Agradecemos o Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, Universidade da Califórnia em Berkeley por análise de espectrometria de massa e comentários úteis. Agradecemos o Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutos de ciências biológicas, da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China para fornecer uma construção completo do CENP-F. Finalmente, agradecemos a Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer na Binghamton University para acesso ao equipamento. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de pesquisa para a Universidade Estadual de Nova York e o departamento de química, Universidade Estadual de Nova York em Binghamton.

Os autores não têm nada para divulgar.

Nosso ensaio da quinase em vitro é um método muito poderoso para identificar alvos moleculares para a quinase Cdk1, que é um controlador mestre do ciclo celular e regula muitos processos celulares importantes. O método determina se uma proteína purificada é um substrato para a Cdk1 e permite a identificação dos sítios de fosforilação específica. Isto facilita estudos mecanicistas para regulação de processos celulares por fosforilação através de Cdk1.
O fator mais crí...

As cinases são enzimas que tranferem grupos fosfato do ATP para substratos e regulam muitos processos celulares. Esta fosforilação é reversível, rápido, adiciona duas cargas negativas e armazena energia livre e é uma das modificações posttranslational mais comuns usadas pelas células. Cdk1, que é também conhecido como o homólogo de proteína 2 de ciclo de divisão celular (cdc2) é um controlador mestre do ciclo celular em todos os eucariontes1,2,3,4,5e fosforila um Estima-se 8-13% do proteome6,7.
Enquanto estudos recentes de proteomic identificaram muitos sítios de fosforilação de proteínas, na maioria dos casos, a quinase responsável por essas modificações é desconhecida. O número de conhecidos destinos Cdk1, particularmente em células humanas é baixo7. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como permite estudos mecanicistas que estabelecem como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é importante para a segregação do cromossomo fiel e divisão celular, e uma miríade de processos celulares precisam ocorrer para apoiar esta importante função fisiológica. Isso inclui travar a transcrição e tradução antes do início da mitose, bem como uma reorganização dramática na estrutura celular e organização, tais como a desmontagem do envoltório nuclear, condensação do cromossomo e montagem do fuso mitótico. Desregulamentação e erros nestes processos causam câncer, defeitos de nascimento ou morte celular mitótica. Inibidores específicos de Cdk1 como RO-3306 foram desenvolvidos8, que fornece ferramentas poderosas para estudos funcionais, e alguns destes inibidores são atualmente em ensaios clínicos para tratamento de câncer (veja9 para revisão).
Aqui, descrevemos um em vitro quinase que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B é usado para fosforilar um alvo purificado da proteína em vitro. Fosforilação do substrato aumenta a sua massa e adiciona duas cargas negativas; Portanto, fosforilação sucesso é confirmada por um deslocamento para cima da banda gel de proteína em SDS-PAGE. Sites específicos de Cdk1 fosforilação são posteriormente identificados por análise de espectrometria de massa da proteína em vitro fosforilada. Para ajudar com delineamento experimental, revisamos também ferramentas computacionais e referências para a previsão dos sítios de fosforilação Cdk1 específica da sequência de proteínas. Além disso, podemos também descrever protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase. Finalmente, os sítios de fosforilação identificado devem ser verificados por estudos funcionais, e um ensaio simples é descrito aqui para essa finalidade. Combinada, esta é uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular7,10,11. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a quaisquer resultados fiáveis modelo organismo e rendimentos. No entanto, é recomendada verificação funcional da fosforilação obtidos sites em vitro , como as células têm mecanismos reguladores adicionais no lugar, como modificações posttranslational, parceiros de interação ou localização celular que pode processar sites fosforilação acessível ou inacessível para reconhecimento por Cdk1.
Cdk1 reconhece um site de fosforilação de consenso que consiste em arquivos em (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), onde X é qualquer resíduo e uma serina ou treonina é o sítio de fosforilação. Especialmente importante para o reconhecimento é a presença da prolina na posição + 1. Além disso, os resíduos básicos são preferidos nas posições + 2 ou + 3, com a maioria dos sites de fosforilação Cdk1 específicas contendo um Lys ou Arg + a 3 posição6,12.
Ativação de Cdk1 é fortemente regulamentada e leva ao aparecimento de mitose1,2,3,4,5. A atividade de quinases cyclin-dependente em geral depende de sua associação com ciclinas distintas (ciclina A, B, C, D e E em seres humanos), que são expressos em níveis durante todo o ciclo celular13de oscilação. Expressão de Cdk1 é constante em todo o ciclo celular e a regulação da sua actividade baseia-se na sua associação com as subunidades reguladoras cyclin A e cyclin B5,13,14,15, como bem como modificações borne-translational. Formação do complexo Cdk1/cyclin B é necessária para a quinase ativação5,14,15,16,17,18. Na fase G2, ciclina B é traduzido no citoplasma e importada para o núcleo onde se liga ao Cdk15,14,15,16,17,18; no entanto, B Cdk1/cyclin realiza inativada por fosforilação em resíduos Thr14 e Tyr15 pelos humano Cdk1-inibitório quinases Myt1 (quinase cdc2-inibitório de membrana-associado tirosina e treonina-específico) e Wee1, respectivamente,19, 20,21. Na fase tardia do G2, desfosforilação de Thr14 e Tyr15 por divisão celular ciclo 25 fosfatase (cdc25) ativa a atividade da quinase do complexo Cdk1/cyclin B e desencadeia o início da mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. a fosforilação de Thr161 também é necessária para ativação de Cdk1/cyclin B e é mediada por Cdk7, o Cdk-activação da quinase (CAK)18. Degradação da ciclina B em anáfase inactivates Cdk1, permitindo a saída de mitose24,25. Ativação de Cdk1/cyclin B, portanto, é um processo complicado. O protocolo aqui apresentado é realizado com b de Cdk1/cyclin comercialmente disponível. Durante a expressão recombinante deste complexo em células de inseto, é ativado na vivo por quinases endógena14,20 e permanece ativa no estado purificado. Resultante ativo, recombinante humana Cdk1/cyclin B é apropriado para ensaios de quinase em vitro .
Aqui, descrevemos um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicas do centrômero humano proteína F (CENP-F)10. CENP-F é uma proteína de cinetócoro que reside no núcleo durante a interfase (G1 e S-fase) e é exportada para o citosol no G2 fase26,,27,28 em uma maneira dependente Cdk110, 11. localização nuclear é conferida por um bipartido cNLS26. cNLSs são reconhecidos pelo transporte nuclear factor carioferinas α, que facilita, em conjunto com carioferinas β e RanGDP, a importação de cNLS-carga para o núcleo de29. A exportação nuclear na fase G2 é facilitada através de uma exportação desconhecido caminho10. Uma vez que o CENP-F reside no citosol, ele é recrutado para o envelope nuclear e recrutas por sua vez o motor proteína Dineína complexo30,31. Esta via é importante posicionar o núcleo respectivo para a centrossoma durante os estágios iniciais da montagem do fuso mitótico de forma dependente de Dineína, que é importante para o timing correto de entrada mitótica e para um processo fundamental no cérebro desenvolvimento de31,30,32. Começando na fase G2, CENP-F é também montado no cinetócoro onde tem papéis importantes para cromossomo fiel segregação27,28,33,34,35 . Um passo chave reguladora destas vias é a exportação nuclear do CENP-F na fase G2, que é dependente de Cdk110,11. Descrevemos aqui um protocolo para a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específicos no cNLS do CENP-F. Phosphomimetic mutações desses sites devagar importação nuclear do CENP-F, sugerindo que B Cdk1/cyclin diretamente regula a localização celular do CENP-F por fosforilação de sua cNLS10.
Em geral, este ensaio da quinase em vitro permite a identificação de substratos específicos para proteínas quinase Cdk1. Purified alvo são fosforilada em vitro pelo complexo B Cdk1/cyclin comercialmente disponível e os locais de fosforilação posteriormente são identificados por espectrometria de massa. A identificação dos sítios de fosforilação específica Cdk1 suporta mecanicistas estudos que revelam como a Cdk1 controla o ciclo celular.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &amp;ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: &amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é um controlador mestre para o ciclo celular em todos os eucariontes e fosforila um estimado 8-13% da proteoma; no entanto, o número de destinos identificados para Cdk1, particularmente em células humanas ainda é baixo. A identificação dos sítios de fosforilação Cdk1 específico é importante, como eles fornecem mecanicistas insights sobre como Cdk1 controla o ciclo celular. Regulação do ciclo celular é essencial para a segregação do cromossomo fiel, e defeitos neste processo complicado levam a aberrações cromossômicas e câncer.
Aqui, descrevemos um em vitro quinase que é usado para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos. Neste ensaio, uma proteína purificada é fosforilada em vitro por comercialmente disponível humana Cdk1/cyclin B. bem sucedido fosforilação é confirmada por SDS-PAGE, e locais de fosforilação são posteriormente identificados por espectrometria de massa. Descrevemos também protocolos de purificação que o rendimento de preparações de proteína altamente puro e homogêneo apropriadas para o ensaio da quinase e um ensaio para a verificação funcional dos sítios identificados fosforilação, que explora a interação entre um sinal de localização nuclear clássica (cNLS) e seu transporte nuclear receptor carioferinas α. Para ajudar com delineamento experimental, revemos abordagens para predição de sítios de fosforilação Cdk1 específicas de sequências de proteínas. Juntos esses protocolos apresentam uma abordagem muito poderosa que produz sites de fosforilação Cdk1 específicos e permite estudos mecanicistas em como Cdk1 controla o ciclo celular. Desde que esse método se baseia em proteínas purified, pode ser aplicado a qualquer modelo organismo e produz resultados confiáveis, especialmente quando combinado com estudos funcionais de célula.

Recentemente nós usamos um em vitro quinase (Figura 1) para identificar locais de fosforilação Cdk1 específicos em um fragmento do CENP-F que continha um cNLS10. Este sinal confira localização nuclear do CENP-F durante a maior parte da interfase. Na fase G2, CENP-F é exportado do núcleo para o citosol na forma Cdk1-dependente. Para obter insights mecanicistas sobre como Cdk1 regula a localização celular do CENP-F, an...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.6K visualizações.  State University of New York at Binghamton. Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Vídeo: Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Bioquímica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologia

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Resumo

Explore mais vídeos

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

Ensaios de quinase de cadeia leve de miosina cardíaca in vitro não radioativos

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening