המחברים מודים לוונסה מלדנר-הארל על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.
1. הכנת מחט (איור 1)
<ol><li>משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל19. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.</li>
	<li>לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.</li>
</ol>2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (איור 2)
<ol><li>חמישה ימים לפני יום ההזרקה, נקבות חול מאכילות דם עפות כפי שהן מבוצעות באופן שגרתי לתחזוקת המושבה. לפרטים על מושבות זבוב חול גידול נהלים וחומר נדרש, אנא עיין עו"ד ואח'1 לשמור על החרקים באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל התפתחותם.<ol>
<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, ללכוד נקבות שניזונו בדם על ידי קבוצות של 100-150 בסירי גבס עם נמל צדדי. לשמור על הנקבות על ידי האכלת אותם עם תמיסת סוכר (30% סוכרוז – נפח מספיק כדי להשרות כדור כותנה קטן) וזה הרגיל לתחזוקת המושבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 2-3 לאחר האכלת הדם, אין להרטיב את סירי הגבס. שמירה על הנקבות על מצע יבש תמנע הטלת ביצים מוקדמת, שכן הנקבות מעדיפות להטיל ביצים על סביבה לחה.</li>
	<li>ביום 5 לאחר האכלת הדם, לבצע את אוסף העובר, מיקרומניפולציה, microinjection. הכניסו נייר סינון לח לתא הטלת הביצים. לעוברים טריים אין כוריון מפותח לחלוטין והם נראים לבנים. השתמש בנייר סינון שחור במהלך ההליך כדי להקל על הדמיית העוברים הלבנים.</li>
	<li>מעבירים קבוצה קטנה של נקבות מסיר הגבס לתא הטלת הביצים דרך היציאות הצדדיות באמצעות שאיפת פה. נוכחותו של מצע לח (נייר הסינון) גורם לנקבות לביצית.</li>
	<li>לאחר 30-60 דקות, בזהירות לאחזר את נייר המסנן עם עוברים שהונחו לאחרונה מן התא. שומרים את נייר הסינון והעוברים בצלחת פטרי עד 3 שעות. במהלך תקופה זו, להעריך באופן קבוע את רמת הלחות של נייר המסנן כדי להבטיח שהוא נשאר לח. במהלך תקופה זו, לחזור על שלבים 2.4 כדי 2.6 עם קבוצות חדשות של נקבות ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר.</li>
	<li>מכינים שקופיות מיקרוסקופ להזרקה: אוספים ידנית את הביצים אחת אחרי השנייה עם מברשת צבע עדינה מאוד ומעבירים אותן בזהירות לחתיכה אחרת של נייר סינון שחור לח שהונח על מגלשת מיקרוסקופ ומעליה כיסוי זכוכית.<ol>
<li>מוסיפים מים לנייר הסינון, מספיק כדי לשמור על העוברים לחים אך לא גורמים להם לצוף הרחק מהכיסוי או להישאב מתחת לכיסוי. תסדר את העוברים כנגד הכיסוי. העטיפה משמשת כפסע אחורי המונע מהביצים להתגלגל במהלך ההזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. זריקות עוברים (איור 3)
<ol><li>התחל זריקות 2.5 עד 3 שעות לאחר תחילת איסוף הביצים. בצעו זריקות בטמפרטורת החדר ובלחות המעבדה הסביבתית.</li>
	<li>ודאו שלעוברים המיושרים יש מספיק מים כדי שהם יישמרו לחים. הערה: זה קריטי כי העוברים נשמרים לחים במהלך הזריקות. אם הם לא לחים במהלך תהליך ההזרקה, זריקות להיות קשה כי המחט מתקשה פירסינג העובר. כמות המים הנכונה היא הנקודה שבה לעוברים יש מניסקוס של מים סביבם, אך הכיסוי אינו צף על גבי המים וגורם לעוברים לדחוף מתחת לכיסוי. זה קריטי כדי לפקח על כמות המים סביב העוברים במהלך זריקות. מוסיפים מים לפי הצורך כדי לשמור על העוברים לחים.</li>
	<li>מוסיפים מים בזהירות על ידי הרטבת מברשת עם מים והעברת המים לקצה האחורי של נייר המסנן. הוספת מים בצורה זו מאפשרת להוסיף מים בצורה איטית ומבוקרת, כך שרק מספיק מתווסף כדי לשמור על העוברים לחים. יותר מדי מים יכולים לגרום לעוברים לצוף מחוץ ליישור, מה שמקשה על הזרקת העוברים.</li>
	<li>תערובת הזרקת עומס גב לתוך מחט microinjection. הוסף כ 0.5 כדי 1 μL של תערובת הזרקה לתוך המחט באמצעות מילוי מחט borosilicate מצויר ביד, טיפים צינור טעינת ג'ל ניתן להשתמש גם. תערובת ההזרקה מורכבת RNA מדריך אחד או יותר (80 ng / μL כל אחד) שנועד למקד לוקוס ספציפי מעורבב עם חלבון Cas9 רקומביננטי מסחרי (300 ng / μL).</li>
	<li>החל מלחץ ההזרקה ב 30 psi, לחץ על ההדק ההזרקה כדי לגרש אוויר מקצה המחט. זה יאלץ את תערובת ההזרקה לקצה המחט ומאפשר לתערובת ההזרקה לזרום. בשלב זה, לאט להגדיל את הלחץ להחזיק / קבוע עד חומר ההזרקה מתחיל לזרום, ולאחר מכן לסגת להחזיק / לחץ קבוע, כך שהוא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה זורם מן המחט. ההגדרה מגודרת צריך לספק רק מספיק חומר הזרקה, כך כמות קטנה של חומר ניתן לראות להיכנס העובר. הערה: הזרקת עוברים זבוב חול תחת שמן halocarbon דומה לפרוטוקולים אחרים המשמשים Drosophila ו יתושים נבדק בתחילה, אולם אחוז ההישרדות עבור זריקות אלה היה נמוך מאוד. ההישרדות שופרה על ידי מעבר לזריקות על נייר סינון לח כמתואר לעיל.</li>
	<li>הכנס את המחט לצד העובר. השתמש בכיסוי מאחורי העובר כמו backstop אשר יסייע המחט לנקב את העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה לתוך העובר לפני בעדינות להסיר את המחט.</li>
	<li>מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר ממולא לאחור מקצה המחט. זה יעזור למנוע את המחט סתימת.</li>
	<li>המשך לעובר הבא. בין כל זריקה, ודא כי נייר המסנן לח והמחט אינה סתומה.</li>
	<li>לאחר שכל העוברים הוזרקו, לספור את מספר העוברים מוזרקים כדי לשמור על ספירת ריצה.</li>
	<li>הסר את הכיסוי על-ידי הוספת מים לנייר הסינון כך שהכיסוי יצוף. בשלב זה, השתמש בבדיקה (מקל אפליקטור עץ עם סיכת חרק מודבק לקצה) כדי להחזיק את נייר המסנן במקום בעוד אצבע משמשת כדי למשוך את הכיסוי מן העוברים מוזרקים.</li>
	<li>מחק מים עודפים מנייר הסינון לאחר הסרת העטיפה.</li>
</ol>4. גידול לאחר הזרקה (G0) (איור 4)
<ol><li>מעבירים את נייר המסנן עם העוברים על גבי מספר שכבות של נייר סינון לח הממוקם בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. שמור את העוברים כאן בזמן הדרוש כדי להזריק עוברים אחרים. עוברים יכולים להיות מוחזקים לכל היותר 3 שעות כאלה. לאחר ההזרקה הם יהפכו לאט חום.</li>
	<li>לאחר כל העוברים הוזרקו, להעביר אותם באופן ידני על סירי גבס בגודל קטן לח בעבר. אין לשים יותר מדי עוברים בכל סיר ולשמור על מרחק ביניהם, כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי בין אנשים. מכסים את הסירים במסך ומאחסנים אותם כפי שנעשה בדרך כלל עבור ביצי מושבת זבוב חול, המתוחזקות באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל הפיתוח שלהם.</li>
	<li>ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הסר את כל העוברים הפגומים והמתים עם מברשת צבע. הוסף 100 μL של 0.5% חומצה propionic, טיפה אחר טיפה, על סירי טיח המכילים את העוברים מוזרקים להגביל זיהום פטרייתי. שחרור ציטופלסמה מעוברים שנפגעו במהלך תהליך ההזרקה הוא חיובי במיוחד לצמיחה פטרייתית.</li>
	<li>בדוק את סירי הגבס כל יום ולהסיר את כל העוברים רעים או מתים. אם פטרייה קיימת, להסיר את כל העוברים הנגועים ולהוסיף כמה טיפות של 0.5% חומצה propionic.</li>
	<li>הזחלים בוקעים בין היום ה-8 ל-12 לאחר ההזרקה. פעמיים ביום, להעביר את הזחלים החדשים הגיח על סירי גבס חדשים, בקבוצות של 5-10 מקסימום. מוסיפים כמות קטנה של מזון ולבדוק את האוכל 2-3 פעמים בשבוע.<ol>
<li>בזהירות לפקח על כמות המזון הזחל, כמו יותר מדי מגדיל מאוד את הסיכון לזיהום פטרייתי. זחלי זבוב חול לשרוד טוב יותר בקבוצות עם זאת הם יכולים להיות קניבליים אם אין מספיק מזון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר הזחלים גורים, להפריד אותם על ידי מין כדי לשמור על הנקבות כמו בתולות. אם יש הרבה ניצולים, להשליך את הזכרים ולשמור רק את הנקבות. הערה: זכרים ונקבות כאחד יכולים לשאת ולהעביר מוטציות. עם זאת, כמו נקבות צריך להישמר בתולות לפני שהם להיות חצה, קל יותר להשתמש רק G0 מוזרק נקבות, כדי למנוע צורך להפריד wt חרקים על ידי מין. זכרי G0 יכולים להישמר כגיבוי אם מספר הניצולים הבוגרים נמוך ובמקרה זה יוזדווגו עם נקבות בתולות ממוינות.</li>
</ol>5. בחירה והקרנה של אללים מוטנטים (איור 5)
<ol><li>המוני לחצות את נקבות G0 עם זכרים wt בכלוב. דם להאכיל אותם לגמרי, כפי שנעשה לתחזוקת מושבה נורמלית.</li>
	<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, להעביר כל נקבת G0 עם 2-3 זכרים wt לתוך צינורות גבס בודדים באמצעות שאיפה בפה. להאכיל את הזבובים עם סוכר על כדור כותנה קטן השתנה כל יום ולהשתמש במזרק מים כדי להבטיח את לחות הטיח מתאים הטלת ביצה.</li>
	<li>לאחר נקבות G0 הטילו ביצים (המקביל G1), לאסוף את גופם בודדים, מבואר צינורות Eppendorf עבור genotyping מאוחר יותר. לשמור על העוברים כפי שנעשה בדרך כלל עבור מושבות wt.</li>
	<li>לחלץ את ה-DNA מן הנקבות G0 בשיטת הבחירה.</li>
	<li>לסנן את ה-DNA לנוכחות של מוטציות, למשל על ידי עיצוב PCR assay באמצעות פריימרים המקיפים את האזור של חתכים CRISPR צפוי.</li>
	<li>שמור רק את עוברי G1 שהונחו על ידי נקבות G0 מראה ראיות לשינוי. כאשר עוברים אלה G1 לפתח גלמים, להפריד אותם על ידי מין ולשמור רק את הנקבות. לחצות את נקבות G1 מאותה נקבת G0 לזכרים wt, להאכיל אותם בדם, ואז להעביר בקבוצות קטנות של 2-3 נקבות ו 4-5 זכרים לתוך מיכלים בגודל קטן. הערה: כל האנשים G1 יש סיכוי לשאת מוטציה ייחודית, אז אם מספר האנשים ששרדו הוא לא גבוה מדי אז עדיף לחצות G1 נקבות בנפרד עם זכרים wt. המקרה של מספר נקבות הנושאות מוטציה שונה נוכח בצינור זהה הוא נדיר אבל יכול להתרחש. אם מקרה כזה נצפה לאחר genotyping, נקבות צאצאי G2 אז צריך להיות מזדווג בנפרד עם זכרים wt. ערכת הזדווגות זו מונעת את האפשרות של מוטציות מרובות בצאצאים.</li>
	<li>לאחר הטלת ביצים, לאסוף את הגופות הנשיות G1 ולסנן אותם מוטציות. שמור רק את הצינורות שבהם לפחות נקבה אחת הראתה ראיות למוטציה.</li>
	<li>במשך דורות מאוחרים יותר לעשות זוג אחד בצלבים. לאחר הטלת ביצים, הורים מסך לנוכחות של מוטציה. חזרו על הפעולה בכל דור עד ששני ההורים יהיו הומוזיגיים לאותה מוטציה. ברגע שזוהו, הם יהיו המייסדים של מלאי מוטנטים הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של21 וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת ?...

מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, עם תסמינים הנעים בין נגעים עוריים המגבילים את עצמם ועד להפצה הקרביים שהיא קטלנית בהיעדר טיפול.
זבובי חול הם חרקים יבשתיים לחלוטין. מחזור החיים שלהם, ארוך יחסית לדיפטרה אחרת, נמשך עד שלושה חודשים, בהתאם לפרמטרים שונים כגון טמפרטורה, לחות ותזונה. הוא מורכב משלב עוברי אחד (6 עד 11 ימים), ארבעה שלבי זחל (הנמשכת בסך הכל 23 עד 25 ימים) ושלב פופי אחד (9 עד 10 ימים) ואחריו מטמורפוזה ולאחר מכן בגרות. זבובי חול דורשים סביבה לחה וחמה לגידול. זכרים ונקבות כאחד ניזונים מסוכרים, המתקבלים בטבע מצוף פרחים. רק נקבות הן מאכילות דם, שכן הן דורשות חלבונים המתקבלים מארוחת הדם לייצור ביצים1.
מוקד מחקר חשוב הוא לזהות את אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות המובילות להתפתחות זיהומים הניתנים להעברה. כמו חרקים וקטוריים אחרים, פרמטרים מהותיים לזבובי חול הוכחו כמשפיעים על יכולתם הווקטורית, המוגדרת כיכולתם לשאת ולהעביר פתוגנים למארחיהם. לדוגמה, הביטוי של גלקטינים על ידי חול פפטאסי Phlebotomus לטוס תאים midgut, מתנהג כמו קולטנים זיהוי רכיבים משטח טפיל, יכול להשפיע ישירות על היכולת הווקטורית שלהם עבור Leishmania גדול2,3. מסלול התגובה החיסונית חרקים, מחסור במערכת החיסון (IMD), הוא גם חיוני עבור Phlebotomus papatasi חול זבוב וקטור יכולת עבור לישמניה גדול4. תפקיד קריטי עבור מסלולי תגובה חיסונית חרקים וקטוריים בשליטה על העברתם של פתוגנים זיהומיות דווח באופן דומה יתושים Aedes aegypti 5,6,7, ב tsetse לטוס Glossina morsitans8, וב Anopheles gambiae יתושים 9,10.
מחקרים על זבוב חול / אינטראקציותלישמניה הוגבלו על ידי היעדר שיטות לשינוי ביטוי גנים המותאמות לשימוש בחרקים אלה. רק הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA)בוצעה 11,12,13,14 עד לאחרונה. הטכניקה, המוגבלת על ידי התמותה הקשורה למיקרו-אינג'ים של נקבות בוגרות, מובילה רק לאובדן חלקי של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקר הגנומי הפונקציונלי באורגניזמים שאינם מדגמים כגון זבובי חול. שונה ממערכת החיסון האדפטיבית בפרוקריוטים להגנה מפני בקטריופאג'ים15,16, מערכת CRISPR Cas9 הותאמה במהירות ככלי לעריכת גנום לאורגניזמים אוקריוטיים מעולים, כולל חרקים. העיקרון של עריכת גנום ממוקד CRISPR/Cas9 מבוסס על המשלימות של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לוקוס גנומי ספציפי. גרעין Cas9 נקשר לסגנ"א ויוצר שבירת דנ"א דו-גדילי (dsDNA) בדנ"א הגנומי שבו הסג'רנה מתחבר לרצף המשלים שלו. קומפלקס Cas9-sgRNA מונחה לרצף היעד על ידי 17 עד 20 בסיסים משלימים בסגנ"א למוקד הנבחר, ניתן לתקן את הפסקת dsDNA על ידי שני מסלולים עצמאיים: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)17. תיקון NHEJ כרוך בסגירה פשוטה של ההפסקה אך לעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. תיקון דנ"א באמצעות HDR משתמש במולקולת דנ"א תורמת החולקת הומולוגיה עם הדנ"א של המטרה כתבנית לתיקון. חרקים מחזיקים בשתי המכונות.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולה ליצור מוטציות בלוקוס שנבחר, דרך מסלול התיקון של NHEJ; או לאסטרטגיות מורכבות יותר לעריכת גנום, כגון דפיקות או כתבי ביטוי, דרך מסלול HDR עם תבנית תורמת מתאימה. בזבובי חול, אללים מוטנטים ריקים של גורם התגובה החיסונית Relish נוצרו באמצעות CRISPR בתיווך NHEJ בפלבוטומוס פאפטאסי4. עוברי זבוב חול הוזרקו גם במחקר אחר עם תערובת CRISPR/Cas9 המכוונת לגן המקודד צהוב. ובכל זאת, לא היו מבוגרים הנושאים את המוטציה18. אנו מתארים כאן שיטה מפורטת של זבוב חול mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR /Cas9 בתיווך NHEJ, עם דגש מסוים על microinjection העובר, צעד קריטי של הפרוטוקול.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.

פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם4. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה ...

Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K Views.  National Institutes of Health. פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

Video: Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...