이 작품 몬산토 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 되었다, NCSU에서 MDL 번호 AG/1005 (MDL을 YC) 및 시작 자금 부여. FC 몬산토의 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램 (AG/1005)와 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 부여 번호 MCB-1244772 (MDL). 저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다. FC 및 MDL 잉태와 설계 실험; FC, 비밀 번호 및 SP 수행 실험; FC 및 MDL 분석 결과; 그리고 FC, NG 및 MDL 원고를 썼다. 우리 감사 테레사 오리 어 리, 윌리엄 Klobasa, 그리고 스테파니 고르 WCR 심사에서 그들의 전문가 도움. 우리는 또한 양육 프로토콜을 제공 하 고 실험실 식민지를 설치 하는 계란의 출하에 대 한 박사 웨이드 프랑스어 (미국 농 무부-ARS, 북쪽 중앙 농업 연구소, 브루킹스, SD) 감사 합니다.

1. 식민지 수준 WCR 성인의 양육
<ol><li>충분 한 양의 WCR 성인 구하는 (500-1000)에서 신뢰할 수 있는 회사 또는 연구 실험실 ( 테이블의 자료 에 대 한 참조 예) 30cm3 장에 배치. 참고: 비-diapausing 긴장의 사용이 좋습니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜을 따르고 WCR 인공 다이어트 준비 하 고 38 온스 컨테이너 1 cm 두꺼운 레이어를 붓고 ( 재료의 표참조). 혼합 후, 최대 2 개월까지 4 ° C에서 사용 하지 않는 다이어트를 저장 합니다.</li>
	<li>30cm3 케이지에 성인 다이어트 (10-15 g) 페 트리 접시 (100 x 15 m m)를 넣어. 음식이 부족 하거나 건조 할 때 더 많은 다이어트를 추가 합니다.</li>
	<li>물 소스로 봉사 하 면 롤 (6 "x 3/8"), 장소에서 개최 하는 데 사용 되는 면봉으로 덮여 물 플라스 크 (300 mL)을 넣어. 그것은 부족 하면 물을 변경 합니다.</li>
	<li>WCR 습도 60%와 26 ° C에서 유지 하 고 14:10 빛 인큐베이터 양육 곤충에 주기.</li>
</ol>2. 배아 수집 및 정렬
<ol><li>1% 한 천은 물에을 사용 하 여 살 균 100 x 15 m m2 페 트리 접시에에서 달걀 수집 챔버를 확인 합니다. agar 굳은 후 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>새로 놓인된 달걀을 수집, 필터 종이, 한 천 (그림 1A)의 표면에 투박한 (크기 각 컷)의 4 층에 의해 다음의 단일 레이어를 놓습니다. 참고: 투박한 다시 사용할 수 있습니다, 후 표 백제에 세척 하 고 압력가, 하지만 그것은 처음 사용을 위해 이것을 할 필요가 없습니다. 필터 종이 재사용 되지 않을 하 고 살 균 될 필요는 없습니다.</li>
	<li>계란 컬렉션 접시 WCR으로 가능 (작업 일의 끝)으로 하루에 늦게 놓고 은박지 텐트와 함께 커버 합니다. 하룻밤 둡니다. 실험실 직원으로 늦은 밤 컬렉션 챔버를 필요 없이 microinjection에 대 한 젊은 계란의 수집을 촉진 따라서 참고: 데 불 오전 10 시에서 오전 12 시 (14 h) 지연 달걀 누워.</li>
	<li>약 8 또는 오전 9 시부터 계란 수집 약 실 제거</li>
	<li>집게를 사용 하 여 투박한의 1 층의 물 비 커 (500ml)에 장소와 시간에 데리 러. 부드럽게 (그림 1B 및 1 C) 교 반에 의해의 투박한 계란을 세척.</li>
	<li>전구 피 펫을 사용 하 여 다른 비 커 (500ml) 물에 계란을 전송. 계란을 청소 2-3 배를 반복 합니다.</li>
	<li>필터 종이 (그림 1D)에 계란을 전송 전구 피 펫을 사용 하 여 물 수행의 양을 최소화 하면서.</li>
	<li>단단히 되도록 슬라이드에 검은 필터 종이 테이프를 유리 슬라이드 너비 스트립으로 잘라 종이 평면 (그림 2A) 낳는다. 참고: 검은 필터 종이 반사 된 빛의 양을 줄여 현미경 가시성을 향상 도움이 됩니다.</li>
	<li>비-독성 접착제를 적용 (예를 들어에 대 한 재료의 표 참조) 단서 (그림 2B)에 필터 종이에. 접착제 라인 유지 되지 않도록 접착제 코팅 계란 달걀의 직경 보다 얇은.</li>
	<li>좋은 브러시를 사용 하 여 부드럽게 이동 WCR 계란 하나에 의해 그들의 필터 종이에서 접착제 라인. 접착제에는 알을 낳 기 전에 그것을 밖으로 건조 하 고 각 계란 사이 적어도 1 개의 계란의 거리를 유지.</li>
	<li>하나의 필터 종이 슬라이드 (그림 3)에 계란의 여러 줄을 배치 하 여 주입 효율을 극대화 합니다.</li>
	<li>후 모든 계란 필터 종이에 뻗어 있다, 모든 접착제 microinjection 전에 건조 때까지 기다립니다. 참고: 생식 변환 및 편집 CRISPR/Cas9-중재 게놈 주사 모든 배아 정오 (12 시)에 의해 가장 오래 된 배아는 19 h 더 이상. 그러나, RNAi에 대 한 제한은 없는 시간 WCR에 dsRNA 셀 사이 이동할 수 있기 때문 에입니다. 사실, RNAi, 노화 배아 더 나은 생존 율에서 발생할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 플라스 미드 DNAs와 주사 바늘의 준비
<ol><li>내 무료 광고를 사용 하 여 높은-품질 supercoiled 플라스 미드 DNA 준비 키트 (예에 대 한 재료의 표 참조).</li>
	<li>주입 솔루션을 준비 하려면 각 플라스 미드의 농도 확인 하 고 도우미 플라스 미드 (250 ng / µ L 최종 농도), 기증자 플라스 미드 (750 ng / µ L 최종 농도) 및 페 놀 레드 버퍼 (최종 농도 20%)를 결합 합니다. 소용돌이 솔루션 짧게 하 고 바늘을 방해할 수 있는 입자 침전을 최대 속도에서 3 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>붕 규 산 유리 바늘 (마약 1 mm, 아이디 0.58 m m, 10 cm 길이)를 당겨 불타 는/브라운 유형 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 저장, 페 트리 접시 또는 다른 분명 컨테이너에 이중 면 끈끈한 테이프에 가져온된 바늘을 보안 합니다. 참고: micropipette 끌어당기는 시스템에 대 한 설정을 사용 했다: 열 335, FIL = = 4, 벨 = 40, 델 = 200, 풀 = 100.</li>
	<li>백필 마이크로 로더를 사용 하 여 주사 바늘 팁 ( 테이블의 자료를 참조) 피펫으로 0.5-1.0 µ L 아래로 테이퍼 끝부분 바늘 내부. 발생 하는 경우는 바늘의 팁에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>부드럽게 집게의 좋은 쌍을 함께 하거나 부드럽게 터치/드래그 coverslip 또는 유리 슬라이드에 팁으로 바늘의 팁을 엽니다. 참고:는 목표는 아직도 주입 혼합 밖으로 나올 수 있도록 작은 개방 (작은 구멍 일반적으로 더 높은 주입 압력을 필요로). 이후 그들은 이미 열려 경사진된 바늘이이 단계를 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>4. microinjection 및 포스트 주입 치료
<ol><li>좋은 페인트 브러시를 사용 하 여 신중 하 게 살 균 물으로 1-3 계란의 표면에 젖은, 바늘, 넣고 솔루션을 주입 합니다. 표면 건조 하기 전에 각 계란을 주사. 찾습니다 모양 달걀 안에 붉은 색의 작은 금액을 성공적인 microinjection을 가리키도록 주입 하는 동안. 분쇄 또는 손상, 빈, 또는 그렇지 않으면 주입 수 없습니다 모든 계란을 제거 합니다. 참고: 비록 사출 압력 바늘 구멍 크기에 따라 다릅니다, 10-13 psi 좋은 출발점입니다.</li>
	<li>모든 계란은 주입 후 유리 슬라이드에서 필터 용지를 제거 합니다.</li>
	<li>(위에서 설명한) 1% 한 천은 접시의 표면에 필터 종이 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화를 사용 하 여 요리를 봉인 하 고 12 일 동안 인큐베이터 양육 26 ° C 곤충에 넣어. 참고: 파라핀 영화 요리 사이 형의 교차 오염을 방지 도움이 됩니다. 그러나, 금형 및 박테리아의 성장을 방지 하기 위해 다른 치료는 주입 된 배아의 생존을 줄일 수 있습니다.</li>
</ol>5. 배양 및 배아의 부 화
<ol><li>태아 12 일 후 주입 새로 부 화 애벌레에 대 한 검사를 시작 하 고 2 주 동안 매일 계속.</li>
	<li>애벌레, 부 화 한 옥수수와 토양 양육 상자에 좋은 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 참고: 형 한 접시에 성장 수 있습니다 하지만 애벌레 여전히 대부분의 경우에 해치 것입니다. 신중 하 게 모든 그들을 잡으려고 금형 내에서 애벌레를 찾고 있습니다. 일부 애벌레 수 접시의 뚜껑을 이동한 결로에 갇혀 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>다음 표준 WCR 양육 방법2526 ° C에서 애벌레 후면.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

비록 dsRNAs RNAi 목적으로 WCR의 microinjection 보고9, 이것이 microinjecting precellular WCR 배아 생식 변환 수행을 위한 중요 한 과정에 대 한 우수 사례를 확립 하는 첫 번째 프로토콜 및 CRISPR/Cas9 게놈이이 종에서 편집입니다. WCR 배아의 성공적인 microinjection 변환 효율성은 여러 요소에 따라 달라 집니다. 아래는 몇 가지 주요 문제에 영향을이 프로토콜을 사용 하 여 생식 변혁이이 딱정벌레?...

서 부 옥수수 rootworm (WCR) Diabrotica virgifera virgifera, 옥수수1의 중요 해충 이다. 흥미롭게도, WCR 제어를 극복 하기 위해 표시 됩니다 그들은 뿐만 아니라 적응 뿐만 아니라 순수 행동2,3,,45, 이후 가장 농업 해충 보다 더 빠르게 측정 6. 지난 10 년간, RNA 간섭 (RNAi), 강력한 기능 게놈 도구 WCR7,8에 대 한 잠재적인 제어 방법으로 조사 되 고 유전자 기능9공부 하는 수단으로도 사용 되었습니다. 그러나, RNAi 다른 종에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 microinjection에 의해 자주 수행 하는 동안 주입 기반 RNAi WCR에 드문 경우입니다. 사실, 몇 가지 보고서만 RNAi 통해 microinjection dsRNA의 WCR9에 있다. 이유는 심지어 어머니11dsRNA를 먹이로 미 발달 효과의 연구를 허용 하 게 되는 높은-수준의 유전자 때 려 눕 힘 을 통해 섭취 dsRNA7,10, WCR에 달성할 수 있다. 이 방법을 만드는 동안 WCR 기능 게놈 분석 통해 RNAi를 위한 우수한 주제, 그것은 배아 microinjection이 수이 종에 대 한 방법론의 개발 진행을 둔화 했다.
RNAi의 힘에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어 모든 유전자 RNAi를 동등 하 게 응답합니다. 이 변화는 더 어려운 기능 유전체학 시험의 결과 해석 할 수 있습니다. 또한, RNAi는 일시적 이며 상속 돌연변이 생성 하지 않습니다. 다른 한편으로, 생식 변환, 다른 기능 게놈 도구, 상속 돌연변이 통해 삽입 표시 transposable element의 게놈12,13으로 생성할 수 있습니다. 이것은 생식 변환 장기 유전 연구에 사용 하기 위해 돌연변이 종자를 만들기 위한 훌륭한 도구. 변환 돌연변이 게놈14에 유전자의 기능 복사본을 제공 하 여 돌연변이 구출 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 생식 변환 다양 한 분자 유전 기법의 초석입니다. 밖으로 노크 및 유전자 기능 구조, 뿐만 아니라 생식 변환 증강 트래핑15, 유전자 트래핑16, Gal4 기반 소성 식17, 및 게놈 넓은 mutagenesis18사용할 수 있습니다.
더 최근에, 정교한 게놈 편집 사용할 수 있는 도구 개발 되었습니다. 이러한 도구에는 전사 Activator-Like 이펙터 Nucleases (TALEN) 및 CRISPR/Cas9-nuclease 시스템19,20포함 됩니다. 이러한 새로운 도구의 장점은 그들은 거의 모든 게놈 내의 거의 모든 위치에서 이중 가닥 DNA 휴식을 유도 하는 능력 연구원을 제공. 삭제 또는 타겟된 유전자에 삽입 발생할 수 있습니다, 어느 비 동종 끝, 또는 상 동 감독 수리, 설계 구축 존재 촉매 수 있습니다 통해이 나누기를 복구할 수 있습니다 유발, 일단은 전체 유전자 또는 유전 지역21,22의 교체. 그러나, 이러한 방법을 사용 하려면 아주 어린 배아로 DNA, RNA 및 단백질의 microinjection.
중요 한 것은, RNAi, 핵 산 및 단백질 생식에 대 한 사용 사용 dsRNAs 달리 변환 및 게놈 편집 교차할 수 없습니다 쉽게 세포 막. 따라서, 플라스 미드 DNAs, mRNAs, 단백질의 microinjection syncytial blastoderm 단계 (즉 곤충 태아 cellularizes 전에) 자리를 차지할 해야 합니다. 이것은 주사의 타이밍 중요 한 요소. 예를 들어 초파리 melanogaster, 배아 달걀 누워12후 2 시간 이내에 주입을 해야 합니다. 따라서, 여성 달걀 누워, precellular 배아의 충분 한 수량을 수집 하기 위한 가장 좋은 방법에 대 한 최상의 조건 WCR에 대 한 성공적인 배아 microinjection 프로토콜의 개발 계정에 취해야 합니다.
다양 한 분자 유전 도구 WCR 생물학에 대 한 부담을가지고 노력 수집 및 microinjecting precellular WCR 배아에 대 한 방법을 개발 해야 합니다. 여기 우리 WCR 연구에서 변환 기반 기술을 사용 하 여 다른 사람들을 돕고 팁과 트릭, 함께 자세한 지침을 제공 합니다. 기능적 게놈 연구에 사용 하기 위해 유전자 변형 기술을 WCR 연장, 뿐만 아니라 이러한 기술 또한 테스트할이 경제적으로 중요 한 유전자 드라이브23,24 등 강력한 새로운 해충 제어 전략 사용 해충입니다.

<table><tbody><tr><td>Qualitative Filter Paper (Black)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>For egg microinjection</td></tr><tr><td>1 oz Containers&amp;nbsp;</td><td>Anny&#039;s Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Egg container</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrate for WCR egg-laying dish</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps&amp;nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Handling larvae and pupae&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Wash corn and dishes</td></tr><tr><td>Trucker&#039;s Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Corn for feeding WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (Homemade)</td><td>NA</td><td>Parts &amp;amp; instructions available upon request</td><td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer&#039;s Non-toxic Glue</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Glue eggs on filter paper</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Backfilling needle loading tips</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Wash dishes</td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td><td>Frontier Agricultural Sciences&amp;nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR adult artificial diet</td></tr><tr><td>Cotton Balls, Large</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Close the flask</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Collect and transfer eggs</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>WCR screening</td></tr><tr><td>DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Excitation filter: 440&amp;ndash;520 nm, emission filter: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage for adult colony</td></tr><tr><td>Miniature Paint Brush</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulator and needle holder</td></tr><tr><td>Microscope XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>For egg-lay</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film&amp;nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Incubator</td><td>Percival&amp;nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td></tr><tr><td>Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Water container for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>For egg wash</td></tr><tr><td>Braided Cotton Rolls</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Use in water supply for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>For diet plates</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Microinjection buffer</td></tr><tr><td>Laser-based Micropipiette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Topsoil</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Soil for cron growing</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR single pair mating chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larvae rearing box/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larvae rearing box/16 oz</td></tr><tr><td>Microinjection Scope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Microinjection needles</td></tr><tr><td>Adult Western Corn Rootworms</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Request from Dr. Bryan Wade French&#039;s lab</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td></tr></tbody></table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

서양 옥수수 rootworm (WCR) 옥수수의 중요 한 해충 이며, 해충 관리 전략에 빠르게 적응 하는 능력으로 잘 알려져 있다. RNA 간섭 (RNAi) WCR 생물학 공부를 위한 강력한 도구가 될 수 입증 하고있다, 그것은 한계가 있다. 특히, RNAi 자체는 일시적 (즉 귀착되 지 않는다 관련 된 표현 형의 장기 Mendelian 상속), 그것은 대상 유전자의 DNA 순서를 알고 필요 합니다. 후자 수 수 제한 관심의 표현 형이 제대로 보존 하 고, 또는 심지어 새로운 유전자에 의해 제어 되는 경우 유용한 목표 식별 도전 될 것 이라고, 때문에 불가능. 따라서, 안정적인 돌연변이 체 긴장을 만들고 WCR 게놈의 순서에 관계 없이 조사를 활성화 하는 데 사용할 수 있는 방법의 개발에 의해 WCR의 게놈 도구 상자에서 도구 수를 확장 한다. 여기, 우리가 수집 하 고 핵 산와 precellular WCR 배아를 microinject 하는 데 사용 하는 방법 자세하게. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 변형 WCR의 생성을 위한, 그러나 CRISPR/Cas9-게놈 편집 수 또한 수행 유일한 차이 배아에 주입 하는 솔루션의 구성 되 고 동일한 프로토콜을 사용 하 여.

이 프로토콜을 개발할 때 중요 한 고려 사항은 microinjection의 때에 미 발달 발달의 단계 이었다. 특히, 생식 변환 배아 cellularization 이전 DNAs의 microinjection를 요구 한다. DNAs 쉽게 세포 막을 교차할 수 없습니다 때문입니다. WCR 배아 개발 핵 얼룩을 사용 하 여 단계를 시각화 하는 시도 dechorionation WCR 배아의 기본적으로 모든 태아의 무결성에 대 한 책임 보호 막을 녹이 고 때문?...

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

7.4K 조회수.  North Carolina State University. 여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

연구

유전학

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

행동분석학

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

발생학

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

생체공학

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

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