Name: microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Bu eser Monsanto Mısır Rootworm bilgi araştırma programı hibe tarafından desteklenen, numara AG/1005 (için MDL ve YC) ve başlangıç fonlar MDL için NCSU verin. FC hibe Monsanto'nun Mısır Rootworm bilgi araştırma programı (AG/1005) ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (MDL) sayı MCB-1244772 verin. Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin. FC ve MDL gebe ve deneyler tasarlanmış; FC, PW ve SP deneyler yapılır; FC ve MDL sonuçları analiz; ve FC, NG ve MDL el yazması yazdı. Biz Teresa O'Leary, William Klobasa ve Stephanie Gorski WCR eleme konusunda uzman onların yardım için teşekkür ederim. Ayrıca Dr. Wade Fransızca (USDA-ARS, Kuzey Merkez tarımsal araştırma laboratuvarı, Brookings, SD) laboratuar koloniler ve yetiştirme protokolleri sağlayarak kurmak için yumurta gönderiler için teşekkür ediyoruz.

1. koloni düzeyi WCR yetişkin yetiştirme
<ol><li>WCR yetişkin yeterli miktarda elde etmek (500-1000) üzerinden güvenilir bir şirket veya Araştırma Laboratuvarı ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) ve 30 cm3 kafese koyun. Not: Bir sigara diapausing yük kullanımı önerilir.</li>
	<li>WCR yapay diyet üreticisinin protokolüne hazırlamak ve 1 cm kalınlığında kat 38 oz konteyner içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek). Karıştırma sonra kullanılmayan diyet 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Yetişkin diyet (10-15 g) ile Petri kabına (100 x 15 mm) 30 cm3 kafesin içine koymak. Yemek düşük veya kuru olduğunda daha fazla diyet ekleyin.</li>
	<li>Bir şişesi (300 mL) su, bir pamuk rulo (6 "x 3/8"), hizmet etmek için tutmak için kullanılan bir pamuk topağı ile kaplı ile bir su kaynağı olarak koymak. Bu azaldığında değişmek belgili tanımlık su.</li>
	<li>% 60 nem ile 26 ° C'de WCR korumak ve bir 14:10 ışık döngüsü kuluçka yetiştirme bir böcek.</li>
</ol>2. embriyo toplama ve hizalama
<ol><li>Bir yumurta toplama Odası %1 agar suda bir steril 100 x 15 mm2 ' Petri kabına kullanarak olun. Agar katılaşır sonra 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Yeni koydu yumurta toplamak için filtre kağıdı, tülbent (her kesim boyutu için) 4 kat (şekil 1A) agar yüzeyinde ardından tek bir katman yer. Not: Tülbent, yıkanmış çamaşır suyu ve autoclaved, kaldıktan sonra yeniden kullanılabilir ancak ilk kullanım için bunun gerekli değildir. Filtre kağıdı yeniden ve steril gerekmez.</li>
	<li>Yumurta toplama plaka (son iş günü) olabildiğince kadar geç saatte WCR kafesin içine yerleştirin ve bir folyo çadır ile kaplayın. Gece bırakın. Not: ışıklar saat 12 (14 h) gecikmeler yumurta için döşeme 10 saatleri arasında açık olması, böylece mikroenjeksiyon için genç yumurta toplama toplama odası gece geç saatlerde kafesin içine yerleştirmek laboratuvar personeli gerek kalmadan kolaylaştırmak.</li>
	<li>Yumurta toplama Odası 8 veya 9'da kaldırmak</li>
	<li>Forseps tülbent 1 kat kadar bir zaman ve yerde bir ölçek (500 mL) su almak için kullanın. Yıkayın tülbent kapalı yumurta hafifçe karıştırarak (şekil 1B ve 1 C).</li>
	<li>Bir ampul pipet yumurta başka bir kabı (500 mL) su için aktarmak için kullanın. 2-3 x yumurta temizlemek için yineleyin.</li>
	<li>Ampul pipet su etkilenmişimdir miktarını en aza indirerek yumurta filtre kağıdı (şekil 1 d) üzerine aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Siyah filtre kağıdı bir cam slayt ve kaset olarak geniş şeritler halinde kesin sıkıca emin olmak için slayda kağıt düz (şekil 2A) bırakır. Not: Siyah filtre kağıdı yansıyan ışık miktarını azaltarak mikroskop altında görünürlüğünü artırmak yardımcı olur.</li>
	<li>Toksik olmayan yapıştırıcı uygulamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) için filtre kağıdı ince çizgileri (şekil 2B) içinde. Tutkal satırları içinde tutkal boyalı yumurta almamak için bir yumurta çapı daha ince tut.</li>
	<li>İnce fırça yavaşça WCR Yumurtaları teker teker tutkal hattına onların filtre kağıdı taşımak için kullanın. Kurumadan uyuşmuşhalde yumurtlamak deneyin ve her yumurta arasında en az bir yumurta'nın uzak dur.</li>
	<li>Enjeksiyon verimliliği maksimize etmek yanında duvar ilanı yumurta birkaç satırlık bir filtre kağıdı slayt (şekil 3).</li>
	<li>Sonra tüm yumurta üzerinde filtre kağıdı koyulur, tüm tutkal mikroenjeksiyon önce kurur kadar bekleyin. Not: en eski embriyo fazla 19 h eski olması germline dönüştürme ve düzenleme CRISPR/Cas9-aracılı genom, tüm embriyoların öğle vakti (12 üzerinde) enjekte et. Ancak, RNAi için olduğunu hiçbir zaman sınırlama WCR içinde dsRNA hücreler arasında hareket edebilir çünkü. Aslında, RNAi için yaşlanma embriyolar daha iyi sağkalım oranları neden olabilir.</li>
</ol>3. hazırlık plazmid DNA'lar ve enjeksiyon iğneler
<ol><li>Endotoksin-Alerjik bir ticari kullanarak yüksek kaliteli supercoiled plazmid DNA hazırlamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) kit.</li>
	<li>Enjeksiyon çözüm hazırlamak için her plazmid konsantrasyonu kontrol ve yardımcı plazmid (250 ng/µL son konsantrasyonu), donör plazmid (750 ng/µL son konsantrasyonu) ve fenol red arabellek (% 20 son konsantrasyonu) birleştirir. Girdap kısaca çözüm ve iğne yapışmasına neden parçacıklar çökelti maksimum hızda 3 dk santrifüj.</li>
	<li>Borosilikat cam iğneler (doz 1 mm, kimlik 0,58 mm, 10 cm uzunluk) çekin bir yanan/kahverengi türü micropipette çektirmenin kullanarak. Güvenli depolama için çift taraflı yapışkan bant Petri kabına veya diğer açık kapsayıcıda çekti iğne falan batmazdı. Not: micropipette çektirme sistemi için kullanılan ayarları vardı: ısı 335, FIL = = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Is bir mikro-yükleyici kullanarak enjeksiyon iğne ipucu ( Tablo malzemelerigörmek) için damlalıklı 0.5 - 1.0 µL aşağı konik sonuna yakın iğne içinde. Oluşursa kabarcıklar iğneyi ucundan kaldır.</li>
	<li>Enjeksiyon iğne iğne bağı yerleştirin.</li>
	<li>İğne ucu hafifçe forseps güzel bir ikili ile kırma, ya da hafifçe dokunmadan/coverslip veya cam slayt üzerindeki sürükleyerek açın. Not: Hala dışarı çıkmasını enjeksiyon karışım verir en küçük açılması için hedeftir (daha küçük açıklıklar genellikle daha yüksek enjeksiyon basıncı gerektirir). Onlar zaten açık olduğundan eğimli iğneler bu adımı gerekmez.</li>
</ol>4. mikroenjeksiyon ve enjeksiyon sonrası bakım
<ol><li>İyi bir fırça kullanarak, dikkatli bir şekilde steril su ile 1-3 yumurta yüzeyine ıslak, iğne yerleştirin ve çözüm enjekte. Yüzey kurumadan her yumurta enjekte et. Görünüm için kırmızı renk yumurta içinde az miktarda enjeksiyon sırasında başarılı mikroenjeksiyon belirtmek için bak. Ezmek veya bak hasarlı, boş veya aksi takdirde enjekte cant herhangi bir yumurta kaldırın. Not: enjeksiyon basıncı iğne delik boyutu bağlı olarak değişir, 10-13 psi iyi bir başlangıç noktası olsa da.</li>
	<li>Tüm yumurta enjekte sonra filtre kağıdı cam slayttan kaldırın.</li>
	<li>(Yukarıda açıklanmıştır) %1 agar çanak yüzeyi filtre kağıdı yerleştirin.</li>
	<li>Plastik parafin film çanak mühür ve 12 gün boyunca kuluçka yetiştirme 26 ° C böcek koymak için kullanın. Not: Parafin film Çapraz kontaminasyon küf yemekleri arasında engellenmesine yardımcı olur. Ancak, küf ve bakterilerin büyüme önlemek için başka bir tedavi enjekte embriyo yaşama azaltmak olabilir.</li>
</ol>5. Kültür ve embriyoların çıkım
<ol><li>Embriyo 12 gün sonrası enjeksiyon yeni yumurtadan larva için kontrol edin ve her gün önümüzdeki 2 hafta boyunca devam edin.</li>
	<li>Larvalar, Filiz Mısır ve toprak bir yetiştirme kutusu için iyi bir fırça kullanarak aktarın. Not: Kalıp agar tabak içinde büyümek, ama larva hala çoğu durumda yumurtadan. Larva hepsini yakalamak için dikkatli bir şekilde kalıp içinde arayın. Bazı larvaların çanak kapağı için hareket olabilir ve yoğunlaşma içinde sıkışıp.</li>
	<li>Larva yetiştirme yöntemleri25standart WCR takip 26 ° C'de arka.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

WCR mikroenjeksiyon RNAi amacıyla dsRNAs ile bildirilen9olmasına rağmen bu precellular WCR embriyo, germline dönüştürme yürütmek için kritik bir işlem microinjecting için en iyi yöntemler kurmak için ilk protokoldür ve/veya CRISPR/Cas9 genom içinde bu tür düzenleme. Dönüşüm verimliliği olduğu gibi WCR embriyo başarılı mikroenjeksiyon birçok etkene bağlıdır. Aşağıda açıklanan bazı önemli konuları bu böceğin germline dönüştürme için bu iletişim kuralın...

Batı Mısır rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, önemli bir böcekten Mısır1var. İlginçtir, denetim üstesinden gelmek için WCR görünür onlar sadece fizyolojik olarak aynı zamanda davranışsal2,3,4,5, uyum bu yana en Tarım zararlıları daha hızlı ölçer 6. son on yıl içinde RNA müdahale (RNAi), güçlü bir işlevsel genomik araç, WCR7,8için potansiyel bir kontrol yöntemi olarak incelenmiş ve gen fonksiyon9eğitim için bir araç olarak da kullanılmıştır. RNAi sık mikroenjeksiyon çift iplikçikli RNA (dsRNA) diğer türler tarafından gerçekleştirilir, ancak, RNAi enjeksiyon tabanlı WCR içinde nadir iken. Aslında, RNAi yolu ile mikroenjeksiyon dsRNA in WCR9içine sadece bir kaç rapor ediliyor. WCR bile annem11' e dsRNA besleyerek embriyonik etkileri çalışma izin dsRNA7,10, için gen devirme yolu ile yenmesi yüksek düzeyde elde edebilirsiniz nedenidir. Bu yöntem WCR fonksiyonel genomik analiz yoluyla RNAi için mükemmel bir konu yapar iken, bu türlerin embriyonik mikroenjeksiyon yöntemleri geliştirmedek ilerlemeyi yavaşladı.
RNAi güç rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, tüm genler eşit RNAi için yanıt. Bu değişkenliği daha zor bir işlevsel genomik tahlil sonuçlarını yorumlama yapabilirsiniz. Ayrıca, RNAi geçici ve kalıtsal mutasyonlar oluşturmaz. Öte yandan, germline dönüştürme, başka bir işlevsel genomik aracı, kalıtsal mutasyonlar ile işaretli olan öğesinin içine ekleme genom12,13oluşturabilirsiniz. Bu uzun vadeli genetik çalışmalarda kullanılmak mutant suşları oluşturmak için mükemmel bir araç germline dönüştürme yapar. Dönüştürme bir mutant genom14' e gen işlevsel bir kopyasını sunarak bir mutasyon kurtarmak için de kullanılabilir. Ayrıca, germline dönüştürme moleküler genetik teknikleri çok çeşitli taşıdır. Nakavt ve/veya gen işlevi tahlisiye yanı sıra, germline dönüştürme artırıcı bindirme15, gen bindirme16, Ektopik ifade Gal4 tabanlı17ve genom-wide mutagenesis18için kullanılabilir.
Daha yakın zamanlarda, sofistike genom düzenleme sağlayan araçlar geliştirilmiştir. Bu araçlar transkripsiyon Activator-Like efektör enzimler (TALEN) CRISPR/Cas9-nükleaz sistemi19,20içerir. Bu yeni araçların çift iplikçikli DNA ara hemen hemen her yerde hemen hemen tüm genom içinde ikna yeteneği araştırmacılar sundukları avantajdır. Bir kez bağlı, bu tatili katalizler hangi bir mühendislik yapı huzurunda homoloji yönetmen onarım veya silme veya ekleme hedeflenen gen tanıtmak katılmadan, homolog olmayan iki ucundan aracılığıyla onarılabilir yerine tüm genler veya genetik bölgeleri21,22. Ancak, bu yöntemlerin çok genç embriyo içine DNA, RNA ve/veya protein mikroenjeksiyon gerektirir.
Önemlisi, RNAi, nükleik asitler ve protein germline için kullanılan için kullanılan dsRNAs aksine dönüştürme ve genom düzenleme kolayca hücre zarlarında geçemez. Bu nedenle, mikroenjeksiyon plazmid DNA'lar, mRNA'ların ve/veya proteinler (böcek embriyo cellularizes önceYani ) sinsisyal blastoderm aşamasında yer almalıdır. Bu kritik bir faktör enjeksiyonları zamanlamasını yapar. Örneğin, Drosophila melanogasteriçinde embriyo12yumurta sonra iki saat içinde enjekte edilir gerekir. Bu nedenle, başarılı embriyonik mikroenjeksiyon Protokolü gelişimi için WCR yanı sıra precellular embriyo yeterli miktarda toplamak için en iyi yöntem dişi yumurta döşenmesi için en iyi koşulları dikkate almanız gerekir.
Toplamak ve precellular WCR embriyo microinjecting yöntemleri geliştirmek, WCR Biyoloji üzerinde ayı için moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede getirmek için bir çaba gerektirir. Burada WCR araştırmada dönüşüm tabanlı teknikleri kullanmak başkalarına yardım etmek için ayrıntılı talimatlar, ipuçları ve püf noktaları, birlikte sağlamak. İşlevsel genomik çalışmalarda kullanılmak için WCR transgenik teknolojileri uzanan ek olarak bu teknikler de bunda ekonomik açıdan önemli test edilecek gen sürücü23,24 gibi güçlü yeni haşere kontrol stratejileri sağlar haşere.

<table><tbody><tr><td>Qualitative Filter Paper (Black)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>For egg microinjection</td></tr><tr><td>1 oz Containers&amp;nbsp;</td><td>Anny&#039;s Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Egg container</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrate for WCR egg-laying dish</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps&amp;nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Handling larvae and pupae&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Wash corn and dishes</td></tr><tr><td>Trucker&#039;s Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Corn for feeding WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (Homemade)</td><td>NA</td><td>Parts &amp;amp; instructions available upon request</td><td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer&#039;s Non-toxic Glue</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Glue eggs on filter paper</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Backfilling needle loading tips</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Wash dishes</td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td><td>Frontier Agricultural Sciences&amp;nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR adult artificial diet</td></tr><tr><td>Cotton Balls, Large</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Close the flask</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Collect and transfer eggs</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>WCR screening</td></tr><tr><td>DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Excitation filter: 440&amp;ndash;520 nm, emission filter: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage for adult colony</td></tr><tr><td>Miniature Paint Brush</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulator and needle holder</td></tr><tr><td>Microscope XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>For egg-lay</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film&amp;nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Incubator</td><td>Percival&amp;nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td></tr><tr><td>Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Water container for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>For egg wash</td></tr><tr><td>Braided Cotton Rolls</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Use in water supply for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>For diet plates</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Microinjection buffer</td></tr><tr><td>Laser-based Micropipiette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Topsoil</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Soil for cron growing</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR single pair mating chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larvae rearing box/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larvae rearing box/16 oz</td></tr><tr><td>Microinjection Scope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Microinjection needles</td></tr><tr><td>Adult Western Corn Rootworms</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Request from Dr. Bryan Wade French&#039;s lab</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td></tr></tbody></table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

Batı Mısır rootworm (WCR) Mısır önemli bir böcek ve haşere Yönetim Stratejileri için hızla adapte kabiliyetini için bilinen. RNA müdahale (RNAi) WCR biyoloji okuyan için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamıştır rağmen kendi sınırlamaları vardır. Özellikle, RNAi kendisi geçici (Yani tam yol ilişkili fenotip uzun vadeli Mendel miras), ve hedef gen DNA dizisi bilerek gerektirir. Fenotip ilgi kötü korunmuş veya bile roman genler tarafından kontrol edilir eğer yararlı hedefler belirlenmesi zor olabilir çünkü ikinci imkansız olmasa sınırlama. Bu nedenle, dizi WCR'ın genomik araç kutusundaki araç istikrarlı mutant suşları oluşturmak ve WCR genom dizisi bağımsız çalışmaları etkinleştirmek için kullanılabilir yöntemleri geliştirme tarafından genişletilip. Burada, biz toplamak ve nükleik asitler ile precellular WCR embriyo microinject için kullanılan yöntemleri ayrıntılı. Burada açıklanan protokoller transgenik WCR yaratılması hedefleniyor iken, CRISPR/Cas9-genom düzenleme de embriyo enjekte çözüm bileşimi olmanın tek farkı ile aynı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu iletişim kuralı geliştirilirken önemli bir göz mikroenjeksiyon esnasında embriyonik gelişim aşaması oldu. Özellikle, DNA'lar mikroenjeksiyon embriyonik cellularization önce germline dönüştürme gerektirir. Bunun nedeni DNA'lar kolayca hücre zarlarında geçemez. Dechorionation WCR embriyo aslında tüm koruyucu membran embriyonun bütünlüğünü için sorumlu erir çünkü nükleer bir leke kullanarak WCR embriyonik gelişim aşamalarında görselleştirmek için giri?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

7.4K Görüntüleme.  North Carolina State University. Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Video: Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Drosophila'da phiC31 İntegraz Aracılı Embriyo Transgenezi

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Yazar Spotlight: Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonunun Optimize Edilmesi

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Davranış

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme