Name: intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Este projecto foi apoiado pelo NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 e Dept. de ciências clínicas divulgação fundos

Para estas experiências, todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade Estadual da Carolina do Norte.
1. preparação para cultura
Nota: Todos os reagentes estão listados na Tabela de materiais. Concentrações de fator de crescimento específicos estão listadas na tabela 1.
<ol><li>Prepare uma solução de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M em água destilada, deionizada (ddH2O). Misture adequadamente e ajustar o pH para 7,4 usando soluções de NaOH ou HCl. Nota: Compõem a solução estoque de EDTA fresco antes de cada experimento.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação #1 (DR #1) da seguinte forma e colocar no gelo: tampão fosfato combinam salino sem Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M de EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT), 10 µM Y27632 e 1 solução X antibiótico-antimicótico (anti-Anti) contendo penicilina, estreptomicina e anfotericina b. Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação #2 (DR #2) da seguinte forma e coloque em banho maria a 37 ° C: combinar PBS sem Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0,5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido.</li>
	<li>Preparar a mídia de células-tronco epiteliais intestinais (Iguatemi) como segue: Mix 25 mL avançado meio DMEM/F12 com 1 suplemento N2 X, 1 X B-27 suplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Armazenar a 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Preparar uma mistura mestre de fator de crescimento reduzido da membrana basal matriz (matriz) e fatores de crescimento suplementares da seguinte forma: descongelar a matriz no gelo. Em um tubo de microcentrifugadora, adicionar 100 ng/mL Noggin humana recombinante, 500 ng/mL recombinante humana R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a humana recombinante, 10mm nicotinamida, 10 gastrina nM, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , SB202190 de 10mm, 500 nM LY2157299 e inibidor de quinase 3 de 2,5 µM glicogénio sintase (GSK3i, CHIR99021). Quando a matriz é descongelada, completar com a mistura de fator de crescimento (fazendo a mistura de mestre) e armazenar no gelo. Nota: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar como isto irá criar artefato dentro a patty matriz durante o chapeamento.</li>
	<li>Pré-aquecer um prato de cultura de tecidos de 24-poço em uma incubadora de 37 ° C antes de iniciar os procedimentos de isolamento de célula.</li>
</ol>2. cirúrgico modelo de isquemia e coleção de tecido
<ol><li>Uso de oito a dez semanas Yorkshire mestiços porcos de ambos os sexos (recomendado). Retire todos os alimentos 16-18 h antes da cirurgia. Os porcos permita o acesso à água em todos os momentos.</li>
	<li>Agendar os porcos a chegar pelo menos 48 horas antes dos experimentos para permitir a aclimatação ambiental. Nota: Técnicos treinados, veterinária e/ou laboratório, supervisionados por um veterinário licenciado fornecem assistência com procedimentos anestésicos e cuidados de rotina animal.</li>
	<li>Pré-medicar o porco com xilazina (1,5 mg/kg por via intramuscular (IM)) e cetamina (11-20 mg/kg (IM))15. Uma vez sedada, entube o porco orotracheally.</li>
	<li>Manter porcos sob anestesia geral com isoflurano (2-5%) vaporizado em 100% O2 até o momento da eutanásia.</li>
	<li>Coloque um cateter de (IV) por via intravenosa (veia de orelha recomendado) e administrar um fluido de substituição, tal como a solução de lactato de toques em uma taxa de manutenção de 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Execute rotina anestésica monitorização incluindo oximetria de pulso, eletrocardiografia e medições de pressão indirecta15. Monitorar a frequência respiratória e esforço do porco e ventilar manualmente ou mecanicamente conforme necessário se final das marés CO2 sobe acima de 55-60 mmHg. Nota: Anestesia adequada é confirmada pela monitorização contínua das tendências na frequência cardíaca (faixa 80-130 batimentos/min), pressão arterial não-invasiva (média pressão arterial 75-100 mmHg) e frequência respiratória (respirações por minuto 10-25)16e verificação periódica pela ausência de mandíbula e Tom anal. Profundidade da anestesia também pode ser julgada pelo grau de relaxamento muscular e fasciculação muscular após estímulo cirúrgico. Reflexos oculares são geralmente de nenhum valor16. Analgesia pode ser fornecida como dirigido pela política IACUC instituições. Neste caso, um opioide, como a buprenorfina, pode ser administrado durante a cirurgia.</li>
	<li>Coloque o porco em uma almofada de aquecimento e frear em prostração dorsal para o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Raspar o abdômen ventral e preparar usando esfoliante cirúrgico (solução de clorexidina) e álcool isopropílico.</li>
	<li>Fazer uma incisão de 8-10 cm da linha média ventral, usando uma lâmina de bisturi centralizada no umbigo para acessar o abdômen.</li>
	<li>Identifica o oral de aproximadamente 40 cm de intestino delgado (jejuno) até a junção ileocecal. Delinear a longos loops de 10 cm de jejuno por circunferencialmente, ligando o intestino duas vezes, um cm entre cada ligadura, antes da criação subsequente loops 10cm localizado por via oral (Figura 1).</li>
	<li>Crie dois loops por ponto de tempo de isquemia adjacentes um ao outro, um para isquemia e outro para isquemia com h 1 adicional de reperfusão se desejado. Para criar a isquemia completa (sem fluxo de artérias ou veias), braçadeira ou ligate vasculatura mesentérica usando pinças vasculares buldogue, curvados hemostatos de Halstead mosquito ou fio não absorvível 2-0 para 1, 2, 3 e 4h e em seguida, retire as braçadeiras para 1h de reperfusão, se desejado. Nota: Os autores criado todas loops de isquemia em ordem, começando com o loop isquêmica 4h e progrediram movendo-se proximalmente (para minimizar o tempo total de cirurgia). Para lidar com a possibilidade de que vizinhos isquêmicos segmentos intestinais podem danificar loops adjacentes, a ordem das argolas isquêmicas pode ser variada. Isso pode alterar o tempo cirúrgico total. Nota: O tempo de reperfusão pode ser variado baseado sobre a questão de pesquisa de interesse ou se terapias desejam ser testados durante o período de reperfusão. No entanto, como dano tecidual torna-se mais grave do aumento da duração da isquemia sozinha, lesão de reperfusão provável não contribui para mais lesão epitelial. Reperfusão provavelmente um papel suaves períodos de isquemia a seguir.</li>
	<li>Entre os pontos de tempo de isquemia, manter o abdômen cobertos ou fechados usando uma toalha estéril e/ou uma pinça de toalha. Nota: Dentro de um único animal para este experimento, oito segmentos isquêmicos podem ser criados. Identifica um segmento jejunal adicional, pelo menos 5-10 cm proximal ao último loop isquêmica, que servirá como um controle interno normal.</li>
	<li>Obstrua aproximadamente três vasos mesentéricos por pinça vascular buldogue ou pinça hemostática de mosquito curvada Halstead. Deve ter cuidado durante a aplicação da pinça hemostática porque os vasos são facilmente traumatizados. Tente empilhar os vasos dentro as mandíbulas dos grampos.</li>
	<li>No final do experimento, seguir eutanásia com pentobarbital 85-100 mg/kg IV, colete todos os laços de tecido, usando a tesoura de metzenbaum, após a morte foi confirmada sem batimento cardíaco auscultado e perda do reflexo corneal. Comece por recolher um pedaço de controle de jejuno normal pelo menos 5 - 10 cm proximal ao último loop isquêmica.</li>
	<li>Separar e armazenar os loops de cada ponto de tempo de lesões em pequenos recipientes de PBS gelado até que esteja pronto para isolamento de cripta. Nota: Se desejar, faça isquêmica loops de tempo suficiente para dividir em amostras separadas para histologia e cultura de células-tronco intestinal; no entanto, os autores descobriram que loops superiores a aproximadamente 10 cm de comprimento são mais prováveis tornar-se hemorrágica.</li>
</ol>3. a cripta (células-tronco) isolamento de isquemia e malhas de controle
<ol><li>Inverta a cada loop do intestino pequeno usando um fio de calibre 20 e fórceps do tecido para expor a superfície da mucosa. Amarre a parte superior e inferior do loop firmemente ao fio usando sutura (seda não absorvível 2-0 ou equivalente).</li>
	<li>Após inversão, enxágue cada loop em gelo frio PBS para remover detritos luminal.</li>
	<li>Colocar as amostras imediatamente nos tubos cónico de 50 mL contendo DR #1 no gelo por 30 min.</li>
	<li>Coletar loops começando com controle e siga com loops de aumentar incrementalmente durações de isquemia. Loops de menos tecido danificado (ou seja, controle e 1h isquêmica dos tecidos) podem ser abalados com força, encaixe o pulso para obter melhores resultados. Os tecidos de tecido severamente danificado (3 e 4 h de isquemia) devem ser suavemente bombou ou invertidos apenas como muita agitação causará cripta perturbação e destruição de tecido adicional. Os tubos devem ser abalados ou invertidos a cada 5 min enquanto no gelo.</li>
	<li>Transferi as amostras para DR #2 por 10 min em banho maria a 37° C. Agitar ou inverter os tubos a cada 5 min.</li>
	<li>Após a transferência dos tecidos, centrifuga os tubos cónicos contendo DR #1 a partir dos loops de 2-4 h danificado para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que criptas já tem se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9.</li>
	<li>Retire amostras do DR #2 e colocar as amostras de tecido diretamente em 25 mL de PBS frio no gelo (rótulo como lavagem #1). Coloca as amostras em um agitador orbital no gelo em 60 rpm. Continuar a agitar ou inverter cada tubo por 30 s cada 2 a 5 min.</li>
	<li>Após a transferência dos tecidos, rotação dos tubos cónicos contendo DR #2 da 2-4 h danificado loops para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que as criptas têm se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9.</li>
	<li>Retire uma alíquota de 50 μL de lavagem #1 (ou do DR) para verificar o grau de dissociação da cripta e a quantidade de detritos. Coloque o tecido em um novo tubo cónico de 50 mL (lavagem #2, #3, etc.) preenchido com 25 mL de frio PBS e agitar até criptas intactas são isoladas com detritos mínimo e vilosidades. Nota: O objetivo é ser capaz de isolar uma fração limpa com criptas intactas e detritos mínimo. Cada lavagem adicional limpará as células no entanto muita agitação começa a resultar em danos de tecidos/células secundárias. Além disso, os melhores resultados com menos contaminação serão alcançados se criptas são banhadas de uma etapa de lavagem e não de uma etapa de reagente de dissociação.</li>
	<li>Remover o tecido remanescente e centrifugar os tubos cónico de 50 mL a 200 x g durante 5 minutos para remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda restantes a pelota cripta em menor volume de PBS (5 mL).</li>
	<li>Usando um microscópio invertido, examine 50 alíquotas µ l de cada amostra para determinar o número de criptas/fração. O objetivo é 50-100 µ l de criptas/50, já que este será o tamanho da patty a matriz final. Nota: Se a amostra for muito concentrada, continue a adicionar PBS frio até a concentração desejada é alcançada. Se a amostra é muito diluída, determine o número de alíquotas necessárias para atingir o rendimento desejado cripta e ajustar.</li>
	<li>Alíquota volumes adequados de criptas (determinadas por observações alíquotas) em um tubo de microcentrifugadora. Por exemplo, se a amostra contém 50 µ l de criptas/50, em seguida, alíquota de 50 μL por patty Replica X 3 = 150 µ l / microcentrifuga tubo. Se a amostra contém apenas 25 µ l de criptas/50, em seguida, 2 alíquotas necessárias / patty X 3 Replica = 300 µ l/tubo.</li>
	<li>Criptas de pelota a 200 x g por 5 min a 4° C.</li>
	<li>Resuspenda suavemente criptas peletizadas com volume apropriado do mestre mix (50 μL por poço). Misture bem, pipetando rapidamente 15 vezes sem criar bolhas de ar. Nota: Pré-fixe a ponta da pipeta com PBS estéril frio antes de aspirar a mistura de mestre. Isto ajudará a manter a mistura de mestre de espalhar para fora. Dicas também podem ser mantidas na geladeira e colocadas no capô imediatamente antes da utilização.</li>
	<li>Dispense uma mistura mestre µ l 50 além de gotículas cripta em centro de cada poço da placa 24 bem pré-aquecido.</li>
	<li>Incubar a placa de cultura por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Sobreposição de cada patty de matriz com 500 µ l / bem de mídia da Iguatemi (sem fatores crescimento adicionais necessários no dia 0, como eles estão contidos o mestre mix).</li>
	<li>Adicione 500 µ l PBS estéril qualquer poços não utilizados que deixou no prato para manter a umidade.</li>
	<li>Contar o número de criptas chapeados no dia 0. Nota: É útil para pré-grade cada célula cultura placa em quadrantes para ajudar a garantir a contagem mais precisa.</li>
	<li>Contar o número de enterospheres cada 24 h e monitorar para desenvolvimento de enteroid diariamente.</li>
	<li>Adicione fatores de crescimento para cada bem cada 48 h. Remova a mídia do Iguatemi cada 96 h e substituir com mídia de fresco 500 µ l (fatores de crescimento devem então ser adicionados à mídia).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O desenvolvimento de um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar expande-se sobre modelos anteriores murino, permitindo o estudo de vários pontos de tempo de lesões no tecido dentro do mesmo animal. Há vários pontos de discussão crítica do presente protocolo, incluindo ligadura do vaso adequado, reperfusão de tecido e cultura de células da cripta bem sucedida.
Ligadura da embarcação adequada é essencial para a criação de um modelo de isquemia completa. Se a sutura é amarrada desigual ou a braçadeira não apertado completamente, o sangue de artéria paredes espessas pode continuar a entrar no tecido e não é possível sair devido ao colapso da veia de paredes finas. Isso resulta em extravasamento de sangue para a propria do lamina causando dano tecidual adicional. No entanto, dependendo do tipo de lesão isquêmica sendo estudado, isquemia completa ou hemorrágica pode ser desejada. Por exemplo, no processo de transplante intestinal, o intestino é completamente separado do suprimento vascular (artéria e veia) durante a fase de ressecção do processo, o que resulta em isquemia intestinal completa. Como alternativa, no entanto, quando o mesentério é torcido durante um evento como um Volvo intestinal, o retorno venoso é muitas vezes obstruído em primeiro lugar, levando a sangue adicional dentro do tecido antes de ser o suprimento arterial obstruído, criando assim hemorrágica, isquemia.
Lesão isquêmica resulta em danos aos tecidos, começando na ponta das vilosidades e estendendo-se até à base da cripta3. Durante a isquemia, energia sob a forma de trifosfato de adenosina continua a ser usado e gera a hipoxantina metabólito. Quando o tecido é perfundido com oxigênio, hipoxantina se torna metabolizada pela xantina oxidase e produz radicais livres superóxido, levando a lesão da mucosa e atração do tecido, danificando os neutrófilos17,18. Diferenças de espécie em arquitetura vascular da mucosa, bem como de expressão variado de xantina oxidase, resultar em diferentes graus de lesão de reperfusão3. Modelos de felinos e roedores de isquémia-reperfusão são mais suscetíveis à lesão de reperfusão de metabólitos de oxigênio reativo19,20. Em contraste, os porcos foram encontrados para ter menos xantina oxidase e, portanto, menor lesão de reperfusão, tornando este modelo mais comparável de isquemia intestinal humano21. Neste momento, o uso de nocaute ou modelos suínos transgênicos para estudar a lesão intestinal não foi descrito, tornando isso uma grande limitação deste modelo. Seleção do modelo adequado de animais varia de acordo com o processo da doença ou condição específica o pesquisador deseja estudar. Por exemplo, modelos suínos de isquemia até 6 h tem sido descrito22, Considerando que procedimentos mais isquêmicos murino modelos são de 45-60 min23.
Bem sucedida isolação das criptas intestinais do intestino normal e ischemically danificado permite que para o estudo de recuperação epitelial em cultura. Este sistema permite que o pesquisador focar exclusivamente o epitélio sozinho, como não há suprimento não vascular ou componente de células imunes a considerar. Isso oferece a oportunidade de estudar as interações de células epiteliais e recuperação após lesão além da resposta a diferentes fatores de crescimento, ou tratamentos administrados durante a cirurgia ou isolamento de cripta seguintes, completando os meios de cultura. Esta etapa permanece o mais difícil, como isolamento de loops severamente danificados requer agitação suave e rápida remoção das soluções contendo EDTA no caso de criptas tornam-se prematuramente dissociados. Se essas voltas do intestino não são lavadas, criptas têm o potencial de tornar-se contaminado na cultura. Como resultado, solução de antibiótico antimicótico foi adicionada para ambas as soluções DR além da mídia de Iguatemi. Outro ponto de discussão centra-se no intestino coletado como um controle normal. Como os animais se submeter a anestesia com possíveis alterações na perfusão do tecido sistêmico, juntamente com a possibilidade de circular mediadores inflamatórios secundários à isquemia, tecido de controle mesmo "normal" não pode representar um verdadeiro controle. Nesses experimentos, é digno de nota que o tecido de controle apareceu grosseiramente e histologicamente comparável ao tecido de animais que não sofreu isquemia em outras experiências (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017).
Em resumo, este método descreve um modelo reproduzível de isquemia intestinal porcina, que modela de perto o que ocorre na isquemia humana. Além disso, o isolamento de células-tronco intestinais de loops isquêmicas é descrito, que serve para estudar a reparação epitelial e possível resposta ao tratamento na cultura.

Isquemia intestinal, o resultado da disponibilidade de oxigênio diminuída devido a uma redução ou completa oclusão do fluxo sanguíneo para o intestino, continua a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e animais,1,2. Danos isquêmicos, juntamente com a inflamação subsequente e infiltração celular, leva ao compromisso de barreira da mucosa. A barreira da mucosa é fundamental para a prevenção da translocação bacteriana e toxinas associadas para a circulação sistêmica3,4. A reperfusão subsequente dos tecidos isquêmicos pode resultar na formação de espécies reativas de oxigênio que podem agravar a lesão5de danificar. Desde que a isquemia intestinal é raramente evitável, mais atual pesquisa centrou-se na avançando técnicas para detecção precoce de isquemia e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que reduzem a reparação da mucosa lesão ou alvo de reperfusão.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para expandir o nosso conhecimento de ciência básica de lesões de isquémia-reperfusão e permanecem imperativo para investigação de translação. Modelos de roedores têm sido o mais utilizado devido à sua capacidade de ser geneticamente manipulada6. Mais recentemente, no entanto, o uso de modelos animais grandes, especificamente o porco, sido advogou para futuros estudos translacionais, devido a uma série de vantagens, incluindo as semelhanças anatômicas e fisiológicas de porcos para humanos7,8. Uma variedade de modelos de lesão foram desenvolvidos para estudar lesões de isquémia-reperfusão e incluem completa oclusão vascular, isquemia do low-flow e segmentar oclusão vascular mesentérica. Uma revisão completa destes modelos é fora do âmbito deste artigo, no entanto os autores direcionar os leitores para uma recente revisão3.
Além de modelos em vivo , o uso de sistemas de cultura celular ex vivo oferece uma ferramenta promissora para estudar a homeostasia intestinal e reparação após lesão. Células-tronco intestinais são responsáveis pela proliferação celular e o volume de negócios do revestimento epitelial intestinal. Quando isolada do intestino normal ou ferido, células-tronco intestinais podem ser mantidas em cultura e servir como uma ferramenta ou modelo para o estudo de células-tronco e biologia da célula epitelial. Métodos para isolar e estabelecer estas tridimensional cultura sistemas (denominados enteroids e colonoids quando derivado do intestino de pequeno e grande, respectivamente) foram descritos para uma variedade de espécies e órgão sistemas9,10 ,11,12,13. Especificamente, dentro do trato gastrointestinal, estes sistemas de cultura tem sido usado para doença gastrintestinal modelo, incluindo câncer, infecção do patógeno e de doença inflamatória intestinal14. Neste momento, não existem relatos descrevendo o isolamento e manutenção de células-tronco intestinais do intestino delgado ischemically ferido em qualquer espécie. Portanto, aqui descrevemos o processo de isquemia intestinal em um modelo de suínos animal novela, grande que resulta em lesão reprodutível e a capacidade de isolar células-tronco intestinais do intestino normal e ischemically ferido para o estudo adicional de recuperação ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP-399</td><td>Dilute 1:10</td></tr><tr><td>Distilled, deionized water (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Used to prepare EDTA and PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Anti-Anti solution</td></tr><tr><td>Recombinant human Wnt-3a</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Rspondin1</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human Noggin</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Water, WFI Quality</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Corning, Inc.</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Tissue Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501752</td><td>Curved or straight</td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Forceps, Curved</td><td>World Precision Instruments</td><td>503724-12</td><td>Curved or straight (503728-12)</td></tr><tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Silk, 2-0&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>Wire suture, 20 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>Cut and straighten before use.</td></tr><tr><td>Surgical Towels</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>Any similar product is acceptable.</td></tr><tr><td>Lactated Ringers Solution</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td><td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>Any similar brand is acceptable</td></tr><tr><td>IV catheter, 22 gauge</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>Controlled medication</td></tr><tr><td>Isoflurane solution</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td><td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; others are available.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray North America</td><td></td><td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td></tr><tr><td>Vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td></tr><tr><td>Fluid Pump</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td></tr></tbody></table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Isquemia intestinal permanece das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e veterinários. Muitos processos de doença resultam em isquemia intestinal, quando o fornecimento de sangue e, portanto, o oxigênio é diminuída para o intestino. Isso leva a perda da barreira intestinal e danos no tecido subjacente. Células-tronco intestinais residem na base das criptas de Lieberkühn e são responsáveis pela renovação intestinal durante a homeostase e seguir lesão. Ex vivo técnicas de cultura celular permitiram o estudo bem sucedido de interações de células-tronco epiteliais, estabelecendo as condições de cultura que suportam o crescimento dos sistemas de órgãos, como epiteliais tridimensionais (denominado "enteroids" e" colonoids"no intestino pequeno e grande, respectivamente). Estes enteroids são compostas de cripta e vilosidades, como domínios e maduro para conter todos os tipos de célula encontrados dentro do epitélio. Historicamente, murino modelos têm sido utilizados para estudar a lesão intestinal. No entanto, um modelo porcino oferece várias vantagens, incluindo a similaridade de tamanho bem como gastrointestinal anatomia e fisiologia dos humanos. Utilizando um modelo de suínos, estabelecemos um protocolo em que o segmentares loops de isquemia intestinal pode ser criado dentro de um único animal, permitindo o estudo de diferentes pontos de isquemia e reparar em vivo. Além disso, descrevemos um método para isolar e cultura de células-tronco intestinais dos loops isquêmicas do intestino, permitindo o estudo continuado de reparação epitelial, modulada por células-tronco, ex vivo.

Isquemia intestinal completa foi criada em pequenas loops intestinais utilizando oclusão vascular com suturas ou grampos, como mostrado na Figura 1. Soltando os grampos, um período controlado de reperfusão pode ser realizado, permitindo estudo adicional de lesão de reperfusão subsequente se desejado. Todos os animais sobreviveram durante o procedimento com mínima complicação até eutanásia. A complicação cirúrgica mais comum foi a hipotensão, que possa ser resolvido com a suplementação de um inotrope positivo como a dobutamina.
Se executada corretamente, lesão isquêmica começará a ponta das vilosidades intestinais e migrar para baixo dentro da cripta, como a duração dos aumentos de isquemia (Figura 2). Um erro comum com a técnica cirúrgica pode ocorrer quando os vasos sanguíneos não são ligados ou fixados uniformemente. O resultado é uma isquemia hemorrágica (Figura 3), em que a veia de paredes finas recolhe antes da artéria, permitindo a sangue adicional para se infiltrar nos tecidos. Isto é visto grosseiramente como uma escura púrpura serosas superfície (Figura 3, à esquerda) em comparação com uma superfície mais pálida durante a isquemia completa (Figura 3, direita).
Após a remoção das argolas intestinais isquêmicas, criptas intestinais foram com sucesso isoladas seguindo o protocolo de dissociação (Figura 4). Como esperado, criptas de momentos mais severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. Durante o protocolo, intestino gravemente ferido deve ser agitado suavemente para evitar danos adicionais ao tecido subjacente. Demasiado aproximadamente tremer pode resultar em novos danos de cripta e a maioria das criptas terminando no DR de soluções contendo EDTA, resultando em perturbações adicionais.
Uma vez chapeado, criptas de todos os pontos de tempo de isquemia sobrevivem e são capazes de se estabelecer na cultura (Figura 5). Quando normais e levemente danificadas criptas intestinais são banhadas em cultura, formulário de enterospheres dentro de 24-48 h. Com severos danos isquêmicos (h de 3 e 4), as criptas intestinais sobrevivem mas são danificadas, resultando na formação de esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. Em geral, há uma eficiência de crescimento diminuiu de criptas, bem como um diminuição da tamanho de enteroids, derivado do tecido intestinal severamente danificado (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figura 1 : Modelo cirúrgico da isquemia intestinal completa em um modelo porcino. A) normal jejuno porcino exteriorizado. B) mesentéricos vasos tem sido ligados com sutura criando isquemia intestinal. C) isquemia criada usando pinças vasculares buldogue para permitir a reperfusão do tecido se desejado. D) intestinal vasculatura imediatamente após a remoção dos grampos vasculares. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figura 2 : Evidência histológica (hematoxilina e eosina (H & E) mancha) de aumentar dano epitelial após períodos mais longos de isquemia intestinal completa. Dano começa na ponta das vilosidades com perda gradual da camada epitelial simples célula, embotamento das vilosidades e dano celular, estendendo-se até a cripta de base com ferimentos graves (até 4 h de duração). barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figura 3 : Evidência bruta e histológica de isquemia hemorrágica. A) bruta fotografia comparando isquemia hemorrágica (laço à esquerda) e isquemia completa (loop de direito). Quando a vasculatura não é ligada ou fixada uniformemente, sangue pode continuar a se infiltrar nos tecidos, resultando em danos e inflamação adicional. B) H & E imagens de isquemia hemorrágica de aumentar a duração de 1-4 h. Além do dano celular visto com isquemia completa, há indícios de infiltração de células vermelhas do sangue dentro da propria do lamina circundante. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figura 4 : Alíquotas de criptas intestinais isoladas de loops do intestino isquêmico e normal. Completas, intactas criptas intestinais (asteriscos) foram isoladas com êxito de cada loop do intestino. Como esperado, criptas de mais pontos de tempo severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figura 5 : Curso de tempo do crescimento de células-tronco intestinal após o isolamento de loops isquêmicas do intestino delgado. Quando normais criptas intestinais foram banhadas em cultura, enterospheres formado dentro de 24-48 h. Com graves danos isquêmicos (h de 3 e 4), criptas sobrevivem mas formam esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. 20 µm escala bar a menos que indicado. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fator de crescimento</td>
			<td>Diluente de</td>
			<td>Concentração das ações</td>
			<td>Diluição</td>
			<td>Diluição de trabalho</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>10mM de ácido acético</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: tabela de fator de crescimento reagente. Resumo das soluções estoque de fator de crescimento e soluções de trabalho utilizados no presente protocolo.

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Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Este protocolo permitirá aos leitores para estabelecer com sucesso um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar e posteriormente isolar e cultura de células-tronco para o estudo da reparação epitelial após lesão intestinais.

Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

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10.7K visualizações.  North Carolina State University. Este protocolo permitirá aos leitores para estabelecer com sucesso um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar e posteriormente isolar e cultura de células-tronco para o estudo da reparação epitelial após lesão intestinais.

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Bioengenharia

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Medicina

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Imunologia e Infecção

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Biologia

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

Modelo de lesão de isquemia-reperfusão intestinal por roedores via oclusão da artéria mesentérica superior

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Purificação de ilhotas suínas por perfusão cirúrgica de pâncreas suíno

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet xenotransplantation offers a promising alternative to allotransplantation, with the potential for large-scale production of on-demand, functional islets. The yield and viability of isolated islets is highly susceptible to the quality of the donor pancreas and the method of procurement, particularly the duration of warm-ischemia time. To improve organ preservation and subsequent islet yield and viability, we have developed a protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas. This protocol employs direct infrarenal aortic cannulation and organ perfusion to both minimize warm-ischemia time and simplify the procedure for operators who do not have extensive surgical expertise. Subsequent arterial perfusion of the pancreas via the aorta flushes stagnant blood from the microvasculature, thereby reducing thrombosis and oxidative damage to the tissue. This manuscript provides a detailed protocol for surgical perfusion and resection of the porcine pancreas, followed by islet isolation and purification.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Técnicas e desafios na purificação de ilhotas para xenotransplante

This protocol provides a step-by-step guide for the procurement of a porcine pancreas for islet isolation and purification.

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

Resumo

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Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

Modelo de lesão de isquemia-reperfusão intestinal por roedores via oclusão da artéria mesentérica superior

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares