Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

אנו מודים ד ר דוד המלך, הווארד יוז במכון הרפואי, האוניברסיטה של קליפורניה בברקלי ספקטרומטר מסה ניתוח והערות מועילות. אנו מודים ז'ו Xuelian ד ר, שנגחאי, מכוני המחקר למדעי הביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, שנחאיי, סין למתן מבנה CENP-F באורך מלא. לבסוף, אנו מודים ד ר סוזאן ביין, ד ר בריאן קאלהן, ד ר Grewer כריסטוף באוניברסיטת Binghamton על גישה לציוד. מחקר זה מומן על ידי קרן מחקר באוניברסיטת מדינת ניו יורק, במחלקה לכימיה, אוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב- Binghamton.

המחברים אין לחשוף.

שלנו assay קינאז במבחנה היא שיטה רבת עוצמה כדי לזהות מטרות מולקולריות עבור קינאז Cdk1, אשר הוא בקר מאסטר של מחזור התא, מווסת תהליכים תאיים חשובים רבים. השיטה קובעת אם חלבון מטוהרים מצע עבור Cdk1, מאפשר זיהוי של אתרי זירחון ספציפיים. זה מקל על מכניסטית ללימודי ויסות תהליכים תאיים על ידי זרחון ?...

Kinases הם אנזימים להעביר קבוצות פוספט מ- ATP על גבי מצעים ולווסת תהליכים תאיים רבים. זרחון זה הוא הפיך, מהר, מוסיף שני מטענים שליליים, ו מאחסן אנרגיה חופשית, לאחד השינויים posttranslational הנפוצים ביותר בשימוש על ידי התאים. Cdk1, אשר ידוע גם בשם homolog חלבון 2 מחזור חלוקת התא (cdc2) הוא בקר ראשיים עבור מחזור התא כל פרוקריוטים1,2,3,4,5, phosphorylates משוער 8-13% פרוטאום6,7.
בעוד מחקרים פרוטיאומיה מבנית זיהו אתרים רבים זרחון של חלבונים, ברוב המקרים, קינאז האחראי לבצע שינויים אלה אינו ידוע. מספר יעדים Cdk1 הידוע, במיוחד בתאי אדם הוא נמוך7. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשובה, שכן היא מאפשרת מכניסטית מחקרים הקובעים איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה חשוב עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, חלוקת התא, מספר עצום של תהליכים תאיים צריך להתרחש כדי לתמוך תפקיד פיזיולוגי החשוב הזה. זה כולל עצירת תמלול ותרגום לפני תחילתה של מיטוזה, וכן ארגון מחדש דרמטי בתוך המבנה התאי של הארגון, כגון פירוק של מעטפת הגרעין, כרומוזום עיבוי, פלך mitotic הרכבה. והסחר הבינלאומי שגיאות בתהליכים אלה לגרום סרטן, מומים מולדים או מוות של תאים mitotic. מעכבים ספציפיים של Cdk1 כגון RO-3306 היו מפותחות8, אשר מספקים כלים רבי-עוצמה ללימודי פונקציונלי, חלק מעכבי אלה הם כיום בניסויים קליניים לטיפול בסרטן (ראה9 לבדיקה).
כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפית Cdk1. ב הזה assay, זמינים מסחרית B Cdk1/cyclin האנושי משמש phosphorylate יישום יעד מטוהרים חלבון במבחנה. זירחון של מצע מגבירה את המאסה שלו ומוסיף שני מטענים שליליים; לכן, זרחון מוצלחת אושר על ידי משמרת כלפי מעלה של הלהקה ג'ל חלבון בדף-מרחביות. אתרי זירחון ספציפי Cdk1 לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה ניתוח של החלבון במבחנה phosphorylated. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גם כלים חישוביים והפניות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מהרצף חלבון. יתר על כן, אנו גם מתארים פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז. לבסוף, יש צורך לאמת את אתרי זירחון שזוהה על ידי מחקרים פונקציונלי, וזמינותו איגוד פשוט מתואר כאן למטרה זו. משולב, זה בגישה רב עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת לימודים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא7,10,11. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, ניתן להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות. עם זאת, אימות פונקציונלי של ה זרחון שהושג אתרי במבחנה מומלץ, כמו תאים יש מנגנונים רגולטוריים נוספים במקום, כמו שינויים posttranslational, אינטראקציה עם שותפים או לוקליזציה הסלולר זה עלול להפוך את אתרי זירחון נגיש או נגיש עבור זיהוי על-ידי Cdk1.
Cdk1 מזהה אתר זרחון הסכמה המורכבת (Ser/חמישי-Pro-X-ליס/Arg), כאשר X הוא שאריות ו סרין או תראונין הוא האתר של זרחון. חשוב במיוחד עבור זיהוי היא הנוכחות של פרולין התנוחה +1. בנוסף, שאריות בסיסי המועדפות בעמדות +2 או +3, עם רוב אתרי זירחון ספציפי Cdk1 המכיל של ליס או Arg ב +3 מקם6,12.
הפעלה של Cdk1, והיא מובילה התחלתה של מיטוזה1,2,3,4,5. הפעילות של kinases תלויי-cyclin באופן כללי תלוי שיוכן cyclins נפרדות (cyclin A, B, C, D ו- E אצל בני אדם), אשר באים לידי ביטוי ב נדנוד רמות לאורך כל מחזור התא13. Cdk1 הביטוי הוא קבוע על פני מחזור התא וכן ברגולציה של פעילותה על השיוך שלו subunits תקינה cyclin A ו- cyclin B5,13,14,15, כמו גם שינויים post-translational. היווצרות הקומפלקס B Cdk1/cyclin נדרש קינאז הפעלה5,14,15,16,17,18. בשלב G2, הוא cyclin B המתורגמת את ציטוזול ולא לייבאו לתוך גרעין איפה זה נקשר Cdk15,14,15,16,17,18; עם זאת, Cdk1/cyclin B מתקיים לא מופעל על ידי זרחון על שאריות Thr14 ו- Tyr15 על ידי kinases Cdk1-מעכבות האנושי Myt1 (ממברנה-הקשורים טירוזין תראונין ספציפיים או cdc2-מעכבות קינאז) ו- Wee1, בהתאמה19, 20,21. בשלב G2 מאוחר, dephosphorylation Thr14, Tyr15 על ידי חלוקת התא מחזור 25 פוספטאז (cdc25) מפעילה את פעילות קינאז של המתחם B Cdk1/cyclin ותפעיל את החניכה של מיטוזה12,14, 18 , 20 , 22 , 23. זרחון של Thr161 גם נדרש עבור הפעלת B Cdk1/cyclin, מתווך על ידי Cdk7, קינאז (CAK) הפעלת Cdk18. השפלה של B cyclin "אנאפאזה" חלבונית Cdk1, המאפשר יציאה מן מיטוזה24,25. הפעלה של Cdk1/cyclin B לכן תהליך מסובך. פרוטוקול המובאת כאן מתבצע באמצעות B Cdk1/cyclin זמינים מסחרית. במהלך ביטוי רקומביננטי של מתחם זה בתאי חרקים, מופעל ויוו kinases אנדוגני14,20 , נותר פעיל במדינה מטוהרים. וכתוצאה מכך פעיל, רקומביננטי האנושי Cdk1/cyclin ב' מתאים במבחנה מבחני קינאז.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לצורך זיהוי ספציפי Cdk1 אתרי זירחון ב- F (CENP-F) חלבון10צנטרומר אנושי. CENP-F הוא חלבון קינטוכור שוכנת בגרעין במשך רוב לאטמוספרה (G1 ו- S-פאזי), ייצוא של ציטוזול ב- G2 שלב26,27,28 ב באופן תלוי-Cdk110, 11. גרעיני לוקליזציה שהוענקו דו-צדדי cNLS26. cNLSs מזוהים על ידי α karyopherin פקטור נשק גרעיני, אשר מקלה, יחד עם karyopherin β RanGDP, הייבוא של cNLS-מטען לתוך גרעין29. ייצוא גרעיני בשלב G2 הוא הקל דרך מסלול10ייצוא לא ידוע. ברגע CENP-F שוכן ציטוזול, זה הוא גויס על המעטפה גרעיני והוא בתורו מגייס חלבון מוטוריים מורכבים דינאין30,31. מסלול זה חשוב למקם את הגרעין בהתאמה centrosome במהלך בשלבים הראשונים של פלך mitotic הרכבה בצורה דינאין תלויית, וזה חשוב על העיתוי הנכון של הערך mitotic ועל תהליך מהותי במוח פיתוח30,31,32. החל בשלב G2, CENP-F הוא גם לצרפן יחד קינטוכור בהם לו תפקידים חשובים עבור נאמן כרומוזום סגרגציה27,28,33,34,35 . צעד רגולטוריות. מפתח של המסלולים הללו הוא הגרעין הייצוא של CENP-F בשלב G2, אשר תלויה Cdk110,11. נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 cNLS של CENP-F. Phosphomimetic מוטציות של אתרים אלה להאט גרעיניות הייבוא של CENP-F, רומז כי B Cdk1/cyclin ישירות מסדיר הסלולר לוקליזציה של CENP-F על ידי זירחון של שלו cNLS10.
בסך הכל, זה וזמינותו קינאז במבחנה מאפשר הזיהוי של סובסטרטים ספציפי עבור קינאז Cdk1. Purified היעד החלבונים הם phosphorylated במבחנה על-ידי Cdk1/cyclin B המתחם זמינים מסחרית של אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 תומך מחקרים מכניסטית לגלות איך Cdk1 שולט מחזור התא.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &amp;ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: &amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) הוא בקר ראשיים עבור המחזור תאים פרוקריוטים כל ו phosphorylates של % 8-13 המשוערת של פרוטאום; עם זאת, המספר של מטרות מזוהה Cdk1, במיוחד בתאי אדם הוא עדיין נמוך. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשוב, כפי שהם מספקים תובנות מכניסטית איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה הוא קריטי עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, פגמים בתהליך מורכב זה להוביל סטיות כרומוזומליות וסרטן.
כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המשמש כדי לזהות אתרי זירחון ספציפית Cdk1. זה assay, חלבון מטוהרים שוכן phosphorylated במבחנה על ידי זמינים מסחרית מוצלחת ב' בני אדם Cdk1/cyclin זרחון אושר על ידי עמודים מרחביות, אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. נתאר גם פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז, ואת וזמינותו של איגוד עבור אימות פונקציונלי של האתרים זרחון מזוהה, אשר חוקרת את האינטראקציה בין אות לוקליזציה הגרעינית הקלאסית (cNLS), שלה α karyopherin קולטן של נשק גרעיני. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גישות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מ רצפי חלבונים. יחד פרוטוקולים אלה מציגים גישה רבת עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת מחקרים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, יכול להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות, במיוחד בשילוב עם לימודי תפקודי התא.

השתמשנו לאחרונה במבחנה קינאז assay (איור 1) כדי לזהות אתרי זירחון ספציפי Cdk1 קטע CENP-F שהכיל cNLS10. האות הזה מקנה גרעיני לוקליזציה של CENP-F במשך רוב לאטמוספרה. בשלב G2, CENP-F מיוצא מהגרעין ציטוזול באופן תלוי-Cdk1. כדי לקבל תובנות מכניסטית על איך Cdk1 מווסת ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.5K Views.  State University of New York at Binghamton. קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

Video: Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video