שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח במגוון רחב של תחומים הדורשים אי-הפעלה מותנית וחולפת של גן מעניין על-ידי הבעת יתר של גרסה שלילית דומיננטית שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רק אבלציה חלקית בפעילות החלבון, ובכך, שמירה על ביטוי אנדוגני שיורית. אמנם, כאן אנו מתארים את חוסר ההפעלה של חלבון RB, אשר פועל בהרכבה רב-מרתית, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם חלבונים מונומריים.
אומש פייקורל, טכנאי המעבדה שלנו וממחברי שותף בכתב היד ידגימו את הנהלים. כדי להתחיל, לגדל תאי NIH3T3, בעקבות מפרטי הספק, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, באמצעות מדיום תרבות התא המומלץ המכיל 10% סרום חזיר עוברי. כדי להדביק את התאים באמצעות pTet-Splice ו- pCMV-Tet3G וקטורים, תחילה לערבב שניים עד ארבעה microliters של רייגנט transfection מבוססי השומנים לגם, ומיליליטר אחד של DMEM שלם לגם בצינור 15 מיליליטר, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף שניים עד שלושה מיקרוגרם של דנ"א פלזמה לגם לתערובת DMEM של ריין transfection זה. מערבבים ו מודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של התערובת המכילה DNA ואת reagent transfection ב DMEM לכל באר של צלחת שש באר עם תאי NIH3T3.
לאחר שלוש עד ארבע שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם. לאחר מכן, להוסיף 2 microliters של מלאי דוקסיציקלין לכל באר ולסמן את הצלחת כמו פלוס דוקסיציקלין. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
כדי להעריך את הפונקציונליות של מבנה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בקידום התפשטות תאים לא מתוכננת, תאי HEI-OC1 תרבותיים ב- DMEM המכילים 10%FBS, בתנאים מתירניים. עבור מחקרים על התפשטות תאים, ספור את תאי HEI-OC1 באמצעות מונה תאים. לוח 10, 000 תאי HEI-OC1 ל באר על צלחת 96 באר ב 200 microliters של נפח כל אחד.
דגירה התאים במהלך הלילה ב 33 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. כדי לגרום לביטוי טרנסג'נדר, הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין לתת-קבוצה של תאי HEI-OC1 מנוקד. השתמש בקבוצה המשנית האחרת המסווה כ- minus-doxycycline ותאי HEI-OC1 שאינם מנוקד כפקדים, והדרגר את התאים כ- 33 מעלות צלזיוס עם 10%CO2.
כדי להעריך את התפשטות התאים, 48 שעות לאחר ההטמקה, הסר את מדיום תרבות התאים והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון כריכת צבע 1x מערכת התפשטות תאים לכל באר של המיקרו-צלחת. בצע את פרוטוקול היצרן ואת הדגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא מיקרופלסטיק פלואורסצנטי כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל מדגם.
כדי להעריך עוד יותר את התפשטות התא באמצעות אימונוציטוכימיה, צלחת תאי HEI-OC1 על זכוכית כיסוי להציב בכל באר של צלחת 12 באר ב DMEM. דגירה התאים לילה ב 33 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, cotransfect לתאים בשתי בארות עם pTet-Splice ואת וקטורים pCMV-Tet3G, ולאחר מכן לבצע את הטיפול דוקסיציקלין על אחד גם נעשה עם תאי NIH3T3.
השתמש אחד לא מושלם גם כמו פקד. כדי לעבד את התאים לתיוג Ki-67, תקן אותם עם 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח במשך חמש דקות כל אחד.
הוסיפו 0.25% חומר ניקוי לא יוני ב-PBS, והדקירה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש בסרום 10%כדי לחסום את התאים.
בתא לח למשך שעה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של Ki-67 ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד.
מוסיפים מיליליטר אחד של הנוגדן המשני ומדרגים את התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הסרת פתרון הנוגדנים המשני, לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS בחושך. כדי לתייג את תאי HEI-OC1 עם פאלודין, דגירה אותם 1:200 פאלודין במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
כדי לתייג את גרעיני התא, דגירה התאים עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מסירת העכברים הטרנסג'נדרים, גנוטיפ הגורים באמצעות סט פריימר ספציפי לאזור ההיתוך CBRb1 כמתואר בכתב היד. לגדל בוגרים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 עכברים כדי ROSA-CAG-rtTA ו tetrecycline inducer קו כדי ליצור עכברים ניסיוניים DN-CBRb, ו genotype צאצאיהם כמתואר בכתב היד.
NIH3T3 אינו מבטא חלבון RB1 אנדוגני, כך ביטוי RB1 חזק לראות כאן נובע אינדוקציה מהומר בנוכחות דוק, אבל לא בהיעדרו, המאשר את ההפעלה היעילה של TetO-DN-CB-myc6-Rb1 לערבב RB1 לבנות. לעומת זאת, לתאי HEK293 יש ביטוי RB1 אנדוגני. התוספת של דוקסיציקלין הובילה להפעלת TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ורגולציה למטה RB1.
ביטוי RB1 חודש 21 שעות לאחר שהדוקסיציקלין הוסר מהמדיה. תאי HEI-OC1 המופקים באותם וקטורים, הציגו עלייה צנועה אך משמעותית במספר התאים בעקבות טיפול דוקסיציקלין בהשוואה לתאים מנוטרלים שאינם מטופלים ב דוקסיציקלין, והתאים הלא סלולים. פלואורסצנט בהכלאה סיטו אישר את החדרת הגנומי של TetO-DN-CB-myc6-RB1 מהמר בעכברים.
הייתה עלייה ראשונית בביטוי החלבון הכולל של RB1 ב cochlea של העכברים המהוהרים שטופלו ב דוקסיציקלין במשך שלושה ימים בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, בקבוצות שטופלו בדוקסוסיקלין במשך שבעה ו -10 ימים, נצפתה ירידה משמעותית בביטוי RB1. ללא קשר לרקמה שנותחה, ירידה משמעותית בחלבון RB1 נצפתה בעכברים מהודקים שטופלו בדוקסוסיקלין, אך לא בקבוצת הביקורת, המאשרת את יעילות המבנה TetO-DN-CB-myc6-RB1.
בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לוודא שכל אחד מרכיבי הקידוד של הטרנסג'ין נמצאים במסגרת זה עם זה. אם אזורי הקידוד של Cathepsin B ו רטינובלסטומה המתוארים בדו"ח זה היו, במקרה, מחוברים מחוץ למסגרת, זה לא היה מניב את חלבון ההיתוך המיועד. לכן, אימות רצף DNA חייב להיעשות לפני הזרקת הטרנסג'ין לעוברים עכבר חד-תאיים.
בעקבות הליך זה, מקדם CAG בכל מקום יכול להיות מוחלף עם מקדמים ספציפיים על מנת ללמוד תפקוד גנים באופן ספציפי של התא.
