TO ו- TD נתמכו על ידי JSPS KAKENHI מענק מספרים 19H02970 ו 20H02999, בהתאמה.

1. תחזוקת מושבות מעבדה
<ol><li>לשמירה על אוכלוסיות של דגים מלאכותיים ומוטנטים, השתמשו במיכל פלסטיק גדול (460 מ"מ x 360 מ"מ x 170 מ"מ) עם מזון דגים מלאכותי רגיל, מים ב כוסות פלסטיק עם חור אוורור בחלקו העליון, נייר מקופל להסתרת החרקים וכותנה שכבתית להטלת ביצים (איור 2A). שמור את כל תרבויות T. domestica בתוך 37 °C (70 °F) חממות ולהגדיר את הלחות היחסית (RH) בתוך כל מיכל ל 60%-80%. הערה: מכיוון ש- T. domestica סופג אדי מים מהאטמוספירה11, אין צורך באספקת מים ישירה. RH המתאים נשמר בשל נוכחות של אדי מים מכוסות פלסטיק המכיל חור אוורור בחלק העליון או כוסות lidless בתוך כל מיכל. אין צורך לחות בתוך אינקובטור שלם המכיל תרבויות. משך הזמן המשוער של כל שלב התפתחותי בתנאי המתואר בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. המהירות ההתפתחותית יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי הטמפרטורה ו / או RH12.</li>
	<li>מוסיפים אוכל מעת לעת. מוסיפים מים לפני שהם מתייבשים.</li>
	<li>להעביר את האוכלוסיות למיכל נקי חדש לפחות כל 3 חודשים בהתחשב בכך שמבוגרים מפסיקים להטיל ביצים בסביבה מלוכלכת ו / או אוכלוסייה צפופה (ראה דיון).</li>
</ol>2. איסוף ביצים ומיקרו-יין
<ol><li>עיצוב RNA מדריך (gRNA)<ol>
<li>תכנן רצף gRNA עבור כל מטרה נדרשת ופוצץ את רצפי gRNA נגד הרכבת הגנום כדי לבדוק אתרי זיהוי אפשריים מחוץ ליעד.</li>
		<li>לסנתז ולטהר את gRNAs על פי הוראות היצרן8. הערה: כדוגמה, במקרה של מיקוד הגן הלבן טרנספורטר קלטת מחייב ATP, רצף יעד 20 bp תוכנן ושני אוליגונוקלאוטידים DNA מסונתז 5 '-TAATACGACTCACTACTTAGTAGTGTGGGAC-3' ו 5'-TTCTAGCTCTAAAAכתא-3' הוזמנו. תבנית הדנ"א הוכנה על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים אלה ואחריו הגברה PCR ואת gRNA הוא אז במבחנה מתמלל מן התבנית עם פולימראז T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מושבות איסוף ביצים<ol>
<li>העבירו כ-20 גברים ו-20 נשים מבוגרים למיכל בגודל בינוני (200 מ"מ x 150 מ"מ x 90 מ"מ) עם מזון, אספקת מים, נייר מקופל וחתיכת כותנה שכבתית קטנה להנחת ביצים (איור 2B).</li>
		<li>להקים מספר מושבות כדי לקבל מספר גדול של עוברים מבוימים בפרק זמן קצר כדי לשמש לעריכת גנום. הערה: כ-20-40 ביצים צפויות להיאסף ממושבה לאחר 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בדרך כלל לוקח כמה ימים למבוגרים שהועברו להתחיל להטיל ביצים, אולי בגלל הסתגלות לסביבה חדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>ביום ההזרקה, להחליף את הכותנה בתוך המיכלים עם חדשים.</li>
	<li>הנח סרט דו-צדדי בגודל 76 מ"מ x 5 מ"מ על שקופית זכוכית רגילה של 76 מ"מ x 26 מ"מ.</li>
	<li>שמונה שעות לאחר מכן, לאסוף את הביצים מן הכותנה שכבתית על ידי הפרדת השכבות באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>מיישרים את הביצים על הסרט הדו-צדדי באמצעות מברשת צבע רטובה ושומרים על מרחק של 2 מ"מ בין הביצים. יש לכוון את כל הביצים כך שציר הביצה האורך יפונה לצד ההזרקה(איור 3A). לחץ בעדינות על הביצים עם מברשת צבע להחזקה מוצקה במהלך ההזרקה. הערה: בפרוטוקול זה, הפטרייה גדלה במהירות בביצים מוזרקות פגומות במצב רטוב וחם. חשוב לשמור על המרחק בין הביצים כדי למנוע זיהום צולב והתרחבות הפטרייה.</li>
	<li>מערבבים את חלבון gRNA ו- Cas9 לריכוז סופי של 100 ננוגרם/μL ו- 500 ng/μL, בהתאמה. השתמש במים מזוקקים לדילול. דגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקדם היווצרות מורכבת ריבונוקלאופרוטאין ולאחר מכן לשמור את התערובת על הקרח. הערה: אדום ניטרלי בריכוז סופי של 1% ניתן להוסיף לפתרון ההזרקה כדי לפקח על הכמות מוזרקת.</li>
	<li>טען 2 μL של פתרון gRNA / Cas9 נימי הזרקת זכוכית עם microloader. ודא שאין בועות אוויר בתמיסה לפני ההזרקה. במידת הצורך, הקש על המחט כדי להסיר את הבועות. הערה: בניסוי זה, מחט מוכנה משמשת לקבלת קצה מחט עדין (איור 3B). מחט תוצרת בית עם צורה דומה יכול לשמש במקום.</li>
	<li>לתקן את נימי הזרקת זכוכית, טעון בעבר עם הפתרון gRNA / Cas9, למחזיק מצויד מניפולטור ולחבר את המחזיק microinjector אלקטרונית.</li>
	<li>מטב את צורת קצה המחט על ידי שבירתו מעט במלקחיים כדי למנוע סתימה ועמידות טובה יותר לאורך סדרה של זריקות (דוגמה למחט מתאימה מוצגת באיור 3C). הערה: מומלץ להחליף מחט כאשר היא סתומה. אפשר להמשיך להזריק עם אותה מחט אם הוא שבור שוב עם מלקחיים, אבל טיפ רחב יותר מוביל יותר נזק לביצה ומוריד את שיעור ההישרדות שלהם. כמו T. ביצים מקומיות הם רכים ושבירים, שמירה על קצה מחט בסדר הוא המפתח שיש שיעור הישרדות גבוה לאחר הזרקה.</li>
	<li>הכנס את המחט לנקודת האמצע של ציר האורך של ביצה והזרק כמות קלה של הפתרון (ראה איור 3D-H לעיון בכמות ההזרקה). להתאים את התצורה של microinjector אלקטרונית במהלך ההזרקה, בהתאם לצורת קצה המחט. הערה: מומלץ להפעיל לחץ מתמיד במהלך ההזרקה, אחרת תכולת ביצה דביקה יכולה בקלות לזרום לתוך מחט הזכוכית ועלולה לסתום אותו. הפתרון עשוי להיות גם להזריק עם דופק לחץ קצר או עם לחץ מתמיד, בהתאם לכמות הנוזל מוזרק. זכור שכאשר לקצה המחט יש פתח רחב, יותר מדי פתרון מוזרק לביצה, מה שגורם לקטלניות (איור 3F-H). במקרה זה, לשמור על זרימה נוזלית מתמדת על ידי לחץ מתמיד, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך ביצה ולמשוך אותו מיד. אם זה גורם יותר מדי גלישה או פרצי הביצה, לשנות את המחט.</li>
	<li>שמור את הביצים המוזרקות במיכל עם הגודל המתאים למספר הביצים המוזרקות (<20 ביצים: צלחת קטנה; >20 ביצים: מיכל בגודל בינוני) עם 60%-80% RH ו 37 °C (67 °F).</li>
</ol>3. הזדווגות
<ol><li>בדקו את הביצים המוזרקות מעת לעת והשליכו ביצים פגומות במלקחיים כדי למנוע צמיחה פטרייתית(איור 3I,J). במקרה יותר מדי פטרייה גדל על ביצה, לנקות את פני השטח של הביצה עם 70% EtOH.</li>
	<li>לפני הבקיעה (כ 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס לאחר הטלת ביצה), לטבול את שקופית הזכוכית עם הביצים מוזרק לתוך אבקת טלק כדי לצפות את פני השטח של הסרט דו צדדי. זה ימנע את הערימה של נימפות בקעו. מעבירים את מגלשות הזכוכית מצופות האבקה למיכל בגודל בינוני עם מזון, מים ונייר מקופל להסתרת החרקים.</li>
	<li>הסר את מגלשות הזכוכית לאחר שהנימפות בקעו. מעת לעת לספק מזון עד שהם מגיעים לבגרות. הערה: לוקח בערך חודשיים וחצי עד שאנשים מגיעים לבגרות אחרי שהם בוקעים (איור 1A). הבמה הבוגרת נשפטת על סמך אוביפוסטור מפותח אצל נקבות (איור 1B).</li>
	<li>כדי להזדווג עם הפרטים, להעביר כמה שיותר מבוגרים נקבות בר הדרושים ממושבת מעבדה למיכל בגודל בינוני ולהדגיר אותם לפחות 14 ימים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לוודא שהם בתולים. הערה: אין צורך לאסוף נקבות בתולה ממושבת מעבדה כי למבוגרים T. domestica יש מחזור חוזר ונשנה של הזדווגות והזדווגות שנקרא "מחזור הרבייה וההזדווגות", שבמהלכו הנקבות זורקות זרע עם כל molt ומזדווגות שוב במחזור ההפריה הבא13.</li>
	<li>העבירו זכר או נקבה בוגר G0 שהתפתח מביצה מוזרקת ומבוגרים מסוג פראי לצלחת פלסטיק קטנה (100 מ"מ x 40 מ"מ) עם אוכל, נייר מקופל וחתיכת כותנה קטנה להטלת ביצי G1(איור 2C'; צלחת הזדווגות). שמור את מנות ההזדווגות במיכל גדול יותר עם 60%-80% RH(איור 2C). הערה: ניתן לכלול בצלחת מספר מבוגרים מסוג פראי כדי להגדיל את הסיכוי להזדווגות מוצלחת, אם כי שיעורי הצלחה גבוהים הושגו עם זיווג אחד לאחד.</li>
</ol>4. גנוטיפינג
<ol><li>עיצוב זוגות פריימר PCR עבור כל gRNA כדי להגביר מוצר 100-200 bp הכולל את האתר ממוקד על ידי gRNA. BLAST כל רצף פריימר מול מכלול הגנום כדי לבדוק את הספציפיות שלו (דוגמה מוצגת למיקוד הגן הלבן באיור 4A).</li>
	<li>בדוק את טרנספורמציית הנבט של מבוגרי G0.<ol>
<li>חמישה ימים לאחר הטלת הביצים, אוספים ביצי G1 בודדות מכל זוג בוגרים G0 לצינורות 0.2 מ"ל (ביצה אחת לכל צינור; חנות אספה דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך). להפריד את שכבות כותנה כדי לאסוף את הביצים. הערה: מומלץ לגנוטיפ לפחות 12 נימפות G1 מכל זוג הזדווגות כדי להעריך את ההצלחה של העברת הנבט (ראה תוצאות מייצגות).</li>
		<li>הוסף 15 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל Proteinase K פתרון (מומס במאגר Tris-EDTA) לכל צינור, בקצרה הומוגניזציה דגימות עם קיסמים, ואת הדגירה ב 55 °C (70 °F) עבור 3 עד 16 שעות.</li>
		<li>להשבית את Proteinase K על ידי הצבת הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 90 μL של מים מזוקקים לכל צינור ומערבבים היטב. השתמש 2 μL של supernatant בתמהיל תגובת PCR μL 10 μL המכיל את פריימרים תוכנן בשלב 4.1. הערה: מומלץ להשתמש בפולימראז DNA המותאם לתבניות גולמיות כדי להגיע למספיק הגברה של PCR.</li>
		<li>כדי לנתח את מוצרי PCR, בצע בדיקת ניידות הטרודופלקס (HMA) עם מערכת אלקטרופורזה של שבב זעיר (איור 3B; ראה Ohde et al., 2018)8. הערה: מוטציות ניתן להעריך עם שתי שיטות חלופיות: (1) HMA עם פולימרים ג'ל סטנדרטי, כגון 8% polyacrylamide14; (2) עיכול של מוצרי PCR עם אנדונוקלאאז T7 ואחריו אלקטרופורזה ג'ל agarose15.</li>
		<li>שמור רק את נימפות G1 הנובעות מבוגרים G0 המכילים מוטציות בנבט שלהם להשליך את האחרים.</li>
	</ol></li>
	<li>גנוטיפינג אישי של נימפות G1 / מבוגרים<ol>
<li>בודדו את נימפות G1 ללוחות של 24 בארות עם שאיפה או מברשת צבע. הנח את לוחות 24 הבאר במיכל גדול יותר (למשל, המיכל הבינוני המשמש בפרוטוקול זה) עם אספקת מים כמתואר לעיל כדי לשמור על RH של 60%-80%(איור 1D). שמרו על אספקת מזון דגים מלאכותי רגיל(איור 1D). הערה: למרות שלב זה יכול להתבצע בכל נקודה של שלבי נימפה ומבוגרים, מומלץ לבצע אותו לאחר שהגיע לבגרות ורגע לפני הזיווג (>2.5 חודשים לאחר ההזרקה; איור 1B) כי קל יותר לתחזק כבאיות במיכל גדול. גידול אישי נדרש כדי לעקוב אחר הגנוטיפ של כל נימפה G1 על השלבים הבאים. נימפות G1 מאותו מבוגר G0 יכול להיות מוטציות שונות.</li>
		<li>צבוט ומשוך cerci ואת חוט caudal מנימפה / מבוגר באמצעות מלקחיים ולאסוף אותם לתוך צינור 0.2 מ"ל המכיל 50 μL EtOH (לאחסן את הדגימות שנאספו ב -20 °C (70 °F) עבור אחסון לטווח ארוך). הערה: דגימות רקמה נאספות ב- EtOH מכיוון שהיא מונעת אובדן של דגימות קטנות אלה עקב חשמל סטטי. אם אדם צריך לעצור את התנועה של חרקים, המרדים נימפה / מבוגר על קרח בעת לקיחת דגימות רקמה. כי T. domestica לא יכול לשרוד לאחר קירור לטווח ארוך על קרח, לא להרדים אותם במשך יותר מדקה ומיד להעביר אותם בחזרה לטמפרטורת החדר. אבלציה של cerci ואת חוטי caudal גורם ללא עלייה בתמותה.</li>
		<li>מניחים צינורות מדגם עם העפעפיים פתוחים על בלוק תרמי במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי לאדות את EtOH.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.2.2–4.2.5 עבור genotyping.</li>
		<li>שלח את מוצרי ה- PCR שבהם תבנית רצועת מוטנטים נצפתה לשירות רצף סנגר סטנדרטי.</li>
		<li>שמרו על הנימפות/מבוגרים של G1 עם המוטציות הרצויות והשליכו את האחרים (ראו איור 4C לקבלת תוצאת רצף מייצגת).</li>
	</ol></li>
	<li>חוצים את המבוגרים המכילים את המוטציות הרצויות בצלחת הזדווגות ומשיגים את הדורות הבאים כדי ליצור זן מוטנט הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבור הדור המוצלח של מוטציית T. domestica הרצויה עם CRISPR/Cas9, חשוב תחילה לאסוף מספר מספיק של עוברים מבוימים להזרקה. עבור אוסף קבוע של מספר מספיק של ביצי T. domestica, המפתח הוא לבחור גודל מתאים של המיכל יש צפיפות אוכלוסין נמוכה יותר כי זה יעזור להשלים בהצלחה סדרה של התנהגויות הזדווגות מורכבות, א...

Thermobia domestica שייך לאחד ממסדרי החרקים הבסיסיים ביותר, זיג נטומה, השומרת על מחזור חיים אמטבולי וחסר כנפיים של אבות קדמונים. תנוחה פילוגנטית בסיסית כזו ומאפייני אבות מגדירים מין זה כמודל אטרקטיבי לחקר המנגנונים שבבסיס ההצלחה של חרקים על פני כדור הארץ, המכסים מעל 70% ממיני בעלי החיים המתוארים1. T. domestica שימש זמן רב בעיקר כדי ללמוד מאפיינים אבות של פיזיולוגיה חרקים בגלל המאפיינים המתאימים שלה כמודל מעבדה, כגון מחזור חיים קצר יחסית (2.5-3.0 חודשים מעובר למבוגר הרבייה; איור 1A) ורבייה קלה. בשלושת העשורים האחרונים הורחב השימוש בו כדי לחקור מאפיינים של אבות קדמונים של תכונות שונות כגון תוכנית גוף, בידול עצבי ומקצבים צירקדיים2,3,4.
יישום כלים גנטיים מתקדמים ב- T. domestica יכול להאיץ עוד יותר תרומות כאלה בתחום מחקר רחב. הפרעה מוצלחת RNA (RNAi)-בתיווך נפילת גנים בעוברים, נימפות, ומבוגרים דווח ב T. domestica4,5,6. היעילות של RNAi המערכתי עדיין תלויה מאוד במינים - לדוגמה, הוא בדרך כלל גבוה בקולופטרה ואילו הוא נמוך בסדר הלפידופטרה7. היעילות ומשך ההפלה של RNAi ב- T. domestica טרם נבדקו. בנוסף ל- RNAi, דיווחנו בעבר על נוקאאוט גנים מוצלח של CRISPR/Cas9 בתיווך T. domestica8. מערכת CRISPR/Cas הוחלה באופן נרחב לעריכת גנום בחרקים במיוחד עבור נוקאאוט גנים ממוקדים. השימוש בו יכול להיות מורחב עבור יישומים אחרים כגון בדיקת כתב גנים, מעקב אחר שושלת התא, ומניפולציה של פעילות שעתוק על ידי דפיקות במבנים אקסוגני לאחר הקמת פרוטוקול להעברת רכיבים של מערכת CRISPR / Cas לתוך גרעינים9. בשילוב עם הרכבה הגנום שפורסם10, השימוש הרחב ופיתוח נוסף של עריכת הגנום מבוסס CRISPR / Cas ב T. domestica יקל על מחקרים המתמקדים במנגנונים האבולוציוניים שמאחורי ההצלחה המסתגלת יוצאת הדופן של חרקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור microinjection העובר עבור הזדווגות בוגר T. domestica כדי ליצור זן מוטציה באמצעות CRISPR / Cas9. בהתחשב בשיטה חדשנית זו, אנו דנים בחשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של מיני מודלים לא מסורתיים ליישומים מוצלחים של טכניקות אלה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

תרמוביה הביתית של האש היא מין אמטבולי וחסר כנפיים המתאים לחקר המנגנונים ההתפתחותיים של חרקים שהובילו לקרינה האבולוציונית המוצלחת שלהם על פני כדור הארץ. היישום של כלים גנטיים כגון עריכת גנום הוא המפתח להבנת שינויים גנטיים האחראים על מעברים אבולוציוניים בגישה Evo-Devo. במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול הנוכחי שלנו ליצירת ותחזוקה של זנים מוטנטים של T. domestica. אנו מדווחים על שיטת הזרקה יבשה, כחלופה לשיטת ההזרקה הרטובה המדווחת, המאפשרת לנו להשיג שיעורי הישרדות גבוהים ביציבות בעוברים מוזרקים. אנו מדווחים גם על הגדרת סביבה ממוטבת להזדווגות עם מבוגרים ולקבל את הדורות הבאים ביעילות גבוהה. השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של התחשבות בביולוגיה הייחודית של כל מין ליישום מוצלח של שיטות עריכת גנום לאורגניזמים מודל לא מסורתיים. אנו צופים כי פרוטוקולי עריכת הגנום הללו יסייעו ביישום T. domestica כמודל מעבדה ולהאיץ עוד יותר את הפיתוח והיישום של כלים גנטיים שימושיים במין זה.

בידינו, כ -100 ביצים ניתן להזריק היטב עם נימי הזרקה אחת כאשר יש לו את הקצה המתאים(איור 3C). הזרקה של gRNA / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בעוברים בתוך 8 h הראשון לאחר הטלת ביצה תוצאות indels באתר ממוקד gRNA. זה גורם מוטציות biallelic בתאים מסוימים של הדור מוזרק (G0) ולכן פנוטיפים פסיפס מוטציה מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica at JoVE.com

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K Views.  Kyoto University. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...