פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לענות על שאלות חשובות לגבי דפוסים עצביים של קישוריות וארגון מרחבי העומד בבסיס התפקוד בתוך מעגל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה של מורפולוגיות עצביות הממוקמות עמוק בתוך רקמה תלת ממדית שלמה. שיטה זו היא פשוטה ולכן ניתן לשחזר בקלות.
לנסיינים בפעם הראשונה צריך להיות נוח לבצע טכניקה זו. זה הכרחי יש דגימת רקמה ברורה על מנת לקבל נתונים באיכות גבוהה. ההדגמה החזותית של בהירות רקמות מתאימה וטכניקות סליקה תאפשר תוצאות ניתנות לשחזור בקלות.
בתור התחלה, הניחו את רקמת המוח השקועה בהידרוג'ל באינקובטור ואקום למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם מינוס 90 קילופסקל ואקום. השאר את החלק העליון של הצינור ללא יצירה כדי לאפשר לוואקום להיווצר כראוי. לשטוף את הרקמה עם PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד עדין.
מניחים את דגימת הרקמה הפולימרית בתא האלקטרופורזה, תוך מעקב אחר כיוון הרקמה בתוך התא. מלאו את התא והמאגר במאגר במאגר ה-SDS האלקטרופורזי שסופק. הפעל את המדגם ב 70 וולט, אמפר אחד, ו 35 מעלות צלזיוס עם זרם קבוע במשך כשעתיים למיליליטר של רקמה.
בדוק את המדגם מעת לעת עבור ניקוי מספיק של רקמת המוח על ידי הסרתו מהתא והחלפתה באותו כיוון. לאחר המדגם סיים ניקוי, לשטוף אותו PBS לילה בטמפרטורת החדר, החלפת PBS עם PBS טרי לעתים קרובות ככל האפשר. לאחר השטיפה הסופית ב- PBS, לשטוף את הרקמה במשך חמש דקות במים deionized בטמפרטורת החדר שלוש פעמים.
הרקמה תהפוך אטומה ועשויה להתרחב. לדגור את הרקמה בתמיסת התאמת אינדקס שבירה במשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לבנות חדר דיור מתאים כדי לדמיין את המדגם.
התחל על ידי שימוש במגלשת זכוכית כבסיס להרכבה, ואז הניח מרווחי גומי או פלסטיק ואבטח אותם עם דבק סופר, ודא שאין חורים. מניחים את הרקמה הצלולה בתא הרכבה מלא מראש בתמיסת התאמת אינדקס שבירה. להרכיב את הרקמה בבטחה על ידי הנחת כיסוי זכוכית על גבי ואיטום אותו עם לק.
תמונה רקמה זו על ידי הוספת טיפה של אינדקס שבירה התאמת פתרון הרכבה ישירות על גבי הזכוכית. כדי לבנות תא הדמיית רקמות גדול עבור רקמות בעובי של יותר מחמישה מילימטר, השתמש צלחת זכוכית 10 ס"מ עם קיר גבוה. מניחים צינור חרוט 50 מיליליטר במרכז, מוודא כי הקוטר של הצינור הוא גדול מספיק כדי לקבל את הקנה של העדשה האובייקטיבית בשימוש.
הפוך 3% agarose במים ויוצקים אותו בחלל שבין צלחת הזכוכית ואת הצינור חרוטי, ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר במשך שעה אחת. זה יהווה טבעת של ארוז מוצק. לדבוק היטב את הרקמה לתחתית התא באמצעות דבק סופר ולמלא את התא עם פתרון התאמת אינדקס שבירה, אשר עשוי להתחיל פילמור אלא אם כן נשמר מהאוויר מאוחסן בארבע מעלות צלזיוס.
השג את התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי. הנח את הדגימה על הבמה.
גש בזהירות למדיית הטבילה במטרה וצור טור מדיה רציף. באמצעות אפיפלואורסצנטיות, למצוא שדה הדמיה מתאים. התחל על-ידי הגדרת הגדרות הרזולוציה ומהירות הסריקה.
אם הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, סגור באופן מלא את חור הסיכה כדי להשיג את החלק האופטי הקטן ביותר ולכן את רזולוציית Z הטובה ביותר. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר או את רווח החיישן עד לקבלת תמונה מתאימה עם יחס אות לרעש גבוה. אם אתם משתמשים בהדמיה סטנדרטית של EGFP או tdTomato בשני צבעים, קבעו את הגדרות אוסף האורים.
הגדר את הפרמטרים מחסנית Z בהתבסס על נקודות ההתחלה והסיום שנצפו של הרקמה. הגדר את גודל השלב בהתבסס על רזולוציית Z הרצויה. גדלי שלבים קטנים יותר יניבו רזולוציית Z גדולה יותר, אך עלולים להוביל להלבנה לדוגמה.
כאשר אתה מרוצה מהגדרות רכישת התמונה, השג את התמונה. ודא שהתמונה כוללת יחס אות לרעש גבוה ומציגה גבולות ברורים של מבנים. לאחר רכישת התמונה, מורפולוגיית התא הייצוגי נותחה באמצעות סטטיסטיקה מוטבעת וסיווג סקריפטים בתוך תוכנת הניתוח.
הנתונים שנאספו משקפים כי נוירון 2 יש מבנה גדול יותר דנדריטי עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים לעומת נוירון 1. כדי לבסס תוצאה זו, בוצע ניתוח שול סטנדרטי, המאשר כי נוירון 2 מורכב יותר מבחינה דנדרית מאשר נוירון 1 כפי שמציין המספר המוגבר של צמתים שול ב 50 עד 100 מיקרומטר מן הסומה. נוירון 1 מכיל חלק גדול יותר של קוצים עם צורות דמויות פילופודיה יותר והוא תת-סוג של עמוד שדרה לא בוגר.
קוצים עם ראשים מוגדרים, הנקראים קוצים פטריות, ככל הנראה מכילים סינפסות מפותחות ובוגרות יותר. לכן, נוירון 2 הוא בוגר יותר עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים בוגרים. לאחר ניקוי, גושי הרקמה יכולים להיות מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה מסורתית.
