פרויקט זה נתמך על ידי NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, מח' כספים הפצתו למדעי קלינית

עבור ניסויים אלו, מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של צפון קרוליינה סטייט.
1. הכנה תרבות
הערה: כל ריאגנטים מפורטים בטבלה של חומרים. גורם גידול ספציפי ריכוזים מפורטים בטבלה 1.
<ol><li>להכין פתרון חומצה (EDTA) ethylenediaminetetraacetic 0.5 M במים מזוקקים יונים (ddH2O). לערבב במידה מספקת, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 שימוש בפתרונות NaOH ו/או HCl. הערה: להמציא פתרון מניות EDTA טריים לפני ניסוי.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה מגיב #1 (ד ר #1) כדלקמן ומניחים על הקרח: לשלב פוספט buffered תמיסת מלח ללא Ca2 + ו- Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, מ' 1 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 מיקרומטר Y27632 פתרון 1 X אנטיביוטיקה-Antimycotic (אנטי-נגד) המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו- b שהוא גוסס הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה ריאגנט #2 (ד ר #2) כדלקמן, מניחים באמבט מים 37 ° C: לשלב PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 1 אנטי-נגד X. הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין מדיה תא גזע אפיתל המעי (IESC) כדלקמן: מיקס 25 מ ל מתקדמים DMEM/F12 בינוני עם תוספת X N2 1, 1 X B-27 תוספת, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ Glutamax ו- 1 אנטי-נגד X. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	<li>להכין תערובת בסיס של פקטורי גדילה מופחתת קרום המרתף מטריקס (matrix) גורמי גדילה משלימה כדלקמן: הפשרת המטריקס על קרח. בשפופרת microcentrifuge, להוסיף 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי בשכל אנושי, 500 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי R-Spondin 1, 50 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושית Wnt3a, 10 מ מ Nicotinamide, גסטרין 10 ננומטר, 500 ננומטר A-83-01, 10 מיקרומטר Y-27632 , 10 מ מ SB202190, 500 nM LY2157299 ו 2.5 מיקרומטר גליקוגן סינתאז קינאז 3 מעכב (GSK3i, CHIR99021). כאשר מופשר המטריקס הוא, להשלים עם המיקס פקטורי גדילה (ביצוע מיקס מאסטר) ולאחסן על קרח. הערה: הקפד להימנע מהחדרה בועות אוויר כמו פעולה זו תיצור החפץ בתוך פטי מטריקס במהלך ציפוי.</li>
	<li>לחמם תבשיל תרביות רקמה 24-ובכן בחממה 37 ° C לפני הפעלת נוהלי בידוד תא.</li>
</ol>2. ניתוח מודל של איסכמיה ואוסף רקמות
<ol><li>השתמש שמונה יורקשייר בן שבוע 10 crossbred חזירים של מין או (מומלץ). הסר כל הזנה 16-18 שעות לפני הניתוח. אפשר חזירים גישה למים בכל עת.</li>
	<li>לתזמן את החזירים להגיע לפחות 48 שעות לפני הניסויים כדי לאפשר להתאקלמות סביבתיים. הערה: טכנאי וטרינרי ו/או מעבדה מיומן בפיקוח וטרינר מורשה לספק טיפול בבעלי חיים שגרתי וסיוע עם הרדמה הליכי.</li>
	<li>Premedicate החזיר עם חריגות השירותים הווטרינריים (1.5 mg/kg intramuscularly (IM)), קטמין (11-20 מ"ג/ק"ג (IM))15. ברגע התוצאות התקבלו להנשים את orotracheally חזיר.</li>
	<li>לשמור על חזירים בהרדמה כללית עם איזופלוריין (2-5%) מתאדה 100% O2 עד הזמן של המתת חסד.</li>
	<li>המקום של קטטר (IV) תוך ורידי (הווריד האוזן מומלץ) ולפקח על החלפת נוזל כגון פלאפונים lactated פתרון בשיעור אחזקה של 15 מ"ל/ק"ג/שעה.</li>
	<li>ביצוע הרדמה ניטור כולל אוקסימטר, אלקטרוקרדיוגרם מדידות לחץ דם עקיף15. לפקח על קצב נשימה והמאמץ של החזיר. ותאוורר באופן ידני או מכנית לפי הצורך, אם הקצה גאות CO2 עולה מעל 55-60 מ מ כספית. הערה: ההרדמה המתאימה אושר על ידי ניטור מתמיד של מגמות של קצב הלב (טווח 80-130 פעימות לדקה), לחץ דם לא פולשנית (ממוצע לחץ הדם בעורק 75-100 מ מ כספית), ואת קצב נשימה (10-25 נשימות לדקה)16ובדיקת תקופתי להיעדרות של הלסת וגוון אנאלי. עומק ההרדמה יכולה להישפט גם על ידי הרפיית שרירים ורמת fasciculation שרירים בעקבות גירוי כירורגי. רפלקסים עינית בדרך כלל אין ערך16. ניתן לספק שיכוך כאבים לפי המדיניות IACUC מוסדות. במקרה זה, אופיואידים, כגון הבופרנורפין, יכול להינתן במהלך הניתוח.</li>
	<li>במקום החזיר על כרית החימום, לרסן ב recumbency הגבי עבור הליך כירורגי.</li>
	<li>לגלח את הבטן הגחון ולהכין שימוש בניתוחים כירורגיים (chlorhexidine פתרון), איזופרופיל אלכוהול.</li>
	<li>לעשות חתך קו האמצע הגחון 8-10-ס מ באמצעות להב סכין מרוכז בכל הטבור כדי לגשת בבטן.</li>
	<li>לזהות את המעי הדק (מעי צם) כ-40 ס מ אורלי כדי שתוריד. ניסחו לולאות זמן 10 ס מ של מעי צם מאת circumferentially נבדק פעמיים את המעי הגס, 1 ס מ בין כל קשירה, לפני יצירת עוקבות לולאות 10 ס"מ ממוקם אורלית (איור 1).</li>
	<li>צור שתי לולאות לכל נקודת זמן איסכמיה סמוכים זה לזה, אחד עבור איסכמיה ואחד עבור איסכמיה h 1 נוספים של פגיעה reperfusion במידת הצורך. כדי ליצור שלם איסכמיה (אין זרימה של עורקים או ורידים), מלחציים או מאתרים ומפסיקים את להערכת מצע המעי העליון באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג, טוב נגד יתושים מהברים מעוקל או משי נספגים 2-0 עבור 1, 2, 3 ו- 4 שעות ולאחר מכן להסיר את אבזמי h 1 של פגיעה reperfusion, אם רצונך בכך. הערה: המחברים ברא כל לולאות של איסכמיה לפי סדר, החל עם הלולאה איסכמי 4 שעות והוא התקדם עובר הציר הקרוב (לצמצם את זמן הניתוח הכולל). כדי להתייחס לאפשרות כי השכנה איסכמי קטעי המעי עלול לגרום נזק לולאות סמוכים, הסדר של לולאות איסכמי יכולים להיות מגוונים. זה עשוי לשנות את הזמן כירורגי הכולל. הערה: מסגרת הזמן של פגיעה reperfusion יכולים להיות מגוונים בהתבסס על שאלת המחקר מעניינים או אם טיפולים רוצה להיבדק בתקופה פגיעה reperfusion. עם זאת, נזק לרקמות הופך חמור יותר מהעלאת המשכים של איסכמיה לבד, פגיעה reperfusion פגיעה סביר שאינה תורמת דבר נוסף אפיתל פציעה. פגיעה reperfusion ככל הנראה תפקיד בעקבות תקופות מתון של איסכמי.</li>
	<li>בין נקודות זמן איסכמיה, להשאיר את הבטן מכוסה או סגור באמצעות מגבת נקיה ו/או מגבת מלחציים. הערה: בתוך חיים בודד עבור ניסוי זה, שמונה מקטעים איסכמי יכולים להיווצר. זיהוי מקטע jejunal נוספים, מקורב ללולאה האחרונה איסכמי, שישמש כפקד נורמלי פנימי לפחות 5-10 ס"מ.</li>
	<li>לחסום כ שלוש ספינות מצע המעי העליון לכל קלאמפ וסקולרית בולדוג או מעוקל מהברים יתושים עוצר דימום. יש לנקוט במהלך היישום עוצר דימום בגלל כלי הם בטראומה בקלות. לנסות מחסנית בכלי הדם בתוך מלתעות המלחציים.</li>
	<li>בסוף הניסוי, המתת חסד הבאים עם פנטוברביטל 85-100 מ"ג לק"ג IV, לאסוף את כל לולאות של רקמה באמצעות קורות חיים, לאחר המוות אושרה עם אין דופק auscultated ואובדן הקרנית. התחל על ידי איסוף חתיכה שליטה של מעי צם נורמלי לפחות 5 - 10 ס מ proximal ללולאה האחרונה איסכמי.</li>
	<li>להפריד ולאחסן את. לולאות של כל נקודת זמן פציעה במכלים קטנים של PBS קר כקרח עד מוכן לבידוד הקריפטה. הערה: אם רצונך בכך, להפוך איסכמי לולאות מספיק זמן כדי לחלק את הדוגמאות נפרדים עבור היסטולוגיה והתרבות תאי גזע מעיים; עם זאת, המחברים מצאו לולאות גדול מכ 10 ס מ באורך סביר ביותר להפוך דימומית.</li>
</ol>3. קריפטה (תא גזע) בידוד מן איסכמי ולולאות שליטה
<ol><li>היפוך כל לולאה של המעי הדק באמצעות 20 גאייג-חוט רקמה מלקחיים לחשוף את השטח הרירית. לקשור העליון והתחתון של הלולאה בצורה מאובטחת לכבל באמצעות תפרים (2-0 נספגים משי או שווה ערך).</li>
	<li>לאחר היפוך, לשטוף כל לולאה ב- PBS קר קרח כדי להסיר את הלכלוך luminal.</li>
	<li>מקם דגימות ישר לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, המכיל ד ר #1 על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאסוף את לולאות מתחיל עם שליטה ופעל עם לולאות להגדיל בהפרש קבוע המשכים של איסכמיה. לולאות של רקמות שנפגעו פחות (כלומר שליטה ו- 1 h איסכמי רקמות) יכול רועד בחוזקה, הצמדה בשורש כף היד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. רקמות רקמות שנפגעו קשות (h 3 ו 4 של איסכמיה) צריך בעדינות שולט או הפוך רק כפי רועדות מדי יגרום הפרעה קריפטה והרס רקמות נוספות. צינורות צריך להיות מזועזע או הפוכה כל 5 דקות בזמן על קרח.</li>
	<li>העברת דגימות לתוך ד ר #2 10 דקות באמבט מים 37 º C. לנער או היפוך צינורות בכל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, centrifuge הצינורות חרוט המכיל ד ר #1 מ- 2-4 h פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה אפשרי שכבר יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר דגימות של ד ר #2 ולמקם דגימות רקמה ישירות לתוך 25 מ של PBS קר על קרח (תווית כמו שטיפת #1). מניחים את הדוגמאות על תפקודי לב / נשימה-קרח-סל ד 60. להמשיך ללחוץ או היפוך כל שפופרת ב-30 s כל 2-5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, ספין הצינורות חרוט המכיל ד ר #2 מהתופת 2-4 פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה זה אפשרי כי יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר aliquot 50 µL מ לשטוף #1 (או מ- DR) כדי לבדוק את מידת קריפטה דיסוציאציה, כמות פסולת. למקם את רקמת צינור חרוטי 50 מ ל (שטיפת #2, #3, וכו) מלא עם 25 מ של PBS קר ו- shake עד כוכים שלם מבודדים עם הלכלוך מינימלי, villi. הערה: המטרה היא היכולת לבודד חלק נקי עם כוכים שלם ופסולת מינימלי. כל כביסה נוספים ינקה את התאים אולם מדי רועד יתחילו לגרום נזק משני הרקמה תא. יתר על כן, התוצאות הטובות ביותר עם זיהום לפחות תושג אם כוכים הם מצופים צעד לשטוף ולא צעד ריאגנט דיסוציאציה.</li>
	<li>להסיר את הרקמה הנותרת, centrifuge השפופרות חרוט 50 מ ל- 200 גרם x 5 דקות כדי להסיר את תגובת שיקוע, לאחר מכן resuspend נותרת בגדר התת-קרקעי בנפח קטן יותר ל- PBS (5 מ"ל).</li>
	<li>שימוש במיקרוסקופ הפוכה, בחן 50 aliquots µL של כל דגימה כדי לקבוע מספר כוכים/שבר. המטרה היא 50-100 כוכים/50 µL, כמו זה יהיה בגודל של פטי מטריקס הסופי. הערה: אם המדגם הוא מרוכז מדי, להמשיך להוסיף PBS קר עד הריכוז הרצויה. אם המדגם הוא גם שתדללו, לקבוע מספר aliquots הדרושים כדי להשיג תשואה קריפטה הרצוי ולהתאים.</li>
	<li>אמצעי אחסון המתאים aliquot של כוכים (שנקבע על ידי תצפיות aliquot) לתוך צינור microcentrifuge. לדוגמה, אם לדוגמה מכיל 50 כוכים/50 µL ואז aliquot µL 50 לכל פטי משכפל X 3 = 150 µL / microcentrifuge צינור. אם המדגם מכיל רק 25 כוכים/50 µL ואז aliquots 2 הצורך / פטי X 3 משכפל = µL 300/צינור.</li>
	<li>צניפה כוכים ב g x 200 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בעדינות resuspend מגורען כוכים עם נפח מתאים של מיקס מאסטר (50 µL לכל טוב). לערבב ביסודיות על ידי במהירות pipetting 15 פעמים ללא יצירת בועות אוויר. הערה: מגניב מראש את הטיפ פיפטה תסיים סטרילי קר לפני כ רפה בעברית את תערובת הבסיס. זה יעזור למנוע את תערובת הבסיס מתפשט. טיפים יכול להיות גם לשמור במקרר, להציב בשכונה מיד לפני השימוש.</li>
	<li>מדבקות/ברקודים של מיקס מאסטר µL 50 פלוס קריפטה droplet לתוך המרכז של כל טוב של צלחת מראש ומחוממת טוב 24.</li>
	<li>דגירה לצלחת תרבות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כיסוי כל פטי מטריקס עם 500 µL / טוב של IESC מדיה (אין צמיחה גורמים נוספים הדרושים ביום 0 הם כלולים בתוך המיקס מאסטר).</li>
	<li>להוסיף 500 µL PBS סטרילי כל בארות שאינם בשימוש השאיר על הצלחת לשמור על הלחות.</li>
	<li>ספירת מספר כוכים מצופה ביום 0. הערה: זה עוזר לרשת קדם כל תא תרבות צלחת לתוך הגזרות כדי להבטיח ספירה מדויקת יותר.</li>
	<li>מספר enterospheres כל 24 שעות ונטר לפיתוח enteroid מדי יום.</li>
	<li>הוסף גורמי גדילה על כל ה 48 טוב כל התקשורת IESC h 96 כל להסיר ולהחליף עם 500 µL טריים מדיה (גורמי גדילה ואז להתווסף מדיה).</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14740765">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair%3A+the+best+offense+is+a+good+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+digestive+disease%3A+the+future+of+large+animal+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids-Current+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Swine-in-the-Laboratory-Surgery-Anesthesia-Imaging-and-Experimental/Swindle-Smith/p/book/9781466553477">Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).</li>
<li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/25432600">Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed</a>. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).</li>
<li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li>
<li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li>
<li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li>
<li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ischemia%2Freperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li>
<li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CCN1+%28Cyr61%29+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27213580">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפיתוח של מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי ומרחיב על דגמים קודמים מאתר ומאפשר לימוד נקודות מרובות זמן הפגיעה רקמות בתוך אותה חיה. ישנן מספר נקודות לדיון ביקורתי של פרוטוקול זה כולל כלי ראוי מצדו, פגיעה reperfusion רקמות, תרבית תאים קריפטה מוצלחת.
כלי ראוי מצדו חיוני ליצירת דגם של איסכמיה מלאה. אם התפר קשורה באורח לא אחיד או המלחציים לא התהדקו לחלוטין, דם העורק בעובי דופן עלולה להמשיך להזין את הרקמה ולא יכול לצאת בשל קריסת הווריד דקות קיר. התוצאה היא extravasation של דם לתוך פרופריה. מוסקולריס גרימת נזק לרקמות נוספים. עם זאת, בהתאם לסוג הפגיעה איסכמי נחקר, איסכמיה מלאה או מדמם עשוי להיות הרצוי. לדוגמה, בתהליך של השתלת מעיים, המעי הגס מופרד לחלוטין מפני אספקת הדם (עורק, וריד) במהלך השלב כריתה של ההליך, דבר המתבטא איסכמיה מעיים מלאה. לחלופין, לעומת זאת, כאשר מצע המעי הוא מעוות במהלך אירוע כגון התפתלות המעים מעיים, השיבה ורידים לעיתים קרובות נחסמת קודם, המוביל דם נוסף בתוך רקמת לפני הישות אספקת העורק חסום, ובכך ליצור איסכמיה דימומית.
איסכמי גורמת נזק לרקמות מתחיל בקצה סיסי והארכת עד הבסיס של קריפטה3. במהלך איסכמיה, אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט ימשיך לשמש ומייצר את hypoxanthine מטבוליט. כאשר הרקמה הוא reperfused עם חמצן, hypoxanthine הופך מטבוליזם על ידי אוקסידאז xanthine ומייצרת סופראוקסיד רדיקלים חופשיים שמוביל לפציעה הרירית ואטרקציה של רקמת נזק נויטרופילים17,18. הבדלים בין המינים הרירית אדריכלות כלי הדם, כמו גם ביטוי בדרגות שונות של xanthine אוקסידאז, לגרום בדרגות שונות של פגיעה reperfusion פציעה3. מודלים של חתולים, מכרסמים של איסכמיה-פגיעה reperfusion רגישים יותר לפגיעה פגיעה reperfusion חמצן תגובתי מטבוליטים19,20. לעומת זאת, חזירים נמצאו יש פחות אוקסידאז xanthine ופציעות ולכן פחות פגיעה reperfusion, ביצוע מודל זה דומה יותר לזה של איסכמיה מעיים אנושיים21. בשלב זה, השימוש של מודלים חזירי מהונדס ללמוד פגיעה במעיים או נוק לא תואר, ממציא זה מגבלה עיקרית של מודל זה. הבחירה של המודל בעלי חיים תקין תלוי תהליך המחלה או תנאי ספציפי החוקר מבקש ללמוד. לדוגמה, מודלים חזירי של נזק איסכמי ועד 6 h כבר מתואר22, בעוד נהלים איסכמי ביותר במודלים מאתר 45-60 דקות23.
הבידוד מוצלח של כוכים מעיים מן המעי נורמלי ופגועות ischemically מאפשר המחקר של שחזור אפיתל בתרבות. מערכת זו מאפשרת החוקר להתמקד באופן ייחודי על האפיתל לבד, כפי שאין אספקת דם לא או רכיב תא החיסון לשקול. זה מציע הזדמנות ללמוד אינטראקציות תאים אפיתל ושחזור בעקבות פגיעה בנוסף תגובת גורמי גדילה שונים, או הטיפולים במהלך הניתוח או בידוד קריפטה הבאים להשלים את המדיה תרבות. שלב זה נותר הקשים ביותר, כמו בידוד של לולאות נפגע קשות דורש טלטול עדין והסרה מהירים של הפתרונות המכילה EDTA במקרה כוכים יש להפוך בטרם עת חלופה מועדפת. אם אלה לולאות המעי לא נשטפים ביסודיות, כוכים יש פוטנציאל תזדהם בתרבות. כתוצאה מכך, הוסיפו אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון שני פתרונות ד ר בנוסף למדיה IESC. עוד נקודת הדיון מתמקד המעי שנאספו כפקד נורמלי. כמו בעלי החיים עוברים הרדמה עם שינויים אפשריים זלוף רקמות מערכתית, יחד עם האפשרות של מחזורי מתווכים דלקתיים משני איסכמיה, אפילו "נורמלית" שליטה רקמות לא מייצג פקד אמיתי. בניסויים אלה, זה של הערה כי הרקמה שליטה הופיע בגסות וללא בהיסטולוגיה להשוות ברקמות של בעלי חיים, כי לא עברה איסכמיה בניסויים אחרים (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
לסיכום, מתאר שיטה זו מודל לשחזור של חזירי איסכמיה מעיים, זה מקרוב מודלים מה מתרחש בפציעה איסכמי אנושי. בנוסף, מתוארת הבידוד של תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי, אשר מגישה ללמוד היענות לטיפול בתרבות ותיקון אפיתל.

נזק איסכמי מעיים, התוצאה של זמינות החמצן ירד עקב צמצום או סגר מוחלט של זרימת הדם אל המעי, נותרה מטרה משמעותית של תחלואה ותמותה בחולים אדם ובבעלי1,2. נזק איסכמי, שלאחר דלקת, חדירה תאית, מוביל לפגיעה מכשול הרירית. המכשול הרירית חיוני למניעת רוברטסונית חיידקים ורעלים המשויך לתוך מחזור מערכתי3,4. פגיעה reperfusion עוקבות של רקמות איסכמי יכול לגרום היווצרות של מינים חמצן תגובתי זה יכול להחמיר פציעות5פגיעה. מאז איסכמיה מעיים הוא לעיתים רחוקות למניעה, המחקר העדכני ביותר התמקדה בקידום טכניקות גילוי מוקדם של איסכמיה ופיתוח של רומן גישות טיפוליות להפחית פגיעה reperfusion פציעה או היעד לתיקון הרירית.
חייתיים היו בשימוש נרחב מדע בסיסי הידע של איסכמיה-פגיעה reperfusion פגיעה ולהישאר הכרחי עבור המחקר translational. מודלים מכרסם כבר בשימוש נרחב ביותר בשל היכולת שלהם להיות גנטי6. לאחרונה עם זאת, השימוש של דגמים בעלי חיים גדולים, במיוחד את החזיר כבר דגלו ללימודי translational בעתיד עקב מספר יתרונות כולל חזירים אנטומיים, הפיזיולוגיות הדמיון בני7,8. מגוון דגמים פציעה פותחו ללמוד איסכמיה-פגיעה reperfusion פציעה ואף כוללים חסימת כלי דם מלאה, איסכמיה תזרים נמוך, סגמנטלי מצע המעי העליון חסימת כלי דם. לסקירה מלאה של מודלים אלה הוא מחוץ לתחום של מאמר זה אולם המחברים ישיר לקוראים סקירה האחרונות3.
בנוסף אין ויוו מודלים, השימוש במערכות שמחוץ לתרבות הסלולר מציע כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס מעיים ותיקון בעקבות פגיעה. תאי גזע המעי אחראים תאית שגשוג והמסירה של רירית אפיתל המעי. כאשר מבודד מן המעי נורמלי או פצוע, תאי גזע המעי יכול להישמר בתרבות, לשמש כלי או מודל לחקר תאי גזע וביולוגיה תאים אפיתל. השיטות לבודד ולהקים אלה תלת מימדי התרבות מערכות (הנקרא enteroids ו- colonoids כאשר נגזר מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה) תוארו עבור מגוון רחב של מינים ו עוגב מערכות9,10 ,11,12,13. באופן ספציפי, במסגרת מערכת העיכול, שימשו מערכות אלה תרבות למחלות במערכת העיכול מודל כולל סרטן, זיהום הפתוגן, מחלות מעי דלקתיות14. בשלב זה, ישנם דיווחים לא המתארת את הבידוד ואת התחזוקה של תאי גזע מעיים של המעי הדק פצוע ischemically של כל מין. לכן, כאן אנו מתארים את התהליך של איסכמיה מעיים במודל של הרומן, גדולים בעלי חיים חזירי שתוצאתה פגיעה לשחזור ואת היכולת לבודד תאי גזע מעיים מן המעי נורמלי ונפצעו ischemically לחקר נוספים שחזור ex-vivo.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Dilute 1:10</td></tr><tr><td>Distilled, deionized water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Used to prepare EDTA and PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti solution</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Curved or straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Forceps, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curved or straight (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Silk, 2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Wire suture, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Cut and straighten before use.</td></tr><tr><td>Surgical Towels</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Any similar product is acceptable.</td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>IV catheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Controlled medication</td></tr><tr><td>Isoflurane solution</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; others are available.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td></tr><tr><td>Vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td></tr><tr><td>Fluid Pump</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td></tr></tbody></table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

איסכמיה מעיים נשאר הגורם העיקרי התחלואה והתמותה בחולים אנושיים והטיפול. תהליכי מחלה רבים לגרום איסכמיה מעיים, כאשר אספקת הדם והחמצן ולכן הוא ירד אל המעי. זה מוביל לפגיעה הרקמה הבסיסית ואובדן של מכשול המעי. תאי גזע מעיים שוכנים למרגלות המופרש והם אחראים על חידוש מעיים במהלך הומאוסטזיס ופציעה הבאים. Ex-vivo תא תרבות טכניקות אפשרו לצורך המחקר המוצלח של תאי אפיתל אינטראקציות על-ידי יצירת תנאים תרבות תומכת הצמיחה של מערכות איבר דמוי אפיתל תלת-ממדי (הנקרא "enteroids" " colonoids"מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה). Enteroids אלה הינם מורכב קריפטה ותחומים כמו סיסי בוגר כדי לכלול את כל סוגי תאים הנמצאים בתוך האפיתל. מבחינה היסטורית, מודלים מאתר כבר נעזרו ללמוד פגיעה במעיים. עם זאת, מודל חזירי מציע מספר יתרונות כולל הדמיון של גודל, כמו גם מערכת העיכול אנטומיה ופיזיולוגיה לזה של בני האדם. על ידי ניצול מודל חזירי, אנחנו לבסס פרוטוקול בו לולאות סגמנטלי של איסכמיה מעיים יכולים להיווצר בתוך חיה יחידה, המאפשרת לימוד שונות נקודות הפגיעה איסכמי זמן ותיקון vivo בתוך. בנוסף, אנו מתארים שיטה כדי לבודד את התרבות תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי של המעי, מתן אפשרות ללימודי המשך של תיקון אפיתל, מווסת על ידי תאי גזע, ex-vivo.

איסכמיה מעיים מלאה נוצר ב קטן לולאות מעיים באמצעות חסימת כלי דם עם תפר או מלחציים כמוצג באיור1. על ידי שחרור את התפסים, תקופה מבוקרת של פגיעה reperfusion יכול להתבצע, המאפשר לימוד נוספים של פגיעה reperfusion לאחר מכן פגיעה במידת הצורך. כל החיות שרדו במהלך ההליך עם סיבוך מינימלי עד המתת חסד. כירורגי. הסיבוך הנפוץ ביותר היה תת לחץ דם, אשר נפתרה עם תוספת של תייצב חיובי כגון dobutamine.
אם מבוצעת כהלכה, איסכמי מתחילים בקצה סיסי מעיים, להעביר למטה בתוך הקריפטה ככל שהמשך של איסכמיה גדל (איור 2). טעות נפוצה אחת עם טכניקה כירורגית עשויה להתרחש כאשר כלי הדם לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה. התוצאה היא איסכמיה מדמם (איור 3), שבו הווריד דקות קיר יתמוטט לפני העורק, התרת דם נוסף לחדור הרקמות. זה הוא לראות בגסות כהה סגול serosal משטח (איור 3, משמאל) לעומת משטח חיוורת במהלך מלאה איסכמיה (איור 3, ימין).
בעקבות הסרת של לולאות מעיים איסכמי, כוכים מעיים היו מבודדים בהצלחה בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה (איור 4). כצפוי, כוכים מ timepoints נפגע קשות יותר היו לעתים קרובות שבור (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. במהלך הפרוטוקול, בטח מנערים המעי נפגע קשות בעדינות כדי למנוע נזק נוסף הרקמה הבסיסית. רועד גם בערך יכול לגרום נזק התת-קרקעי נוסף, רוב כוכים גומרת בפתרונות ד ר המכילה EDTA, וכתוצאה מכך שיבושים נוספים.
ברגע מצופה, כוכים בין כל נקודות זמן איסכמיה לשרוד, הם מסוגלים להפוך הוקמה בתרבות (איור 5). מתי כוכים מעיים רגילה, המעטה פגום הם מצופה בתרבות, enterospheres טופס בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים מעיים לשרוד אך פגומים, וכתוצאה מכך להיווצרות של הספירות הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. בסך הכל, אין יעילות של צמיחה ירידה של כוכים, כמו גם גודל ירידה של enteroids נגזר רקמת המעי נפגע קשות (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> איור 1 : דגם כירורגי של איסכמיה מעיים מלאה במודל חזירי. א) מעי צם חזירי נורמלי אוזני. ב) כלי מצע המעי העליון יש כבר מאתרים בתפר יצירת איסכמיה מעיים. ג) איסכמיה שנוצרו באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג כדי לאפשר פגיעה reperfusion רקמות במידת הצורך. ד) להערכת המעי מיד לאחר הסרת התפסים כלי הדם. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> איור 2 : עדות היסטולוגית (hematoxylin ואאוזין (H & E) כתם) של הגדלת אפיתל נזק בעקבות המשכים ארוכים של איסכמיה מעיים מלאה. הנזק מתחיל בקצה סיסי עם אובדן הדרגתי של שכבת האפיתל תא בודד, סיסי blunting נזק תאי הארכת אל הקריפטה הבסיס עם פציעה קשה (משך h עד 4). בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> איור 3 : ראיות ברוטו היסטולוגיים של איסכמיה דימומית. A) תצלום מגעיל השוואת hemorrhagic איסכמיה (הלולאה שמאל) ו איסכמיה מלאה (נכון הלולאה). כאשר להערכת לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה, דם יכול להמשיך לחדור הרקמות, והתוצאה היא דלקת נוספים ונזק. ב) תמונות H & E של איסכמיה מדמם של הגדלת משך מ h 1-4. בנוסף נזק תאי אובחנה איסכמיה מלאה, יש עדויות של תאי הדם האדומים חדירה בתוך פרופריה. מוסקולריס שמסביב. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> איור 4 : Aliquots של המעי כוכים מבודד לולאות המעי איסכמי ונורמלי. כוכים מעיים, מלאה, שלמה (כוכביות) היו מבודדים בהצלחה של כל לולאה של מעי. כצפוי, כוכים מנקודות הזמן נפגע קשות יותר, לעיתים קרובות היו שבורות (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> איור 5 : מסלול הזמן צמיחת תאי המעי בעקבות בידוד מן לולאות איסכמי של המעי הדק. כאשר כוכים מעיים רגילה מצופים בתרבות, enterospheres נוצרו בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים לשרוד אך יוצרים כדורים הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. 20 מיקרומטר סולם בר אלא אם כן צוין. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>גורם גידול</td>
			<td>Diluent</td>
			<td>ריכוז מניות</td>
			<td>דילול מניות</td>
			<td>דילול עובד</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>µg 1/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10 מ מ חומצה אצטית</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>µg 500/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>מיקרומטר 500</td>
			<td>500 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>100 מיקרומטר</td>
			<td>10 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>5 מ מ</td>
			<td>0.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td>2.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>µg 200/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: טבלה ריאגנט Growth factor- סיכום של פתרונות מניות פקטורי גדילה ופתרונות עבודה בשימוש בפרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  North Carolina State University. פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Bioengineering

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Immunology and Infection

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

מודל מכרסם של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במעי באמצעות חסימה של העורק המזנטרי העליון

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>טיהור איים חזיריים על ידי זילוח כירורגי של לבלב חזיר

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet xenotransplantation offers a promising alternative to allotransplantation, with the potential for large-scale production of on-demand, functional islets. The yield and viability of isolated islets is highly susceptible to the quality of the donor pancreas and the method of procurement, particularly the duration of warm-ischemia time. To improve organ preservation and subsequent islet yield and viability, we have developed a protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas. This protocol employs direct infrarenal aortic cannulation and organ perfusion to both minimize warm-ischemia time and simplify the procedure for operators who do not have extensive surgical expertise. Subsequent arterial perfusion of the pancreas via the aorta flushes stagnant blood from the microvasculature, thereby reducing thrombosis and oxidative damage to the tissue. This manuscript provides a detailed protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas, followed by islet isolation and purification.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: טכניקות ואתגרים בטיהור איילט להשתלת קסנו

This protocol provides a step-by-step guide for the procurement of a porcine pancreas for islet isolation and purification.

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

Summary

Explore More Videos

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

מודל מכרסם של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במעי באמצעות חסימה של העורק המזנטרי העליון

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים