ifade edilir. Bu mitotik HeLa hücreleri RdRP bir etkinlik tespit için en uygun bir malzeme olduğunu göstermektedir. Yukarıda açıklanan iletişim kuralında, mitotik ve sigara senkronize HeLa hücreleri olumlu ve olumsuz bir örnek sırasıyla dahil edilir. Şekil 1Aile gösterildiği gibi RdRP tahlil ürünleri mitotik HeLa hücreleri içinde önerilen RNA şablondan 20 ile 30 arası geniş radyoaktif sinyalleri göstermek nt. HeLa hücreleri ek olarak, biz tahlil hücre hatları farklı tipleri ile gerçekleştirilen ve sinyal örneği farklı hücre türleri9' değiştirilebilir bulundu: bazı güçlü sinyal sadece yaklaşık 30 göstermek nt, bazı HeLa hücreleri ile benzer bir yol göstermek. Biz de tahlil dışında 34 nt şablon8, RNA şablonlarla kısa gerçekleştirdik ve uzun (~ 300 nt) RNA'ların çeşitli serileri ile ve başarıyla elde RdRP ürünleri bu şablonlardan olabilir, ancak bazı tercihi. İlk deneme için ancak, HeLa hücreleri mitotik faz ve 34 nt RNA şablon kullanmanızı öneririz. RdRPs çift iplikçikli RNA astar bağımlı hem bir astar bağımsız şekilde11de oluşturabilirsiniz. TERT bu özelliği insan RdRP7,9olarak korur bildirdin; TERT dsRNA 3'-foldback yapısı ile arka astar mekanizması7ile bir RNA şablondan sentezler. 34 nt RNA şablon olarak TERT tamamlayıcı iplikçikleri astar9kullanmadan sentezler. Özellikle sentezlenmiş bir astar bağımsız şekilde, yani de novo sentezlenmiş RNA ürünleri, [α -32P] RdRP ürünleri algılamak için NTP [γ -32ile P] değiştirilebilir NTP RdRP reaksiyon9.
TERT bağışıklık kompleksleri boncuk üzerinde tedavisinde MNase istenilen sonuca ulaşmak için kritik bir adımdır. MNase tedavisi çok uzun ya da yoğun sallayarak ile gerçekleştirilirse, RdRP ürünleri son derece azalacaktır. Böyle bir sorun önlemek için kesinlikle protokol dikkatle takip için önerilir. HMD çözüm başarı için başka bir önemli faktördür. Sinyalleri çok zayıf olduğunu görürseniz, yeni hazırlanan bir HMD çözüm değiştirin.
Boyunca protokolünün, bir RNase kirlenmesini önlemek için büyük bir özenle almalıdır. Ribonükleaz tedavi özel ekipman ile yapılmalıdır. Ribonükleaz manipüle sonra bir ipuçları atmak ve RNase tüplerini hemen, RNase özel çözüm ile (Örneğin RNase sessiz) ortadan kaldırmak ve bahçeleri değiştirin.
TERT sadece TERC ama endojen RNA'ların da birçok türde ile etkileşim ve onların bir parçası7bildirdin. Değişiklik olmadan MNase tedavi, IP-RdRP tahlil gibi IP-RdRP tahlil endojen RNA şablonlarının TERT ilişkili RdRP etkinliği ve bioinformatic Kılavuzu için tam bir listesi üzerinde onların sırası özellikleri sağlar. Bu iletişim kuralı başarıyla doku lysate başvurdum. TERT normal ve tümör doku çeşitli ifade edilir çünkü bu tahlil TERT kanonik olmayan enzimatik işlevi insan araştırmak yararlı olabilir.

İnsan revers transkriptaz (TERT) iyi bilinen Revers katalitik alt birim ve Revers RNA bileşeni (TERC), belirli RNA şablon1kullanarak telomer uzatıyor. TERT telomeric DNA Revers bir bileşeni olarak polymerizes rağmen yapısal ve filogenetik Analizi TERT gibi viral transkriptaz viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRPs) ile yakından ilgilidir ve etki ile paylaşan gösterir Bu polimerazlar2,3,4. RdRP RNA iplikçik bir şablona RNA oluşturur enzimdir. Enzim sadece virüs ama aynı zamanda model organizmalar, bitki, mantar ve solucan gibi kodlanır ve çift iplikçikli RNA sentezi RdRP tarafından bu organizmalar5',6 transkripsiyon ve çoğu gen susturmak için katkıda bulunur . Her ne kadar insan RdRP uzun zamandır kayıptı, insan TERT 20097RdRP aktivite bulduk.
İlk Rekombinant protein7ile TERT RdRP etkinliğini doğruladı sonra RdRP aktivite endojen TERT8algılamak için bir hassas vitro tahlil kurulan. Burada, endojen TERT vitro RdRP tahlil (IP-RdRP tahlil) göstermektedir. Bu yöntem endojen TERT immunoprecipitation (IP) ile başlar ve vitro RdRP tepki, radyoaktif ribonucleotides doğmakta olan RNA iplikçikler halinde dahil edilmiştir gelir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

İnsan revers transkriptaz (TERT) Revers katalitik altbirim telomer RNA'ya bağımlı DNA polimeraz faaliyetleri ile hisli var... TERT transkriptaz adlandırılır rağmen TERT yapısal ve Filogenetik analiz TERT sağ elini polimerazlar bir üyesidir ve viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRPs) viral transkriptaz yanı sıra ilgilidir göstermek. Biz öncelikle tamamlayıcı RNA oluşturur insan TERT aktivitesinin RNA kodlamayan şablon için stand ve kanser hücrelerinde susturmak RNA katkıda RdRP tespit edilmiştir. Bu kanonik olmayan enzimatik etkinliğini çözümlemeye RdRP tahlil rekombinant TERT ile 2009 yılında geliştirilen, bundan sonra vitro RdRP tahlil için endojen TERT kurmuştur. Bu makale, ikinci yöntemi açıklanmaktadır. Kısaca, TERT bağışıklık kompleksleri hücreleri izole ve şablon RNA ve radyoaktif rNTP RdRP tepki için de dahil olmak üzere rNTPs ile inkübe. Tek iplikçikli RNA ortadan kaldırmak için reaksiyon ürünleri ben ve son ürünlerin polyacrylamide jel elektroforez ile analiz edilir RNase ile tedavi edilir. Radiolabeled RdRP ürün autoradiography tarafından gece maruz kaldıktan sonra tespit edilebilir.

Önerilen RNA şablonuyla radyoaktif RdRP ürünler özellikle HeLa hücreleri mitotik aşamasında gece pozlama (Şekil 1A) sonra 20-30 nükleotit (nt) arasında gözlenir. Genellikle, sinyal şiddeti RdRP ürünlerin yaklaşık 25 konumlandırılmış iki pik gösterir nt ve 30 nt ürün boyut dağılımı ile ahenk içinde sonraki nesil sıralama9tarafından onaylandı. Mitotik hücre aksine HeLa hücreleri eşitleme olmadan neredeyse 20-30 nt radyoaktif ürünler yokluğu göstermektedir. 20 altında yerleştirilen oval sinyalleri, tüm örnekleri, NT'de vardır nonspesifik sürüklenir.
Bu sadece bir ~ 30 nt ürünüyle mitotik HeLa hücreleri sinyali zayıf olması durumunda, RdRP tepki iyi gitmedi gösterir. MNase tedavi kabaca ve uygunsuz bir şekilde gerçekleştirilirse, örneğin, mitotik HeLa sinyal şiddeti azalır önemli ölçüde hücreleri (Şekil 1B). Eski HMD çözüm ile gerçekleştirilen RdRP reaksiyon da ürünleri (Şekil 1 c) azaltır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Resim 1 : Mitotik HeLa hücrelerde endojen TERT ürünlerin temsilcisi RdRP. IP-RdRP tahlil HeLa hücreleri (A) üç temsilcisi sonuçlarını nocodazole (manipüle) veya (unmanipulated) DMSO ile tedavi. Kimyasal Sentez 34 nt RNA şablon olarak kullanıldı. (B) IP-RdRP tahlil mitotik HeLa hücreleri ile uygun olmayan MNase tedavisi uygulandı. (C) IP-RdRP tahlil taze ya da eski HMD çözüm ile gerçekleştirilen mitotik HeLa hücreleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktifler</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal nükleaz, 20 U/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal nükleaz tampon, 10 x</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su RNase free</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: MNase reaksiyon mix bileşeni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktifler</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çocuklar, % 0.07 (wt/vol)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD çözüm</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0.4 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase inhibitörü, 40 U/µL</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su RNase free</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: RdRP reaksiyon mix bileşeni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktifler</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase bir ribonükleaz, 10 U/µL</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaksiyon tampon, 10 x</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su RNase free</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Ribonükleaz tepki mix bileşeni.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA'ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K Görüntüleme.  National Cancer Center Research Institute. İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA'ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

Video: Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Biyokimya

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Kanser Araştırmaları

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Çevre

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genetik

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan Popülasyonu Çalışmalarında Doğru Telomer Uzunluğu Değerlendirmesi

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Travmanın Hücresel Yaşlanma Üzerindeki Etkisini Keşfetmek

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Radyoaktif Olmayan Kemilüminesans Tespiti Kullanılarak Telomer Uzunluğunun Ölçülmesi

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Yazar Spotlight: TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu