이 프로젝트는 NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, 및 부의 임상 과학 보급 자금에 의해 지원 되었다

이 실험에 대 한 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 캐롤라이나 주립 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 문화에 대 한 준비
참고: 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 특정 성장 인자 농도 표 1에 나열 됩니다.
<ol><li>이온을 제거 된 증류수 (ddH2O)에서 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션을 준비 합니다. 적절 하 게 혼합 하 고 NaOH 및 HCl 솔루션을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 합니다. 참고: 각 실험 전에 신선한 EDTA 재고 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 분리 시 #1 (닥터 #1)를 준비 하 고 얼음에: 결합 인산 염 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 µ M 없이 버퍼링 Y27632 및 1 X 항생제 Antimycotic 솔루션 (방지) 페니실린, 스, 암포 b를 포함 하 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다.</li>
	<li>분리 시 #2 (박사 #2)를 다음과 같이 준비 하 고 37 ° C 물 목욕에: 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 0.5 M EDTA, 10 µ M 없이 결합 PBS Y27632 및 1 X 방지. 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다.</li>
	<li>장 상피 줄기 세포 (IESC) 미디어를 다음과 같이 준비: 믹스 25 mL 고급 1 X n 2 보충과 DMEM/F12 매체, 1 X B-27 보충, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax 및 1 X 방지. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix) 및 보충 성장 요인의 마스터 믹스를 준비: 얼음에 매트릭스를 녹여. Microcentrifuge 튜브에서 100 ng/mL을 추가 재조합 인간 머리, 500 ng/mL 재조합 인간 R-Spondin 1, 50 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 100 ng/mL 재조합 인간 Wnt3a, 10mm 니코틴, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µ M Y-27632 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 및 2.5의 글 리 코겐 synthase 키 니 아 제 3 억제제 (GSK3i, CHIR99021). 매트릭스를 해 동 때 성장 인자 믹스 (믹스 마스터 만들기)와 함께 보충 하 고 얼음에 저장. 참고: 도금 동안 매트릭스 패티 내 유물을 만들 것이 공기 방울을 소개 하지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 세포 격리 절차를 시작 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 24-잘 조직 문화 접시.</li>
</ol>2. 수술 모델 허 혈 및 조직의 컬렉션의
<ol><li>8 10 주 오래 된 요크 셔를 사용 하 여 잡종 돼지 중 섹스 (권장). 수술 전에 모든 피드 16-18 h를 제거 합니다. 돼지 물이 항상 액세스를 허용 합니다.</li>
	<li>예약 도착 돼지 환경 새 환경 순응 수 있도록 실험 하기 전에 적어도 48 h. 참고: 허용한 수 의사에 의해 감독 하는 훈련 된 동물 및 실험실 기술자 일상적인 동물 보호와 마 취 절차와 지원을 제공 합니다.</li>
	<li>Premedicate xylazine와 돼지 (1.5 mg/kg 피하 (IM))와 케 타 민 (11-20 mg/kg (IM))15. 일단 진정, 넣어야 돼지 orotracheally.</li>
	<li>안락사의 시간까지 100% O2 에 증발 isoflurane (2-5%)와 일반 마 취 돼지를 유지 합니다.</li>
	<li>정 맥 (IV) 카 테 터 (권장 귀 정 맥)을 놓고 15 mL/kg의 유지 속도로 lactated ringers 솔루션 등 교체 유체 관리/h.</li>
	<li>마 취 펄스 프로브가, 심전도 및 간접 혈압 측정15를 포함 하 여 모니터링 루틴을 수행 합니다. 돼지의 호흡 속도 노력을 모니터링 하 고 수동으로 또는 끝 갯벌 공동2 55-60 mmHg 이상으로 상승 하는 경우 필요에 따라 기계적으로 환기. 참고: 적절 한 마 취 심장 박동 (범위 80-130 비트/분), 비-침략 적 혈액 압력 (평균 동맥 압력 75-100 mmHg), 호흡 속도 (10 월 25 일 호흡/min)16, 및 정기 검사 동향의 지속적인 모니터링에 의해 확인 된다 대 한 턱과 항문 톤의 부재. 마 취의 깊이 또한 근육 이완과 근육 fasciculation 다음 수술 자극의 정도 의해 재판 될 수 있습니다. 눈 반사는 일반적으로 아무 값16의. 진통 기관 IACUC 정책 지시에 따라 제공 될 수 있다. 이 경우에 opioid buprenorphine, 같은 수술 중 시행 수 있습니다.</li>
	<li>생리대에 돼지를 놓고 수술에 대 한 지 느 러 미 recumbency에서 억제 합니다.</li>
	<li>복 부 복 부를 면도 하 고 수술 스크럽 (액체 솔루션)과 이소프로필 알코올을 사용 하 여 준비.</li>
	<li>복 부에 액세스 하는 배꼽 중심으로 메스 블레이드를 사용 하는 8-10-cm 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>작은 창 자 (공장) 약 40 cm 구두 ileocecal 연결을 식별 합니다. 원주 창 두 번 ligating에 의해 공장의 10 cm 긴 루프 윤곽을 그리 다, 후속 만들기 전에 각 합자 한 cm 루프 10 cm 구두 위치 (그림 1).</li>
	<li>만들 허 혈의 시간 포인트 당 2 개의 루프에 인접 한 다른 국 소 빈 혈과 허 혈에 대 한 하나 하나 reperfusion의 추가 1 시간 원하는 경우. 완전 한 국 소 빈 혈 동맥 또는 정 맥 (흐름)를 만들려면 클램프 또는 mesenteric 맥 관 구조 1, 2, 3, 및 4 h에 대 한 불독 혈관 클램프, 곡선된 테드 모기 hemostats, 또는 2-0 비 흡수 실크를 사용 하 여 선 한 다음 제거를의 1 시간에 대 한 클램프 reperfusion, 원하는 경우 참고: 저자 허 혈의 모든 루프 4 h 허 혈 성 루프 시작 순서로 만들어지고 proximally (최소화 하기 위해 전체 수술 시간) 이동 진행. 해결 하기 위해 허 혈 성 장 세그먼트 이웃 인접 루프를 손상 될 수 있습니다 가능성, 허 혈 성 루프의 다양 한 수 있습니다. 이 전체 수술 시간을 변경할 수 있습니다. 참고: reperfusion 시간 프레임 수 있을 다양 한 관심 또는 치료 reperfusion 기간 동안 테스트 하고자 하는 경우의 연구 문제에 따라. 그러나, 혼자 허 혈의 기간을 증가에서 더 심각한 조직 손상 되면서 reperfusion 상해 가능성이 더 상피 부상에 공헌 하지 않는다. Reperfusion 허 혈 성 손상의 가벼운 기간을 다음 역할을 담당할 가능성이 않습니다.</li>
	<li>허 혈 시간 점 사이 복 부 커버 또는 메 마른 수건 또는 수건 클램프를 사용 하 여 폐쇄 유지. 참고:이 실험에 대 한 단일 동물, 이내 8 허 혈 성 세그먼트 만들 수 있습니다. 적어도 5-10 cm는 내부 일반 컨트롤 역할을 하, 마지막 허 혈 성 루프 인접 한 추가 jejunal 세그먼트를 식별 합니다.</li>
	<li>불독 혈관 클램프 또는 곡선된 테드 모기 hemostat 당 약 3 개의 mesenteric 배를 방해. 해야 합니다 주의 hemostat 응용 프로그램 동안 혈관은 쉽게 충격 때문에. 클램프의 문 턱에서 용기를 스택 하려고 합니다.</li>
	<li>실험, 다음 안락사 pentobarbital 85-100 mg/kg iv,의 끝에 하트 비트 auscultated 및 각 막 반사의 손실 없이 죽음 확인 된 후 metzenbaum가 위를 사용 하 여 조직의 모든 루프를 수집 합니다. 마지막으로 허 혈 성 루프에 인접 정상 공장 적어도 5-10 cm의 제어 부분을 수집 하 여 시작 합니다.</li>
	<li>하 고 토 굴 격리에 대 한 준비까지 얼음 차가운 PBS의 작은 용기에 각 상해 시간 지점에서 루프를 저장 합니다. 참고: 원하는 경우, 허 혈 성 게 루프 충분히 조직학 및 장 줄기 세포 배양에 대 한 별도 샘플으로 분할 하 그러나, 저자는 보다 큰 대략 10 cm 긴 루프는 대부분 출혈 될 가능성이 발견 했다.</li>
</ol>3. 암호 (줄기 세포) 격리에서 허 혈 성 및 제어 루프
<ol><li>소장 점 막 표면 노출 20 게이지 와이어 및 조직 집게를 사용 하 여의 각 루프 반전. 와이어 봉합 사 (2-0 비 흡수 실크 또는 동등 물)를 사용 하 여 안전 하 게 루프의 위아래를 묶어.</li>
	<li>반전, 다음 얼음 차가운 PBS luminal 파편 제거 하에서 각 루프를 씻어.</li>
	<li>30 분 동안 얼음에 닥터 # 1 50 mL 원뿔 튜브로 즉시 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>수집 제어 시작 루프와 허 혈의 기간을 점진적으로 증가의 루프 함께 하십시오. 덜 손상 된 조직 (즉, 제어 및 1 시간 허 혈 성 조직)에서 루프는 강제로, 최상의 결과 위해 손목 스냅 동요 될 수 있다. 심각 하 게 손상 된 조직 (국 소 빈 혈의 3, 4 h)에서 조직 해야 부드럽게 누 볐 어 하거나 거꾸로 토 굴 중단 및 추가 조직 파괴 하면 너무 많이 떨고 하는 때에. 튜브는 동요 하거나 얼음을 하는 동안에 매 5 분을 거꾸로 해야 합니다.</li>
	<li>37 ° C 물 탕에서 10 분 박사 # 2로 샘플을 전송. 흔들어 또는 반전 튜브 마다 5 분.</li>
	<li>조직 전송 후 원심 원뿔 관 표면에 뜨는 EDTA를 제거 하려면 2-4 h 손상 루프에서 닥터 # 1를 포함 된 (200 x g 5 분). 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 이미 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.</li>
	<li>박사 # 2에서 샘플을 제거 하 고 얼음 (라벨 세척 # 1)에서 차가운 PBS의 25 mL에 직접 조직 샘플을 배치. 60 rpm에서 얼음에 궤도 셰이 커에 샘플을 놓습니다. 흔들어 또는 반전 30 각 튜브를 계속 s 마다 2 ~ 5 분.</li>
	<li>원뿔 관 2-4 h에서 박사 # 2를 포함 하는 조직, 스핀 전송 후 표면에 뜨는 EDTA (200 x g 5 분)을 제거 하는 루프를 손상 된. 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.</li>
	<li>50 µ L 약 수 또는에서 제거 세척 #1 (DR) 토 굴 분리의 정도 및 파편의 양을 확인 하기. 새로운 50 mL 원뿔 관으로 조직 배치 (워시 #2, #3, 등) 그대로 지하실 최소한의 파편과 villi 격리 될 때까지 차가운 PBS와 쉐이크의 25 mL로 가득. 참고: 목표는 그대로 지하실 및 최소한의 파편 한 깨끗 한 부분을 수 있을 것입니다. 그러나 각 추가 세척 보조 조직/세포 손상에 시작 됩니다 너무 떨고 세포를 청소 합니다. 또한, 최소 오염 된 최상의 결과 세척 단계와 분리 시 약 단계에서 아닙니다 지하실은 도금 하는 경우 달성 될 것입니다.</li>
	<li>남아 있는 조직을 제거 하 고 상쾌한, 제거에 5 분 동안 200 x g에서 50 mL 원뿔 튜브 원심 다음 PBS (5 mL)의 작은 볼륨에 남아 있는 토 굴 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>거꾸로 현미경을 사용 하 여, 지하실/분수의 수를 결정 하기 위해 각 샘플의 50 µ L aliquots를 검사 합니다. 목표는 50-100 지하실/50 µ L,이 최종 매트릭스 버거의 크기를 될 것입니다. 참고: 샘플은 너무 집중 하 고, 계속 해 서 원하는 농도 도달할 때까지 차가운 PBS를 추가. 샘플 너무 희석 이면 원하는 암호 수익률에 도달 하 고 조정 하는 데 필요한 aliquots의 수를 결정 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브로 (aliquot 관측에 의해 결정 되는) 지하실의 적절 한 볼륨을 aliquot. 예를 들어 샘플 포함 50 지하실/50 µ L 다음 패티 X 3 복제 당 aliquot 50 µ L = 150 µ L / microcentrifuge 관. 샘플만 포함 25 지하실/50 µ L 다음 필요한 2 aliquots / 패티 X 3 복제 하는 경우 = 300 µ L/튜브.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g에서 펠 릿 지하실</li>
	<li>부드럽게 수송과 지하실 마스터 믹스 (잘 당 50 µ L)의 적절 한 볼륨으로 resuspend. 빠르게 공기 거품을 만들지 않고 15 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 참고: 사전 발음 마스터 믹스 이전에 찬 메 마른 PBS 가진 피 펫 팁 멋진. 이 밖으로 확산 마스터 믹스를 유지 도움이 됩니다. 팁 또한 냉장고에 보관 하 고 즉시 사용 하기 전에 후드에 배치 수 있습니다.</li>
	<li>미리 데워 진된 24 잘 플레이트의 각 우물의 센터에 50 µ L 마스터 믹스 플러스 토 굴 방울을 분배.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 동안 문화 접시를 품 어</li>
	<li>500 µ L / IESC 미디어 (없음 추가 성장 요인으로 그들은 마스터 믹스에 포함 된 0에 필요한)의 각 매트릭스 패티를 오버레이 합니다.</li>
	<li>습도 유지 하기 위해 접시에 어떤 사용 되지 않는 우물에 500 µ L 살 균 PBS를 추가 합니다.</li>
	<li>0을 도금된 지하실의 수를 계산 합니다. 참고: 각 셀 더 정확 하 게 계산 될 수 있도록 사분면으로 격판덮개 문화 사전 격자에 도움이 됩니다.</li>
	<li>Enterospheres 모든 24 h의 수를 계산 하 고 매일 enteroid 개발에 대 한 모니터링 합니다.</li>
	<li>각 잘 모든 48 헤에 성장 인자 IESC 미디어 모든 96 h 제거와 500 µ L 신선한 미디어 (성장 인자 다음에 추가 되어야 합니다 미디어) 바꿉니다 추가 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

단편 장 허 혈의 돼지 모델의 개발 같은 동물 내 조직 상해의 여러 시간 점의 연구 함으로써 이전 murine 모델에 따라 확장 합니다. 적절 한 혈관 결 찰, 성공적인 암호 세포 배양, 조직 reperfusion 등이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 논의 점 있다.
적절 한 혈관 결 찰 완전 한 국 소 빈 혈의 모델의 생성에 필수적 이다. 봉합 균등 하 게 연결 또는 클램프 하지 완전히, 혈액에서 강화 두꺼운 동맥 조직 입력을 계속 수 있습니다 고 얇은 벽 정 맥 붕괴 때문 종료 수 없습니다. 추가 조직 손상을 일으키는 lamina propria에 혈액의 넘쳐 흐름 발생 합니다. 그러나, 공부 되 고 허 혈 성 손상의 유형에 따라 전체 또는 출혈 성 허 혈을 원하는 수 있습니다. 예를 들어 장 이식 과정에서 창 완전히 분리 절차를 완전 한 장의 허 혈의 절제 단계 혈관 공급 (동맥 및 정 맥)에서. 그러나 또는,,는 mesentery 장 volvulus 같은 이벤트 동안 트위스트는 때 정 맥 반환은 종종 방해 먼저 동맥 공급 되 고 전에 조직 내에서 추가 혈액을 선도 하는 방해, 따라서 만들기 출혈 성 허 혈입니다.
허 혈 성 손상 모 끝에 시작 하 고 토 굴3의 기지까지 확장 조직의 손상을 발생 합니다. 허 혈, 중 아데노신 3 인산 염의 형태로 에너지 사용을 계속 하 고 대사 산물 hypoxanthine를 생성 합니다. 조직이 산소와 reperfused는, hypoxanthine 세 산화 효소에 의해 대사 되 고 점 막 상해 및 조직 손상 호 중구17,18의 초과 자유 래 디 칼 생성. 다양 한 표현의 세 산화 효소, 점 막 혈관 구조에 종 차이 reperfusion 상해3의 다양 한 각도 귀 착될. 국 소 빈 혈 reperfusion의 고양이 쥐 모델은 반응성 산소 대사 산물19,20에서 reperfusion 상해에 더 취약. 반면에, 돼지 더 적은 세 산화 효소와 따라서 적은 reperfusion 상해, 인간의 장 허 혈21의 더 비교이 모델을 만드는을 발견 했다. 이 시점에서 녹아웃 또는 장 부상 공부 유전자 변형 돼지 모델의 사용은 하지 설명,이이 모델의 주요 한계를 만들기. 질병 과정에 따라 적절 한 동물 모델의 선택 또는 특정 조건 연구원 공부 하고자 합니다. 예를 들어 h 6까지 허 혈 성 손상의 돼지 모델 되었습니다 설명된22, 반면 murine 모델에서 가장 허 혈 성 절차는 45-60 분23.
정상적이 고 ischemically 손상 창 자에서 장 지하실의 성공적인 격리 문화에서 상피 복구의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 시스템에는 초점을 유일 하 게 혼자, 상피 하지 혈관 공급 또는 고려 하는 면역 세포 구성 요소를 연구 수 있습니다. 이 상피 세포 상호 작용 및 다른 성장 인자, 또는 문화 미디어를 보완 하 여 수술 또는 다음 암호 격리 하는 동안 관리 하는 치료에 반응 이외에 상해 다음 복구를 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 단계에서 가장 어려운 남아 있다, 심각 하 게 손상 된 루프에서 격리를 필요로 해 서 부드러운 진동 및 EDTA를 포함 하는 솔루션의 빠른 제거 경우에 납골당 될 중간 해리. 장의 이러한 루프는 철저 하 게 세척 되지, 하는 경우는 지하실 문화에 오염 될 가능성이 있다. 결과적으로, 항생제 antimycotic 솔루션 IESC 미디어 뿐만 아니라 두 박사 솔루션에 추가 되었습니다. 또 다른 토론 지점 일반 컨트롤로 수집 소장에 중점을 둡니다. 동물 수술 마 취 보조 국 소 빈 혈, 염증 성 중재자 순환의 가능성과 함께 조직의 조직 관류에 가능한 변경 된으로 "정상" 제어 조직 진정한 컨트롤을 대표 하지 않을 수 있습니다. 이 실험에서 제어 조직 조잡 한 및 조직학에 비해 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017) 다른 실험에서 허 혈을 받아야 하지 않은 동물에서 등장 하는 노트입니다.
요약 하자면, 돼지 장 허 혈, 그 밀접 하 게 인간의 허 혈 성 손상에서 발생 하는 어떤 모델의 재현 모델을이 방법에 설명 합니다. 또한, 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포의 고립은 설명,이 상피 수리 및 문화에서 치료에 대 한 가능한 응답을 공부 하는 역할.

장 허 혈 성 손상, 감소 또는 소장에 혈액 흐름의 완전 한 폐색 감소 산소 가용성의 결과 병 적 상태와 사망률 인간과 동물 환자1,2의 중요 한 원인이 남아 있다. 연속적인 염증 및 세포 침투, 허 혈 성 손상, 점 막 장벽 타협 이끌어 낸다. 점 막 방 벽은 조직의 순환3,4로 세균성 전 좌와 관련 된 독 소의 예방에 중요 합니다. 허 혈 성 조직의 후속 reperfusion 상해5악화 수 있습니다 반응성 산소 종 손상의 형성에 발생할 수 있습니다. 장 허 혈 거의 예방 이기 때문에, 최신 연구는 국 소 빈 혈의 조기 발견 및 reperfusion 상해 또는 대상 점 막 복구를 줄일 수 있는 소설 치료 접근의 개발을 위한 기술 발전에 집중 했다.
동물 모델 국 소 빈 혈 reperfusion 상해의 우리의 기본적인 과학 지식을 확장 하 고 변환 연구에 대 한 필수 유지를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 설치류 모델 될 유전자 조작된6을 자신의 능력으로 인해 가장 널리 사용 되었습니다. 그러나 최근에, 큰 동물 모델, 특히 돼지의 사용 장점 인간7,8돼지 해 부와 생리 적인 유사성을 포함 하 여 수 미래 변환 연구 주장 되었습니다. 상해 모델의 다양 한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 공부 하 고 완전 한 혈관 폐색, 단편 mesenteric 혈관 폐색, 낮은 흐름 허 혈 등을 개발 되었습니다. 그러나이 모델의 전체 리뷰 저자 최근 검토3독자 들을 직접이 문서의 영역 밖에 있다.
Vivo에서 모델 이외에 ex vivo 세포 배양 시스템의 사용 장 항상성 그리고 부상 다음 수리 공부를 유망한 도구를 제공 합니다. 장 줄기 세포는 세포 증식과 장내 상피 안 대기의 하는 일을 담당 합니다. 정상 또는 부상 창 자에서 분리, 장 줄기 세포 문화에서 유지 될 수 있다 고 도구 또는 줄기 세포와 상피 세포 생물학 공부 모델 역할. 격리 하 고 이러한 3 차원 설정 방법 문화 시스템 (enteroids 그리고 colonoids 각각 크고 작은 창 자에서 파생 된 경우 나) 다양 한 수 종과 기관 시스템9,10에 대 한 설명 ,11,,1213. 특히, 위 장관 내에서, 이러한 문화 시스템 모델 위장 질병 암, 병원 체 감염 및 염증 성 장 질환14를 포함 하 여에 사용 되었습니다. 이 시점에서 절연 및 어떤 종에서 ischemically 부상된 소장에서 장 줄기 세포의 유지 보수를 설명 보고 있다. 따라서, 우리가 여기 소설, 큰 동물 돼지 모델에서 재현 부상과의 추가 연구에 대 한 정상 및 ischemically 부상 창 자에서 장 줄기 세포를 분리 하는 기능 귀착되는 장의 허 혈의 과정을 설명 복구 전 비보입니다.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Dilute 1:10</td></tr><tr><td>Distilled, deionized water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Used to prepare EDTA and PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti solution</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Curved or straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Forceps, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curved or straight (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Silk, 2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Wire suture, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Cut and straighten before use.</td></tr><tr><td>Surgical Towels</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Any similar product is acceptable.</td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>IV catheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Controlled medication</td></tr><tr><td>Isoflurane solution</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; others are available.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td></tr><tr><td>Vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td></tr><tr><td>Fluid Pump</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td></tr></tbody></table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

장 허 혈 병 적 상태 및 인간과 수의 환자에서 사망률의 주요 원인이 남아 있습니다. 많은 질병 과정 장 허 혈, 소장에 혈액 공급과 그러므로 산소 감소 때 발생할. 장 방 벽 손실 및 기본 조직에 손상이 리드. 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 기지에 있으며 항상성 그리고 다음 부상 하는 동안 장 갱신에 대 한 책임이 있습니다. 셀 문화 기술을 vivo ex 상피 줄기 세포 상호 작용의 성공적인 연구에 대 한 3 차원 상피 기관 같은 시스템의 성장을 지 원하는 문화 조건을 설정 하 여 허용 ("enteroids" 나 " colonoids"크고 작은 창 자에서 각각). 이러한 enteroids 크립 트와 모 같은 도메인으로 구성 되며 상피 내 세포 유형의 모든 포함 성숙. 역사적으로, murine 모델 장 부상 연구에 이용 되어 있다. 그러나, 돼지 모델의 크기 뿐 아니라 위장 해부학과 생리학의 인간을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 합니다. 돼지 모델을 활용 하 여 우리는 단편 루프 장 허 혈의 단일 동물 내에서 만들 수 있습니다, 다른 연구 허 혈 성 손상의 시간 및 에 비보를 복구 하는 프로토콜을 설정 합니다. 또한, 우리 설명 소장의 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포 문화를 격리 하는 방법 줄기 세포에 의해 변조 상피 수리의 지속적인된 연구에 대 한 허용 비보 전.

완전 한 장의 허 혈 봉합 또는 클램프 그림 1에서 보듯이 혈관 폐색을 이용 하 여 작은 창 자 루프에서 만들었습니다. 클램프를 방출 하 여 reperfusion의 제어 기간 수행할 수 있습니다, 필요한 경우 후속 reperfusion 상해의 추가 연구에 대 한 허용. 모든 동물 안락사까지 최소한의 합병증과 절차 동안 살아남았다. 가장 일반적인 수술 합병증 저 혈압, dobutamine 등 긍정적인 inotrope의 보완으로 해결 했다.
제대로 수행 하는 경우 허 혈 성 부상 장 모의 끝에 시작 하 고 아래로 크립 내 허 혈 증가 (그림 2)의 기간으로 마이그레이션할. 수술 방법으로 하나의 일반적인 실수 때 혈관 출혈 하거나 균등 하 게 채워 하지 발생할 수 있습니다. 결과 출혈 성 허 혈 (그림 3), 얇은-벽으로 정 맥이 동맥, 추가 혈액 조직 침투를 허용 하기 전에 축소 하는 이다. 이것은 어두운 자주색 serosal 표면으로 (그림 3, 왼쪽) 완전 한 국 소 빈 혈 (그림 3, 오른쪽) 동안 더 창백한 표면에 비해 심하게 보인다.
허 혈 성 장 루프의 제거, 다음 장 지하실 분리 프로토콜 (그림 4)를 다음 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 timepoints에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 프로토콜, 동안 심각 하 게 부상된 창 자 기본 조직에 추가 손상을 방지 하기 위해 부드럽게 동요 될 해야 합니다. 떨고 너무 대략 더 크립 트 손상과 EDTA, 추가 붕괴의 결과 포함 하는 DR 솔루션에서 끝나는 지하실의 대부분에서 발생할 수 있습니다.
일단 도금, 국 소 빈 혈의 모든 시간 지점에서 지하실 생존과 문화 (그림 5)에 설립 될 수 있습니다. 문화에서 정상적이 고 약간 손상 된 장 지하실은 도금 하는 때, 24-48 시간 이내 enterospheres 형태. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 장 지하실 생존 하지만, 처음 훨씬 더 작은 분야의 형성의 결과로 손상 된. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 전반적으로, 지하실의 감소 성장 효율 뿐만 아니라 심각 하 게 손상된 된 장의 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017)에서 파생 된 enteroids의 감소 크기입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> 그림 1 : 돼지 모델에서 완전 한 장의 허 혈의 수술 모델. Exteriorized A) 정상적인 돼지 공장입니다. B) mesenteric 혈관 봉합 만드는 장 국 소 빈 혈과 출혈 되어 있다. C) 허 혈 원하는 경우 조직 reperfusion 있도록 불독 혈관 클램프를 사용 하 여 만든. D) 장의 맥 관 구조 직후 혈관 클램프의 제거. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> 그림 2 : 완전 한 장의 허 혈의 더 긴 기간을 따라 상피 손상을 증가의 더 증거 (hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩). 손상의 끝에 모 단일 셀 상피 층, 모 blunting 및 세포 손상 심한 부상 (최대 4 h 기간) 기본 토 굴 아래로 연장의 점차적인 손실 시작 합니다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> 그림 3 : 심한 출혈 성 허 혈의 더 증거. A) 총 사진 출혈 국 소 빈 혈 (왼쪽된 루프)와 완전 한 국 소 빈 혈 (오른쪽 루프) 비교. 맥 관 구조 출혈 또는 균등 하 게 채워, 혈액 추가 염증 및 손상의 결과로 조직에 침투 하기 위해 계속 수 있습니다. 1-4 h에서 기간 증가의 출혈 성 허 혈의 B) H & E 이미지. 세포 손상을 완전 한 국 소 빈 혈으로 본, 뿐만 아니라 주변 lamina propria 내 적혈구 침투의 증거가 있다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> 그림 4 : 허 혈 성 및 정상적인 내장의 루프에서 격리 장 지하실의 aliquots. 완전 한, 그대로 장 지하실 (별표) 내장의 각 루프에서 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 시간 지점에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> 그림 5 : 격리 소장의 허 혈 성 루프에서 다음 장 줄기 세포 성장의 시간 과정. 정상적인 장 지하실 문화에 도금 했다, enterospheres 24-48 시간 이내에 형성. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 지하실 생존 하지만 처음 훨씬 더 작은 구체를 형성. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 20 µ m 규모 언급 하지 않는 한 바. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>성장 인자</td>
			<td>희석제</td>
			<td>사진 농도</td>
			<td>재고 희석</td>
			<td>작업 희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>머리</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10 mM 아세트산</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 Μ M</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>니코틴</td>
			<td>소프트웨어</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>100 Μ M</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 m m</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 m m</td>
			<td>2.5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 성장 인자 시 테이블. 성장 인자 재고 솔루션 및이 프로토콜에 사용 되는 작업 솔루션의 요약.

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Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

이 프로토콜에는 단편 장 허 혈의 돼지 모델을 성공적으로 설정 하 고 이후 격리 하 고 상피 수리 부상 다음의 연구에 대 한 장 줄기 세포 문화 독자 수 있게 됩니다.

단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

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10.7K 조회수.  North Carolina State University. 이 프로토콜에는 단편 장 허 혈의 돼지 모델을 성공적으로 설정 하 고 이후 격리 하 고 상피 수리 부상 다음의 연구에 대 한 장 줄기 세포 문화 독자 수 있게 됩니다.

비디오: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

연구

생체공학

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

의학

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

면역학 및 감염병학

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

상장간막 동맥의 폐색을 통한 장 허혈-재관류 손상의 설치류 모델

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>돼지 췌장의 외과적 관류에 의한 돼지 섬의 정제

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet xenotransplantation offers a promising alternative to allotransplantation, with the potential for large-scale production of on-demand, functional islets. The yield and viability of isolated islets is highly susceptible to the quality of the donor pancreas and the method of procurement, particularly the duration of warm-ischemia time. To improve organ preservation and subsequent islet yield and viability, we have developed a protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas. This protocol employs direct infrarenal aortic cannulation and organ perfusion to both minimize warm-ischemia time and simplify the procedure for operators who do not have extensive surgical expertise. Subsequent arterial perfusion of the pancreas via the aorta flushes stagnant blood from the microvasculature, thereby reducing thrombosis and oxidative damage to the tissue. This manuscript provides a detailed protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas, followed by islet isolation and purification.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 이종 이식을 위한 섬 정제의 기술과 과제

This protocol provides a step-by-step guide for the procurement of a porcine pancreas for islet isolation and purification.

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

요약

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Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

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