המחברים מודים S-Y צ'וי (האוניברסיטה הלאומית Chonnam) על קריאה יסודית של כתב היד והערות יקרי ערך. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית Chungnam.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>בחר אתר הכרה של אנזים הגבלה המתאים (או אתרים) MCS של pEUI(+), subclone את הגן עניין בכיוון הרצוי (איור 1). הערה: ankyrin מתויג epitope EGFP או דגל חזור על תחום 13A transgene (ANKRD13A) היה subcloned EcoRI באתר של וקטור pEUI(+) באמצעות T4 DNA פולימראז ב רצף, מצדו-ללא תלות שכפול השיטה19.</li>
	<li>Linearize את pEUI(+) עם EcoRI עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 ng/µL של לליניארית pEUI(+) עם 40 ng/µL מוגבר-PCR EGFP או ANKRD13A, ולא להגיב עם T4 DNA פולימראז (1 U) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לפני דגירה על קרח במשך 10 דקות להוסיף 10 µL של תערובת התגובה ישירות אל µL 100 של DH10B תאים המוסמכת לשינוי הבאים הניסוי. הערה: למרות אנזים הגבלה במספר זיהוי אתרים נוספו של MCS של pEUI(+) (איור 1B), אנו ממליצים subcloning הגן היעד לאתר EcoRI, באמצעות מצדו תלויית-19,טכנולוגיה-שיבוט-20.</li>
	<li>לאמת את תותב על ידי רצף, ואז לטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור DNA מתאים תרביות תאים.</li>
</ol>2. ארעי תרביות תאים וטיפול טב
<ol><li>להכין ארבעה תאים תרבות מאכלים (קוטר 60 מ"מ) המכיל תאים HEK293 passaged טרי ב 5 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 5-10% סרום שור עוברית (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין µg/mL). להלן, "תא תרבות בינונית" או פשוט "תרבות בינוני" מייצג את DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה. לשמור על התאים HEK293 ב 37 º C.</li>
	<li>Transfect µg 1 של ה-DNA מטוהרים לתוך התאים HEK293 בצפיפות של 50-60 אחוז שימוש µL 3 של ריאגנט תרביות תאים. להוסיף 200 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת התאים HEK-293 על המנה תרבות. השתמש שתי מנות על תרביות תאים, ולהשאיר שני האחרים לא מטופל כפקדים.</li>
	<li>לאחר 12-24 h של תרביות תאים, להוסיף טב (סופי ריכוזים, 0.2 - 10 µmol) לאחד הדגימות transfected וכדי אחד מהפקדים שאינם transfected. יוצאים שני מדגמים אחרים מטופל כפקדי ניסיוני. הערה: הפתרון מניות טב (50 מ"מ מומס דימתיל סולפוקסיד) יכול להיות מדולל תא תרבות בינוני, DMEM או באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב הריכוז המתאים לפני הוספת התאים בתרבית בהתאם לפרמטרים ניסיוני. עם זאת, בשל המסיסות נמוכה של טב ב תמיסה מימית, להימנע הכנת תערובת בסיס עם ריכוז גבוה של טב בינוני; במקום זאת, החלף המדיום התרבות התא מלא בינוני טריים המכילים טב-הריכוז הרצויה.</li>
	<li>לטפח את התאים שטופלו טב ולא טופלו עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>אם את EGFP באמצעות הוספת, לנתח את הביטוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2). אחרת, לקצור את התאים עבור וזמינותו immunoblotting.<ol>
<li>Immunoblotting וזמינותו, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז לגרד אותם החוצה באמצעות המגרד של התא.</li>
		<li>עבור לערום את התאים, ספין למטה יבולים צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).</li>
		<li>לאחר השמטת מגניב לגמרי, להוסיף 0.5 מ של ריאגנט החילוץ חלבון בתרבית של קרח (M-לכל), ביחד עם מעכב פרוטאז (5 µL של 100 x מעכב פרוטאז קוקטייל), בגדר אם התאים מתורבתים בקערה 60 מ מ.</li>
		<li>מחדש להשעות את התאים עם כמה סיבובים של pipetting ולאחר מכן דגירה התאים על תנאי למשך 15 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).</li>
		<li>לסובב את התא lysate ב 21,000 g x 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע מימית לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.</li>
		<li>לנתח את תגובת שיקוע על-ידי immunoblotting, פרוטוקולים סטנדרטיים הבאים נוגדנים המתאימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדור של שורות תאים HEK293 יציב עם אינטגרציה הגנומי של pEUI(+) מתג ג'ין
<ol><li>Transfect µg 5-10 של pEUI(+) מטוהרים עם transgene לתוך תאים HEK293 confluent 50-60% בצלחת תרבות תא בקוטר 90 מ מ, באמצעות µL 15-30 מהתרכובת תרביות תאים. להוסיף 500 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת לתאים HEK-293 על המנה תרבות.</li>
	<li>לאחר תרביות תאים, לאפשר את transfectants לגדול ולהביע את המוצרים ג'ין puromycin-התנגדות מתחת לבינוני תרבות לא בררניים (ללא puromycin) עבור h 24-48-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר ביטול המדיום תרבות, לשטוף את transfectants עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת בינוני תרבות ומחוממת מראש (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 º C.</li>
	<li>מחדש להשעות את transfectants ב 50 מ של תרבות מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת 10 מ"ל של התאים 90 מ מ תא טריים תרבות מנות. התרבות התאים ב 37 ° C עד 50-60% confluency לפני הטיפול puromycin (באופן כללי, זה לוקח כ 24-48 שעות).</li>
	<li>לטפח את transfectants ב 37 מעלות צלזיוס במדיום התרבות תאים בתוספת 3 puromycin µg/mL במשך 3-4 שבועות. במהלך תקופת הבחירה, לשנות את המדיום התרבות התא המכיל את puromycin (3 µg/mL) כל 2-3 ימים כדי לשמור על הלחץ הבחירה. כאשר התאים הופכים באופן מלא confluent, לפצל אותן הפרוצדורות הבאות ב שלבים 3.3-3.4, המכילות puromycin תרבות בינונית. למחוק את התאים הנותרים במדיום תרבות, אם אין צורך. הערה: תנאי הבחירה Puromycin חייב להקים השפעול לסוגי תאים מסוים. היינו 3 µg/mL של puromycin תא תרבות בינוני; זה היה מספיק כדי לגרום מוות של תאים ב- transfected HEK293.</li>
	<li>קציר תאים מן מושבות בודדות, באמצעות צילינדר שיבוט, ובצע הוראות היצרן.<ol>
<li>למחוק את המדיום התרבות תאים. יש לשטוף את הצלחת פעמיים עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS כדי להסיר תאים צף.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים סטרילי, להגדיר את הצילינדר שיבוט על המושבות בודדים.</li>
		<li>להוסיף 0.2 מ של 0.35% טריפסין/EDTA כל גליל.</li>
		<li>דגירה המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה עד התאים תלושים, ולאחר מכן להוסיף כמה טיפות ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני הצילינדרים.</li>
		<li>להעביר את התאים כל גליל בארות בודדים של צלחת 6-ובכן, עם 2 מ של תרבות בינוני, 1 µg/mL של puromycin כל היטב. הערה: כאשר התאים הופכים confluent, קנה המידה של התרבות. עכשיו אפשר להקים clone(s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשמור על שיבוטים בודדים במדיום התרבות תאים בתוספת 1 µg/mL של puromycin.</li>
	<li>אמת מושבות בודדות על-ידי בדיקת את רגישותם טיפול טב (הריכוז הסופי, 10 מיקרומטר) 24 ח' במבחן התגובה של השיבוטים כדי טב על-ידי ניתוח רמת הביטוי transgene עם immunoblotting. בחר שיבוט הרצוי (או שיבוטים). לטפח טב שטופלו ודגימת לא מטופל במדיום תרבות עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס לפני ניתוח הרמה אינדוקציה של transgene. ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene דרך immunoblotting, ביצוע הפרוצדורות בשלבים 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. דלדול של טב
<ol><li>להרוות את הגירויים טב על-ידי החלפת בינוני התרבות התא המכיל טב טב-חופשית בינוני. הערה: מומלץ להחליף התקשורת צמיחה בלי הראשון reseeding את התאים על גבי צלחת תרבות חדשה. טב שיורית מופיע לדבוק המנה פלסטיק וירתקו ביטוי רקע חזק transgene. לפני reseeding את התאים על צלחת תרבות חדשה, יש לשטוף את התאים שנקטפו מספר פעמים עם תרבות בינוני או PBS.<ol>
<li>מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר השמטת את טב המכיל תרבות בינוני, לשטוף את התאים מגורה טב פעמיים עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת ומחוממת מראש ללא טב תרבות בינוני (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g 21,000 x למשך 2 דקות ב 18-25 º C.</li>
		<li>מחדש להשעות את התאים ב- 50 מ של טרום ומחוממת טב ללא תרבות בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת מ של התאים לתוך שלוש מנות תרבות של תא טריים 60 מ מ. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24, 48, 72 שעות בהתאמה.</li>
		<li>לקצור את התאים בנקודות זמן שונות, למדוד את רמת הביטוי transgene באמצעות immunoblotting. הערה: בתנאים אלה ניסויית, הביטוי transgene הפך בלתי מורגשת תרבות שלאחר כ 3 ימים של התאים במדיום נטול טב תרבותית (איור 3). ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene מאת immunoblotting, לפי שלבים 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li><li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+gene+expression+systems.">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li><li>Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatable+lentiviral+system.">Gene regulatable lentiviral system.</a> Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions.">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li><li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch.">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li><li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression.">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li><li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-inducible,+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants.">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies.">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li><li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide:+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues.">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li><li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy.">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li><li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+skin+diseases.">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).</li><li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

יש לנו שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

החיסרון העיקרי של שימוש בבורר ביטוי גנים בינארי הוא הצורך להעביר בו זמנית בשני פלסמידים נפרד (מנהל ההתקן ואת אפקטור) לתוך תא היעד. זה יכול להוביל שוויונית של פלסמידים ולהוביל והתגובה לא עקבי של המתג inducers1,2,3. חסרון נוסף של מערכת דו-וקטור הו?...

מספר הגן שונה מתגי נחקרו על יכולתם לווסת דווקא transgene ביטוי תרבית תאים, מודלים, בדרגות שונות של הצלחה-1,-2,-3 מערכות מתג גנים פוטנציאליים צריך לעמוד בקריטריונים מחמירים שונים, כולל: ביטוי כיווני מדויק של transgene, המינון ותלוי זמן ההיענות inducers, leakiness זניח של האמרגן, הפיכות של transgene הפעלה באמצעות הסרת משרן משרן רמות רעילות נסבלת שורות תאים ו2,1,חיות מעבדה3. מספר מולקולה קטנה inducers נוצלה, כולל טטרציקלין4,5, rapamycin6,7,8,9,mifepristone10, ecdysone11,12,13,14. באופן כללי, מערכות אלו דורשים לפחות שני פלסמידים המכיל שתיים או שלוש יחידות ביטוי דיסקרטית, אחד או שניים מהם לחבר רכיב תקינה (משרן פלסמיד) המאגד של משרן מולקולה קטנה כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק; פלסמיד אחר (אפקטור פלסמיד) המכיל את transgene תחת השליטה של אזור DNA תקינה המאפשרת את הגישה של רכיב מאוגד משרן רגולטוריות. החיסרון העיקרי של מערכת בינארית היא שזה דורש המבוא בו-זמני של שני וקטורים (משרן ו אפקטור) לתוך תא היעד. בניסויים ביטוי transgene ארעי, תרביות תאים בו זמנית של פלסמידים 2 מייצרת באופן בלתי נמנע אוכלוסיה של תאים ביחידים transfected עם משרן או את אפקטור, או שיתוף transfected ושליחותם. בנוסף, השיטה הבינארית מחייב לפחות שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי כדי ליצור שורות תאים יציב, וזו ההגדרה המפורטת. לפיכך, המשלב את כל הרכיבים הדרושים עבור הביטוי transgene, תקנה לתוך וקטור יחידה יהיה אידיאלי להבטיח את הביטוי בו-זמני של כל הרכיבים הנדרשים בתא יחיד ולאפשר ויסות ביטוי transgene דרך הטיפול עם inducers מולקולה קטנה.
כדי להתגבר על החסרונות של ג'ין בינארי מתגים, לאחרונה פיתחנו מתג יחיד ג'ין, באמצעות דרוזופילה melanogaster ג'ין מבוסס-EcR מערכת inducible15. Ecdysone שמתווכת ביטוי גנים כאשר הוא נקשר אל heterodimer EcR/ultraspiracle (USP), אשר בתורו גורם עקידת EcR ה-DNA גורמים רגולטוריים3,11. הקולטן חוליות retinoid X (RXR), ortholog של חרקים USP, מגייס EcR ליצירת מטוס activator תעתיק פעיל16. לפיכך, עבור הביטוי יישוב של transgene חוליות תאים או רקמות, EcR RXR חייב להיות שותף ביטוי בו זמנית לפני להיות מגורה על ידי ecdysone או אגוניסטים שלו. מאז התכונה heterodimeric של הבורר גנים מבוססת-EcR שיכול להיות מושפע אנדוגני RXR רמה, Padidam et al. מוחלף על התחומים EcR DNA מחייב והפעלה heterologous GAL4 DNA מחייב, vmw65 חלבון וירוס הרפס סימפלקס (VP16) הפעלת תחומים דבוקה התחום מחייב ליגנד EcR, אשר לאחר מכן הפך להגיב RXR אנדוגני, נוצר homodimer של כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק17. הבורר גנים מבוססת-EcR היה עוד יותר משופר על ידי בניית חלבון chimeric מורכב תחום הפעלה VP16 מינימלי, בשילוב עם GvEcR, אשר נוצרו homodimer מקומית ציטוזול בהיעדרו של ecdysone אגוניסט, טב16, 18. באמצעות קשירה טב, GvEcR שונה לוקליזציה subcellular שלה ציטוזול את הגרעין לזהות מקדם היברידית מורכבת דג זברה E1b יזם מינימלי בשילוב זוגיים עשר חזר על הפעלת במעלה רצפים (UASs) ליזום שעתוק של ה-ג'ין היעד16.
כדי לפשט את הגן מבוססת-EcR שדווחה בעבר מפסיקים16,18, שילבנו בין התכונות בינארי של המערכת לתוך וקטור יחידה מצויד עם כל הרכיבים הנדרשים עבור מגרה transgene ביטוי ולאחר מכן המיועד הווקטור החדש שנוצר, pEUI(+) (מספר גישה GenBank: KP123436, איור 1A)15. אפקטור להגיב על הנהג GvEcR (להלן-התקן) מורכב טנדם עשר UAS חוזר ליד יזם מינימלי E1b ואחריו אתר שיבוט מרובים (MCS) עם רצפי זיהוי EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII (איור 1B). בנוסף, כדי להקל על הבחירה של transfected תאים, puromycin מונחה יזם Nשל SV40-אצטיל-טרנספראז (PAC) ג'ין הושם בין האזורים אפקטור ונהג כדי לשמור על שורות תאים יציב (איור 1).
אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור אפנון ארעית ויציבה של הביטוי transgene תוך שימוש pEUI(+). בנוסף, אנו מספקים הוראות מפורטות לשימוש מוצלח של טב כמו אגוניסט ecdysone.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>The patent license was transferred to TransLab Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein&lt;br/&gt; Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

שליטה מדויקת של הביטוי transgene רצוי במחקרים ביולוגית וקלינית. אולם, בגלל התכונה בינארי של מתגים ג'ין מועסקים כיום דורשת ההעברה של שתי יחידות טיפוליות ביטוי במקביל לתא בודד, היישום המעשי של המערכת עבור ריפוי גנטי הוא מוגבל. כדי לפשט את המערכת ביטוי transgene, יצרנו מתג ג'ין כמנהל pEUI(+) המקיף ערכה מלאה של מודולי ביטוי transgene וקטור יחידה. הכוללת של התחום מחייב GAL4 DNA, ששונה EcR (GvEcR), תחום הפעלה מינימלית VP16 התמזגו עם תחום מחייב GAL4 DNA, כמו גם קולטן ecdysone דרוזופילה ששונתה (EcR), המתג פיתח גן מיוחד במינו הוא מאוד מגיבים אדמיניסטרטיבי משרן כימי באופן זמן ותלוי במינון. וקטור pEUI(+) הוא כלי רב עוצמה פוטנציאל לשיפור השליטה של הביטוי transgene המחקר הביולוגי והן מחקרים קליניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור אפנון של ביטוי transgene ארעית ויציבה באמצעות וקטור pEUI(+) על ידי הטיפול של tebufenozide (טב). בנוסף, אנו חולקים חשוב הנחיות השימוש של טב משרן כימי.

הבורר מבוססי GvEcR ג'ין יחיד מתואר באיור 1A. וקטור pEUI(+) היה אופטימיזציה עבור הביטוי transgene מוסדר על ידי הטיפול עם טב. האזור אפקטור של pEUI(+) מורכב 10xUAS E1b יזם מינימלי ואחריו MCS המכיל אתרי זיהוי אנזים ההגבלה EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII. אות poly(A) SV40 נוספה מאחורי MCS (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Views.  Chungnam National University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Video: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Developmental Biology

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunology and Infection

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Bioengineering

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

סינתזה והקרנה של גורמי שעתוק הופעל כימי עם כתבים המבוסס על ה-GFP מהיר

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Biology

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www.jove.com/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

ביטוי גנים מבוסס מערכת מושרה Tet-On ב- Vivo: מערכת ביטוי גנים המושרה על ידי טטרציקלין להפעלת שעתוק גני מטרה במודל עכבר

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...