העברת גנים בתיווך אלקטרופורציה בשריר היא טכניקה קלה ויעילה לחקר שינויים בפיזיולוגיה של השריר. מצאנו כי אלקטרופורציה אינה פוגעת בהתכווצות השרירים. אלקטרופורציה של מבני גנים לשרירים in vivo היא הליך פשוט ויעיל שאינו דורש אריזה נרחבת יותר של מבני גנים לווקטורים נגיפיים.
קשה לדמיין, לבודד ולהזריק את ה-EDL בשל מיקומו וגודלו הקטן. תרגול על פגר עכבר והזרקת דיו ביולוגי כמו דיו הודו עשויים לסייע במתן ראיות להזרקה מספקת. מי שידגים את ההליך יהיה בריאן היין, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.
לפני הזרקת העכבר, לאשר את המישור הכירורגי של הרדמה באמצעות מלקחיים עם היעדר רפלקס צביטה הבוהן, ולאחר מכן להעביר את העכבר חרוט האף נח על לוח מים במחזור ב 37 מעלות צלזיוס למשך שאר ההליך. לאחר שהעכבר ממוקם בתנוחת שכיבה, הסר את השיער משתי הגפיים האחוריות באמצעות קוצץ שיער קטן, ולאחר מכן חיטא את אזור ההזרקה עם לסירוגין 70% אתנול ובטאדין. לצורך ההזרקה אתרו את גיד הטיביאליים הקדמיים או הט"א הנראים דרך העור בצד הצדדי של הרגל התחתונה וסמנו את הקצה העליון של שריר ה-TA.
לאחר מכן החדירו מחט בעלת 30 מדים המותקנת על מיקרו-מזרק של 50 מיקרוליטר לתוך השריר בזווית רדודה של חמש מעלות אחת עד שני מילימטרים עדיפה על הצומת המיוטננדי עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר. לחץ על הבוכנה תוך כדי נסיגה איטית של המחט לאורך נתיב ההזרקה כדי להעביר 50 מיקרוליטרים של תמיסת הפלסמיד לשריר. השריר צריך להתנפח.
קבעו את הטיימר למשך דקה אחת ומדדו את עובי הרגל בשריר ה-TA, ואז הצמידו את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד. לאחר מכן הגדר את מתח האלקטרופורטור ל-12.5 וולט למילימטר. לאחר דקה אחת, הניחו את אלקטרודות הקליפר באופן הדוק סביב הגפה התחתונה מבלי להיות הדוקות יתר על המידה כדי לספק חמישה פולסים מרובעים של גלים עם משך של 20 אלפיות השנייה ומרווחים של 200 אלפיות השנייה.
השריר צריך להתעוות עם כל דופק. חזור על ההליך עם הגפה השנייה באמצעות וקטור פלסמיד הבקרה. בסיום, הסירו את העכבר מחרוט האף ואפשרו לעכבר להתאושש על משטח חימום שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס.
לאחר שהתאושש, החזירו את העכבר לכלוב שלו. כאשר העכבר במצב שכיבה, אתרו את הפסגה הקדמית של עצם השוקה באופן חזותי ובאמצעות דפיקות לב עדינות. השתמש באזמל כדי לבצע חתך רדוד דרך העור בצד הצדדי של הצמרת הקדמית של השוקה חמישה מילימטרים נחותים מהברך לשני מילימטרים עדיפים על הצומת המיוטננדי של TA.
בעזרת מספריים קטנים מנתחים באופן בוטה את החיתולית, חושפים את שריר ה- TA, ולאחר מכן מפרידים את שריר ה- TA מהטיביה בעדינות על ידי משיכת השריר כדי לחשוף את ה- extensor digitorum longus או EDL. שמור על TA ברור מה- EDL במהלך ההליך באמצעות מלקחיים מעוקלים קטנים. מכניסים את המחט בעלת 30 המדים לתוך ה-EDL לאורך עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר ומזריקה 10 מיקרוליטרים של תמיסת הפלסמיד כפי שהודגם קודם לכן.
שריר ה-EDL צריך להתנפח. מדוד את עובי הרגל ב- EDL והגדר את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד כדי לספק חמישה פולסים של גלים מרובעים כפי שהוסבר קודם לכן. בסיום, סגרו את החתך באמצעות תפרים חד פעמיים 4-0 מניילון שאינם נספגים.
מאוחר יותר הסר את העכבר מחרוט האף ואפשר לו להתאושש על משטח חימום שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס. מתן משכך כאבים תת עורי מתאים מיד לאחר הניתוח ו 12 עד 24 שעות לאחר הניתוח. לאחר שהתאושש מחזירים את העכבר לכלוב הביתי.
לאחר הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמיד pcDNA3-EGFP בשרירי TA ו- EDL, נצפה ביטוי GFP המצביע על ספיגת DNA בסיבי השריר. כאשר מצטלמים בהגדלה נמוכה יותר, ניתן היה לדמיין את יעילות ההעברה של שריר ה-EDL באמצעות מראה של סיבים ירוקים לעומת סיבים שחורים. ל-EDLs שהוזרקו ולאלקטרופורציה היו תגובות טטניות דומות ב-100 הרץ בהשוואה לשרירים הלא מוזרקים או האלקטרופורמיים של הבקרה.
ה-EDL המוזרק והאלקטרופוזי, כוח השרירים הטטאני, כוח השרירים הטטאני הספציפי, הזמן לשיא המתח ומחצית זמן ההרפיה לא נפגעו בהשוואה לשליטה הבלתי נגועה. חשוב לזהות במדויק את השריר שיש להזריק ולספק ביעילות את תמיסת הפלסמיד. ניתן לבצע מספר מדידות היסטולוגיות וביוכימיות באמצעות פרוטוקול זה.
ניתן לבצע לוקליזציה תאית של חלבון מטרה, הפלת גני מטרה, כתבים שעתוק ומערך של צביעת רקמות. טכניקה זו שימשה לזיהוי מגוון עצום של שינויים באיתות מולקולרי בשרירים במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. חקירת התכווצות השרירים לאחר העברת גנים אפשרית באמצעות טכניקה זו.
