Ringraziamo il Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California a Berkeley per analisi di spettrometria di massa e utili commenti. Si ringrazia il Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, istituti per le scienze biologiche, Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina per la fornitura di un costrutto di CENP-F full-length. Infine, ringraziamo Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer at Binghamton University per l'accesso alle apparecchiature. Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione di ricerca per la State University di New York e il dipartimento di chimica, State University of New York at Binghamton.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La nostra analisi in vitro della chinasi sono un metodo molto potente per identificare bersagli molecolari per la chinasi Cdk1, che è un regolatore matrice del ciclo cellulare e regola molti processi cellulari importanti. Il metodo determina se una proteina purificata è un substrato per Cdk1 e permette l'identificazione di siti di fosforilazione specifici. Questo facilita gli studi meccanicistici per regolazione di processi cellulari da fosforilazione attraverso Cdk1.
Il fattore più critico per l'identificazione di successo dei siti di fosforilazione mediante spettrometria di massa è l'efficienza di fosforilazione del dosaggio della chinasi. L'efficienza di fosforilazione dei siti individuali dovrebbe essere più in alto possibile, preferibilmente 100%. Ciò può essere ottenuto aumentando la quantità di Cdk1/cyclin B e aumentando il tempo di incubazione per 16 h. Quando si calcola la quantità di Cdk1/ciclina B necessaria, la concentrazione molare della proteina e il numero di fosforilazione siti dovrebbero essere considerati. Ciò è particolarmente importante se sono presenti nella proteina bersaglio più siti di fosforilazione. Si deve inoltre osservare che l'attività di commercio Cdk1/ciclina B può variare da lotto a lotto, e che la chinasi può perdere rapidamente attività. Se la fosforilazione in vitro ha esito negativo, è consigliabile testare l'attività della chinasi. Come controllo positivo per la risoluzione dei problemi, può essere utilizzata in vitro la fosforilazione di CENP-F (residui 2.987-3.065). Come controllo negativo, una reazione senza aggiunta di Cdk1/ciclina B dovrebbe essere svolti ed analizzata. Un altro utile controllo negativo è l'uso di un mutante di chinasi-morti di Cdk1, che è cataliticamente inattivo a causa di una mutazione di punto semplice (D146N)47,48,49. Inoltre, per verificare i siti di fosforilazione identificati, può essere creata una versione phosphonegative della proteina bersaglio, dove i siti di fosforilazione sono sostituiti da alanine. Se i siti di fosforilazione identificati sono corretti, il mutante di phosphonegative corrispondente non può essere fosforilata in vitro.
Un semplice strumento per rilevare il successo fosforilazione della proteina dell'obiettivo è la semplice analisi dello spostamento del gel SDS-PAGE descritto qui. Proteine fosforilate in genere la migrazione più lenta su SDS-PAGE rispetto ai loro omologhi unphosphorylated, a causa della dimensione aggiunto e cariche negative. Si noti che per grandi proteine, ottimizzazione dell'analisi SDS-PAGE è necessaria per migliorare la risoluzione sufficiente a visualizzare lo spostamento del gel. Uno strumento utile per la separazione specifica delle proteine fosforilate è fosfato-associazione tag (Phos-tag) SDS-PAGE. Proteine fosforilate in un gel preparati con acrilammide Phos-tag sono visualizzati come bande più lenta migrazione rispetto ai corrispondenti defosforilata proteine50,51.
Per ottenere spettri di massa di alta qualità, è molto importante che la proteina per l'analisi in vitro della chinasi è puro e omogeneo. Il nostro protocollo di purificazione raggiunge questo combinando diversi passaggi di cromatografia altamente selettivo e impedendo la degradazione proteica e ossidazione attraverso l'aggiunta di inibitori della proteasi e riducenti. Il protocollo di purificazione può essere modificato per eluire la proteina di glutatione (cioè, con il GST-tag intatto); Tuttavia, dovrebbe essere considerato che il GST-tag aggiunge un altro 25 kDa, e grandi proteine sono difficili obiettivi per spettrometria di massa. In alternativa, il nostro protocollo di purificazione per sua6-proteine di fusione di tag possono essere utilizzati anche.
Questo protocollo può anche essere modificato per identificare i siti di fosforilazione che sono specifici per altre chinasi. L'unico requisito è che la chinasi purificata è sufficientemente stabili, attivo e disponibile. Condizioni di dosaggio necessario regolare per ogni chinasi ottenere la massima attività. Parametri per ottimizzare includono la quantità della chinasi, il tampone di reazione (pH, concentrazione di sale), tempo di incubazione, temperatura di reazione e concentrazione di ATP. Le analisi in vitro della chinasi sono state utilizzate con successo per identificare i siti di fosforilazione per molte delle chinasi compreso Kinases (chinasi polo-like)52,53,54e chinasi MAPK/ERK (proteina mitogene-attivata chinasi / extracellulare-segnale-regolato chinasi)55,56.
Mentre la forza di questo metodo è quello di identificare i siti di fosforilazione specifico in una proteina purificata, dovrebbe essere notato che un sito di fosforilazione che è un obiettivo per Cdk1 in vitro non può necessariamente essere fosforilata in vivo. A vivo, ulteriori meccanismi regolatori sono a posto, che potrebbe rendere inaccessibili per il riconoscimento di Cdk1 un sito di fosforilazione. Ad esempio, partner di interazione aggiuntiva può essere presente in vivo, che potrebbe nascondere un sito di fosforilazione o renderlo accessibile attraverso modifiche strutturali. Inoltre, il substrato deve colocalize con Cdk1/ciclina B nel nucleo nella fase G2 per essere fosforilato. Inoltre, modificazioni post-traduzionali o altri processi normativi potrebbero influenzare la conformazione del bersaglio della proteina in vivo, che potrebbe rendere inaccessibile un sito di fosforilazione. Questi limiti possono essere superati con la progettazione di esperimenti appropriati nelle celle o modelli animali che verificare che i siti di fosforilazione identificati hanno una funzione fisiologica. Qui, utilizziamo un'analisi di associazione semplice per la verifica funzionale, poiché fosforilazione diminuisce l'interazione di CENP-F con karyopherin α. Verifica funzionale deve essere eseguito anche nel contesto delle cellule o un modello animale. Di conseguenza, transfected anche proteine di fusione fluorescenti di CENP-F-frammenti contenuti del cNLS di cellule HeLa10. Le mutazioni di Phosphomimetic all'interno del cNLS CENP-f ha diminuito la localizzazione nucleare, che ha confermato una funzione fisiologica di questi siti di fosforilazione10.
Diversi strumenti sono disponibili per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione in celle o modelli animali. Le mutazioni di Phosphomimetic, che mimano gli effetti della fosforilazione di cariche negative, sono ampiamente utilizzate per questo scopo. Per questi, il sito di fosforilazione (serina o treonina) viene sostituito da aspartato o glutammato. Il vantaggio è che solo una mutazione di punto della proteina dell'obiettivo è necessaria. Dovrebbe essere notato, che mentre le mutazioni phosphomimetic sono state utilizzate con successo in molti casi per la verifica funzionale, lavorano soprattutto nei casi in cui le modifiche carica il contributore predominante per regolamento piuttosto che un cambiamento strutturale. Phosphomimetic mutazioni non riescono a imitare gli effetti della fosforilazione in molti altri casi (ad es., 11). Tuttavia, altri approcci sono disponibili per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione, compreso l'uso di phosphonegative mutazioni: queste mutazioni impediscono la fosforilazione sostituendo siti di fosforilazione con alanina. Un altro approccio utile per la verifica funzionale nel contesto cellulare è l'espressione di un mutante di chinasi-morti di Cdk1, che è inattivato da una mutazione di punto facile per introdurre (D146N)47,48,49. In particolare, diverse piccole molecole inibitori della Cdk1 sono commercialmente disponibili come Flavopiridol e RO-3306, che può essere utilizzato per studi funzionali in cellule o modelli animali7,8,11. Questi inibitori sono ben caratterizzati, e in studi clinici per il trattamento del cancro (per una recensione Vedi9) sono diversi.
Mentre un gran numero di siti di fosforilazione della proteina è stato identificato in studi di proteomica, la specificità della chinasi è nella maggior parte dei casi sconosciuta, e l'analisi in vitro della chinasi è uno dei pochi metodi disponibili per identificare i substrati di Cdk1. Sono stati utilizzati anche altri approcci. CDK1 obiettivi sono stati identificati utilizzando un enzima Cdk1 ingegnerizzato. Ha una grande tasca di associazione di substrato e accetta le versioni più ingombranti del trifosfato di adenosina come un substrato6. Questo substrato ingombrante non può associare a chinasi di selvaggio-tipo. L'aggiunta di ATP radiomarcato ingombranti a una cella estratto che contiene l'enzima Cdk1 modificata di conseguenza conduce per l'etichettatura specifica dei substrati diretti di Cdk1. 200 Cdk1 obiettivi sono stati identificati nel lievito gemmante con questo metodo; Tuttavia, non può essere applicato per cellule di mammifero, che è una limitazione fondamentale. In un altro studio, Cdk1 substrati sono stati identificati in cellule umane di esecuzione dell'analisi quantitativa fosfoproteomica con due piccole molecole inibitrici di Cdk1, Flavopiridol e RO-3306. 1215 fosfopeptidi su 551 proteine sono stati ridotti significativamente su Cdk1 inibitore aggiunta7. Questo metodo può schermare un intero proteoma per potenziali bersagli Cdk1, ma con conseguente necessità di obiettivi da verificare, ad esempio, da una chinasi in vitro test.
In futuro, l'analisi in vitro della chinasi probabilmente saranno combinato con schermi di throughput elevato per Cdk1 substrati che sono attualmente in fase di sviluppo. A causa del gran numero di substrati Cdk1 nel proteoma, umano Cdk1 molti substrati devono ancora essere identificati, e l'analisi in vitro della chinasi sarà uno strumento importante per identificare, mappa e verificare questi siti.
L'analisi in vitro della chinasi è un potente strumento per identificare gli obiettivi per la chinasi Cdk1 e per identificare i siti di fosforilazione specifici. L'identificazione di questi siti di fosforilazione consente studi meccanicistici per la regolazione dei processi cellulari di Cdk1.

Le chinasi sono enzimi che regolano molti processi cellulari e trasferiscono gruppi fosfato da ATP su substrati. Questa fosforilazione è reversibile, veloce, aggiunge due cariche negative e memorizza l'energia libera ed è uno delle modificazioni post-traduzionali più comune usate dalle cellule. CDK1, che è anche conosciuto come omologo di proteina 2 ciclo di divisione cellulare (cdc2) è un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti1,2,3,4,5e fosforila un orario 8-13% del proteoma6,7.
Mentre gli studi di proteomica recenti hanno identificato molti siti di fosforilazione di proteine, nella maggior parte dei casi, la chinasi responsabile di queste modificazioni è sconosciuta. Il numero di bersagli Cdk1 noti, in particolare nelle cellule umane è basso7. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto consente studi meccanicistici che stabiliscono come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è importante per la segregazione del cromosoma fedele e la divisione cellulare, e una miriade di processi cellulari devono verificarsi per supportare questa importante funzione fisiologica. Questo include arrestare trascrizione e traduzione prima dell'inizio della mitosi, come pure una riorganizzazione drammatica nella struttura cellulare e organizzazione, ad esempio lo smontaggio dell'involucro nucleare, condensazione cromosomica, Assemblea del fuso mitotico e. Deregolamentazione e gli errori in questi processi causano cancro, difetti di nascita o morte cellulare mitotica. Inibitori specifici di Cdk1 come RO-3306 sono stati sviluppati8, che forniscono potenti strumenti per studi funzionali, e alcuni di questi inibitori sono attualmente nei test clinici per il trattamento del cancro (Vedi9 per la revisione).
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici. In questo test, disponibili in commercio umano Cdk1/ciclina B è utilizzato per fosforilare un obiettivo purificato della proteina in vitro. Fosforilazione di un substrato aumenta la sua massa e aggiunge due cariche negative; di conseguenza, fosforilazione successo è confermata da uno spostamento verso l'alto della band gel di proteina su SDS-PAGE. Siti di fosforilazione CDK1 specifici sono successivamente identificati dall'analisi di spettrometria di massa della proteina in vitro fosforilato. Per aiutare con disegno sperimentale, esaminiamo anche strumenti computazionali e riferimenti per la previsione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici dalla sequenza della proteina. Inoltre, descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi. Infine, i siti di fosforilazione identificata devono essere verificati da studi funzionali e un'analisi di associazione semplice è descritto qui per tale scopo. Combinato, questo è un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare7,10,11. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi risultati affidabili di modello, organismo e rendimenti. Tuttavia, è consigliabile verifica funzionale dei siti fosforilazione ottenuti in vitro , come le cellule hanno ulteriori meccanismi di regolamentazione in vigore, come modifiche di posttranslational, partner di interazione o localizzazione cellulare che può rendere siti di fosforilazione accessibile o inaccessibile per il riconoscimento di Cdk1.
CDK1 riconosce un sito di fosforilazione di consenso che si compone di (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), dove X è ogni residuo e una serina o treonina è il sito di fosforilazione. Particolarmente importante per il riconoscimento è la presenza della prolina in posizione + 1. Inoltre, i residui di base sono preferiti nelle posizioni + 2 o + 3, con la maggior parte dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici contenenti un Lys o Arg presso il + 3 posizione6,12.
Attivazione di Cdk1 è strettamente regolato e conduce all'inizio della mitosi1,2,3,4,5. L'attività di chinasi ciclina-dipendenti in generale dipende dalla loro associazione con distinte cicline (ciclina A, B, C, D ed E in esseri umani), che si sono espressi a livelli durante il ciclo cellulare13di oscillazione. L'espressione CDK1 è costante attraverso il ciclo cellulare e la regolazione della sua attività si basa sulla sua associazione con la subunità regolatorie cicline A e ciclina B5,13,14,15, come Beh come modificazioni post-traduzionali. Formazione del complesso Cdk1/ciclina B è necessaria per le chinasi attivazione5,14,15,16,17,18. Nella fase G2, ciclina B è tradotto nel citosol e importato nel nucleo dove si lega a Cdk15,14,15,16,17,18; Tuttavia, Cdk1/ciclina B è detenuto inattivato da fosforilazione in residui Thr14 e Tyr15 dalla chinasi Cdk1-inibitorio umani Myt1 (chinasi cdc2-inibitorio di membrana-collegato della tirosina e treonina-specifiche) e Wee1, rispettivamente19, 20,21. La fine della fase G2, defosforilazione di Thr14 e Tyr15 dalla divisione cellulare ciclo 25 fosfatasi (cdc25) attiva l'attività della chinasi del complesso Cdk1/cyclin B e innesca l'inizio della mitosi12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforilazione di Thr161 è anche necessaria per l'attivazione di chinasi ciclina Cdk1/B ed è mediato da Cdk7, l'attivazione di Cdk chinasi (CAK)18. Degradazione del cyclin B in anafase inattiva Cdk1, permettendo l'uscita dalla mitosi24,25. L'attivazione della chinasi Cdk1/ciclina B è pertanto un processo complicato. Il protocollo presentato qui viene eseguito con commercialmente disponibili Cdk1/ciclina B. Durante espressione ricombinante di questo complesso in cellule di insetto, essa è attivata in vivo di chinasi endogene14,20 e resta attiva nello stato purificato. La risultante attiva, ricombinante umano Cdk1/ciclina B è adatto per le analisi in vitro della chinasi.
Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici nel centromero umano proteina F (CENP-F)10. CENP-F è una proteina di cinetocore che risiede nel nucleo durante la maggior parte di interfase (G1 e fase S) e viene esportata nel citosol in G2 fase26,27,28 in un dipendente Cdk1 modo10, 11. localizzazione nucleare è conferita da un bipartito cNLS26. cNLSs sono riconosciuti dal trasporto nucleare di fattore α karyopherin, che facilita, insieme a β di karyopherin e RanGDP, l'importazione del cNLS-carico nel nucleo29. Export nucleare nella fase G2 è facilitata tramite un percorso di esportazione sconosciuto10. Una volta CENP-F risiede nel citosol, esso viene reclutato alla busta nucleare e reclute a sua volta il motore della proteina dineina complesso30,31. Questo percorso è importante posizionare il nucleo rispettivo per il centrosoma durante le fasi iniziali di assemblaggio del fuso mitotico in modo dineina-dipendente, che è importante per la corretta fasatura della voce mitotica e per un processo fondamentale nel cervello sviluppo30,31,32. A partire dalla fase G2, CENP-F è anche assemblati nel cinetocore dove ha ruoli importanti per fedele cromosoma segregazione27,28,33,34,35 . Un passo fondamentale di regolamentazione di queste vie è l'esportazione nucleare di CENP-F nella fase G2, che è dipenda Cdk110,11. Descriviamo qui un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici in cNLS CENP-f. Le mutazioni di Phosphomimetic di questi siti rallentano importazione nucleare di CENP-F, suggerendo che Cdk1/ciclina B regola direttamente la localizzazione cellulare di CENP-F da fosforilazione di sua cNLS10.
Nel complesso, questa analisi in vitro della chinasi permette l'identificazione di substrati specifici per proteine chinasi Cdk1. depurata bersaglio sono fosforilati in vitro di commercialmente disponibile Cdk1/ciclina B complesso e i siti di fosforilazione Successivamente vengono identificati mediante spettrometria di massa. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici supporta studi meccanicistici che rivelano come Cdk1 controlla il ciclo cellulare.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &amp;ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: &amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e fosforilano un stimato 8-13% del proteoma; Tuttavia, il numero degli obiettivi identificati per Cdk1, particolarmente in cellule umane è ancora basso. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto forniscono meccanicistici intuizioni come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione del cromosoma fedele, e difetti in questo processo complicato portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che è utilizzata per identificare siti di fosforilazione Cdk1 specifici. In questo saggio, una proteina purificata è fosforilata in vitro di commercialmente disponibile umano Cdk1/ciclina B. Successful fosforilazione è confermata da SDS-PAGE, e siti di fosforilazione sono successivamente identificate mediante spettrometria di massa. Descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi e un'analisi obbligatoria per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione identificati, che l'interazione tra le sonde un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) e relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. Per aiutare con disegno sperimentale, passiamo in rassegna gli approcci per la stima dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici da sequenze proteiche. Insieme questi protocolli presentano un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi modello organismo e rendimenti risultati affidabili, specialmente se combinata con studi funzionali delle cellule.

Abbiamo recentemente utilizzato una in vitro analisi della chinasi (Figura 1) per identificare i siti di fosforilazione Cdk1 specifici in un frammento di CENP-F che conteneva un cNLS10. Questo segnale conferisce la localizzazione nucleare di CENP-F durante la maggior parte di interfase. Nella fase G2, CENP-F viene esportato dal nucleo al cytosol in modo Cdk1-dipendente. Per ottenere meccanicistici intuizioni su come Cdk1 regola la localizzazione cellulare di CENP-F, abbiamo analizzato la sequenza di CENP-F per predire i siti di fosforilazione Cdk1 specifici, utilizzando il server di iGPS36,37. All'interno del cNLS CENP-f, tre siti di fosforilazione Cdk1 specifici erano predisse a residui 3.042, 3045 e 3.048 (tabella 1). Un altro sito di fosforilazione Cdk1 specifico è stato previsto anche per residui 3.007 (tabella 1)10. Di conseguenza, abbiamo supposto che Cdk1 regola localizzazione CENP-F direttamente dalla fosforilazione della sua cNLS.
Per verificare se il cNLS CENP-f è un substrato per Cdk1, abbiamo effettuato un'analisi in vitro della chinasi con il frammento di CENP-F umano purificato (residui 2.987-3.065) e umano Cdk1/ciclina b. In vitro fosforilato CENP-F è stato analizzato il 16% SDS-PAGE, insieme con un controllo negativo che mancava la chinasi Cdk1 (Figura 2A)10. Per in vitro fosforilato CENP-F, uno spostamento chiaro verso l'alto è osservato per la banda sul gel rispetto al controllo negativo. Questo è tipico delle proteine fosforilate come ogni gruppo fosfato aggiunge due cariche negative e massa addizionale. Questi risultati indicano che CENP-F viene fosforilato da Cdk1/ciclina B10.
Per determinare il numero di siti di fosforilazione di CENP-F e quantificare l'efficacia di fosforilazione di questi siti, intatto in vitro fosforilato CENP-F frammento (84-mer) è stato analizzato da spettrometria di massa (ESI-ITMS)10. L'ESI-ion trap massa dello spettro osservato (Figura 2B) suggerisce che il frammento di CENP-F intatto è fosforilato a quattro siti (tabella 1)10.
La posizione dei siti fosforilati dell'amminoacido nella sequenza di CENP-F è stata valutata dall'esame triptico digest di ESI-FTICR Sig. ra tripsina fende catene proteiche dopo lisine e arginine e un digest di tripsina del frammento CENP-F ha provocato diversi peptidi, tra cui uno che conteneva residui 3.031-3, 052. Spettri di massa di questo peptide CENP-F erano costanti con la fosforilazione a residui T3042, T3045 e S3048, che si trovano all'interno del cNLS (tabella 1)10. Spettri di massa di un altro peptide triptico (residui 2.995-3.016) erano costanti con la fosforilazione a S3007 (tabella 1)10. Tutti i quattro siti di fosforilazione Cdk1 specifici sono stati anche previsto dalla sequenza. CDK1 specifici substrati contengono spesso una prolina accanto il residuo che è fosforilata6, come osservato per i residui T3042, T3045 e S3007. Si noti che S3048 è un sito di fosforilazione Cdk1 specifici un po' insolito, come una fenilalanina si trova accanto la serina. Per concludere, i risultati indicano che CENP-F è fosforilata specificamente ai residui 3.007, 3.042 e 3.045 3.048 dalla chinasi Cdk1. Tre di questi residui sono situati all'interno del cNLS CENP-f (tabella 1), che indica che Cdk1 può regolare la localizzazione cellulare di CENP-F attraverso la fosforilazione del cNLS nella fase G2, quando Cdk1 diventa attivo10.
Per verificare che questi siti di fosforilazione Cdk1 specifiche hanno una funzione fisiologica, abbiamo creato il phosphomimetic variante S3048D10. Phosphomimetic mutazioni imitano gli effetti della fosforilazione di residui caricati negativamente. Successivamente, abbiamo purificato la versione phosphomimetic del frammento CENP-F che conteneva il cNLS. Il cNLS CENP-f viene riconosciuto dal trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α, che si lega con alta affinità ed è necessaria per l'importazione nucleare CENP-f. Per verificare se la mutazione di phosphomimetic indebolisce l'interazione tra il cNLS CENP-f con relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α, abbiamo effettuato un'associazione test (Figura 3)10. In questi esperimenti, un frammento purificato di CENP-F (wild-type o la variante S3048D) è stato mescolato con α karyopherin umano purificato, e la miscela è stata separata da cromatografia di esclusione di formato analitico. Inoltre, le proteine inoltre sono state analizzate singolarmente. Analisi di SDS-PAGE delle frazioni eluizione ha rivelato che il frammento di CENP-F di selvaggio-tipo con il cNLS interagisce fortemente con karyopherin α, poiché entrambe le proteine co-eluire (Figura 3)10. Tuttavia, solo una quantità trascurabile del frammento CENP-F S3048D associa a karyopherin α, e queste proteine eluire separatamente (Figura 3)10. Questi risultati suggeriscono che la fosforilazione del residuo 3.048 del cNLS CENP-f avrebbe un forte effetto sull'interazione con il trasporto nucleare di fattore α di karyopherin. Dovrebbe essere notato che tariffe di importazione nucleare dipendono altamente l'affinità di un segnale di localizzazione nucleare verso un trasporto nucleare fattore46, e di conseguenza, si prevede che queste mutazioni rallentano importazione nucleare10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica della Cdk1 l'analisi in vitro della chinasi. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig2.jpg"> Figura 2: CENP-F viene fosforilato da Cdk1/ciclina B. (A) per identificare Cdk1 siti di fosforilazione specifici, un'analisi in vitro della chinasi è stata eseguita con purificato CENP-F (residui 2.987-3.065). Analisi di SDS-PAGE di un controllo negativo senza Cdk1/ciclina B sono mostrato nella corsia di sinistra (-Cdk1), accanto a in vitro fosforilato CENP-F nella corsia giusta (+ Cdk1). Standard di peso molecolare sono indicati. Si noti che lo spostamento verso l'alto di fosforilata CENP-F su SDS-PAGE, che è coerente con la fosforilazione di successo. CDK1 e ciclina B appaiono come bande deboli in 34 kDa e 60 kDa. (B) spettrometria di massa ESI-ion trap intatto fosforilato CENP-f da (A) è stata utilizzata per determinare il carico del fosfato della CENP-F fosforilato intatto (84-mer). Lo spettro di massa corrispondente è mostrato. L'intensità è tracciata contro il rapporto massa / carica (m/z). Lo spettro Mostra il + 10 a + 14 Stati di carica del frammento CENP-F intatto dopo fosforilazione. Esse indicano una popolazione di specie con 0, 1, 2, 3 e 4 esteri fosforici. Per quantificare il rapporto di ogni specie di quantità di proteine totali, le altezze di picco sono state determinate e rispetto (tabella 1). Questa figura è stata modificata da10 ed è stato riprodotto con il permesso dall'editore Taylor and Francis. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig3.jpg"> Figura 3: verifica funzionale: le mutazioni di phosphomimetic di CENP-F diminuiscono fortemente l'interazione con il trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. (A–F) Purificato frammenti CENP-F (residui 2.987-3.065) (0,1 mg) e purificato karyopherin α (0,7 mg) e sono stati mescolati nel rapporto molare 1:1 e analizzati da cromatografia di esclusione di formato. I frammenti di CENP-F e karyopherin α inoltre sono stati analizzati singolarmente. Analisi di SDS-PAGE delle frazioni picco sono mostrato. Volumi di eluizione sono indicate sulla parte inferiore (in incrementi di 0,6 mL). Sulla sinistra, le posizioni delle bande di marcatore di peso molecolare e le loro messe in kDa sono indicate. Un asterisco segna tracce di residui GST (glutatione S-transferasi). (A) Karyopherin α. (B) profili di eluizione. L'assorbanza a 280 nm è tracciata contro il volume di eluizione. Il profilo di eluizione di karyopherin α (rosso) è overlaid con profili di eluizione di miscele di karyopherin α con frammenti di CENP-F (selvaggio-tipo: verde; phosphomimetic S3048D mutante: blu). Si noti che aggiunta del frammento selvaggio-tipo CENP-F sposta il volume di eluizione del picco α karyopherin di massa superiore, che è coerenza con l'associazione del frammento di selvaggio-tipo CENP-F. Questo spostamento non è osservato quando viene aggiunto il frammento di CENP-F con la mutazione di phosphomimetic S3048D, suggerendo che la mutazione di phosphomimetic diminuisce notevolmente l'interazione di CENP-F con karyopherin α. (C) frammento di selvaggio-tipo CENP-F (wt) e karyopherin α. (D) frammento di wt CENP-F. (E) CENP-F S3048D frammento e karyopherin α. frammento di S3048D CENP-F (F). Questa figura è stata creata con dati da10. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tabella 1A. Sequenza del frammento CENP-F (residui 2987-3065) con predetto siti di fosforilazione Cdk1 specifici evidenziati dalla dimensione del carattere più grande. Triptici frammenti sono evidenziate in grassetto e sottolineati.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GPLGSQQSKQDSRGSPLLGPVVPGPSPIPSVTEKRLSSGQNKAS</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GKRQRSSGIWENGGGPTPATPESFSKKSKKAVMSGIHPAE</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Tabella 1B. Analisi di spettrometria di massa della intatto CENP-F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">mer 84 dopo fosforilazione in vitro con Cdk1/ciclina B</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>n # di siti di fosforilazione (P) rilevato</td>
			<td>Carico del fosfato espresso come % delle proteine totali</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">CENP-F 2987-3065</td>
			<td>0P</td>
			<td>6%</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 P</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2P</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>3P</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4P</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Tabella 1 Analisi di spettrometria di massa dei peptidi triptici CENP-f dopo fosforilazione in vitro con Cdk1/ciclina B</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>n # di siti di fosforilazione</td>
			<td>Carico del fosfato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfopeptide trittico,</td>
			<td>0P</td>
			<td>57%</td>
		</tr>
<tr>
<td>residui di 2995-3016</td>
			<td>1 P</td>
			<td>43%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfopeptide trittico,</td>
			<td>0P</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td>residui di 3031-3052</td>
			<td>1 P</td>
			<td>64%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2P</td>
			<td>29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>3P</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Analisi di spettrometria del frammento CENP-F di massa dopo fosforilazione in vitro con Cdk1/ciclina B. Questa tabella è stata creata con dati da10.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.6K Views.  State University of New York at Binghamton. Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Ricerca

Biochimica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

<meta charset="utf8"></head><body>Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologia

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

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Saggi non radioattivi in vitro della catena leggera della miosina cardiaca

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Saggiare l'attività chinasi di LRRK2 In vitro

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine vegetali Complessi

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