העבודה נתמכה על ידי פרס מספר P30DK056336 מ נבחרת המכון של סוכרת, עיכול, מחלות כליה באמצעות מענק פיילוט תזונה, השמנת יתר מרכז מחקר ב אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם NCR.

REQS מורכב צג פעילות דרוזופילה יחידה (עבור מקור מידע, אנא ראה טבלה של חומרים) רכוב על זרוע מסתובבת הנשלט על ידי יחידת המנוע (איור 1). הצג פעילות קובעת כמה פעמים בפרק זמן נתון המערך של קרני לייזר לנתח אמצע הצינור assay מופרת. איורים מפורטים, אפיון מעמיק של, ראה שלנו הפרסום הקודם9. בעוד המערכת שלנו משתמשת יחידת LAM25H, REQS יכול להיות שונה כדי להתאים את יחידות צג פעילות דרוזופילה אחרות גם כן.
1. בדיקת ההגדרה של REQS
<ol><li>עומס מבחן עף לתוך צינורות זכוכית הדגימה על ידי מאלחש את החיות עם CO2 או שיטה אחרת שבחרת עבור טיפול, להעביר אותם לתוך הצינורות ריק, וכיסוי עליון הצינורות.</li>
	<li>הכנס צינורות זכוכית רצ'ט הדגימה לתוך החריצים של יחידת הצג פעילות. לאבטח את צינורות גומי טבעות O (מד 17-18) באמצעות ו/או גומיות בשני הצדדים של היחידה להבטיח הצינורות לא זז במהלך סיבוב:<ol>
<li>להחליק o-ring אחד מעל הצינור הדגימה ומקם את o-ring בקרבת נקודת האמצע של הצינור. הוספת הצינור הדגימה לתוך חריץ של צג פעילות מהחזית, מרכז זה.</li>
		<li>להזיז את o-ring כנדרש ולהבטיח כי ברגע הצינור הדגימה ממורכזת, o-ring הוא החליקה שיותר יחידת צג פעילות ככל האפשר. לתקן את הצינור הדגימה במקום על ידי מחליקה o-ring השני מעל מבחנה מאחורה, שוב זז o-ring של קרוב צג פעילות היחידה האפשרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ליזום סבב REQS על-ידי היפוך מתג ההפעלה בחלק הקדמי של היחידה. להתאים את מהירות הסיבוב עם החוגה בחזית של היחידה על המהירות הרצויה (4 rpm (סיבובים כל דקות) בדוגמה זו). הערה: מהירות הסיבוב בדוגמה זו נבחרה כדי להתאים מחקר שפורסם בעבר7. ככל במהירויות הסיבוב שונות תגרום ברמות פעילות בעלי חיים שונים, כאשר ייזום מחקר חדש, אופטימיזציה של מהירות הסיבוב עבור הגדרת ניסיוני ספציפי (גנוטיפ, אורך לגבי פעילות גופנית, וכו ') עשוי להיות נחוץ. הערה: חשוב לוודא כי הצינורות ממוקמות כהלכה, כך שהם לא לגרור לאורך החלק התחתון של היחידה REQS במהלך הסיבוב.</li>
	<li>בדוק את החיבור למערכת איסוף הנתונים המסופקים עם יחידת צג פעילות דרוזופילה על ידי פתיחת התוכנה DAMSystem308 ולהבטיח כי האור חיבור נשאר ירוק עבור מספר סבבים. התוכנה תתחיל ההקלטה לתוך קובץ טקסט "monitorX" (X להיות מספר יחידה אם צגים מרובים נמצאים בשימוש) מיד באתחול. הקלטה תדירות יכול להיות מותאם בלשונית "העדפות"; אנחנו בדרך כלל להקליט במרווחי זמן של 5 דקות.</li>
	<li>לחקור את קובץ הטקסט שנוצר על ידי תוכנת DAMSystem308 כדי להבטיח חיבור הנתונים מתפקד כראוי. בעיות עם החיבור לגרום מגזרות, נקודות זמן שבו פעילות 0 נרשם עבור כל העמדות ב REQS (ראה נציג תוצאות , טבלה 2). אם התרחשה מגזרות, להתאים חיבורי נתונים המוביל אל שקע הטלפון מסתובב, כמו במהלך סיבוב, חיבור זה יכול להיות חופשי או מעוות. אנו מוצאים כי ייצוב הקשר עם הקלטת מסייעת למניעת בעיה זו.</li>
</ol>2. הכנת חיות
הערה: כל בעלי החיים היו מורמות, נבדק בתנאים רגילים בתוך אינקובטור (25 ° C, לחות 60-70% 12 h/כהה מחזור) מולסה/קמח תירס מדיה10.
<ol><li>שבועיים לפני הניסוי המתוכנן, להגדיר את צלוחיות עם צפיפות בעלי חיים מבוקר כדי לאסוף זבובים ניסיוני אנחנו בדרך כלל להגדיר צלוחיות עם 7 זכרים ונקבות 10. עם מלאי בריא, מבקבוקון אחד, כ 15 בתולה זכרים ונקבות 15 ניתן לאסוף יותר מיום 4 פרק זמן. לכוונן את מספר צלוחיות להגדיר מבוסס על מספר בעלי חיים לצורך וזמינותו; וזמינותו טיפוסי במעבדה שלנו כולל 10 סטים של 10 בתולה זכרים ונקבות לכל גנוטיפ (100 זכרים ונקבות 100). הערה: זבובים לא בתולה יכול לשמש בהתאם השאלה ניסיוני ספציפיים. אם וקהילותיהם ניסויים בחיות לא בתולה, הזחלים הסריקה עלולים להפריע ניטור פעילות מדויקת.</li>
	<li>הסר את הזבובים האב שבוע לאחר הגדרת הבקבוקונים.</li>
	<li>החל ביום 10 לאחר הגדרת הבקבוקונים, לאסוף זבובים בתולה הבקבוקונים ולאחסן אותם כשהם מופרדים באמצעות סקס.</li>
	<li>לאסוף חיות מספיק כדי להפוך את הניסוי גיל אותם כמו צורך, 3 ימים בדוגמה זו. הערה: אנחנו בדרך כלל עזים ומתנגד החיות עם CO2 לטיפול. CO2 ידוע להשפיע על רמות פעילות בעלי חיים לתקופות ממושכות של זמן לאחר הטיפול (ראה לדוגמה, ברתולומיאו. ואח 201511). אם התוצאה2 CO מפריע מבחני במורד הזרם המתוכנן או ניתוחים, להשתמש בשיטה הרדמה שונים כגון קרח ההרדמה.</li>
</ol>3. איסוף נתונים עם REQS
<ol><li>עזים ומתנגד החיות כדי לשמש לצורך המחקר כימות תרגיל עם CO2 או שיטה הרדמה נוספת. לחלק אותם לקבוצות לפי הצורך ולטעון את הקבוצות של בעלי חיים לתוך הצינורות כוס ריקה של צג פעילות; בדוגמה זו, חיות 10 בני אותו גיל מוטענים לכל שפופרת זכוכית, משכפל 10 עבור כל סוג בעל חיים (גנוטיפ/סקס). הקפד לציין איזה סוג בעל חיים ייטענו כל שפופרת. הערה: לניסויים יותר זמן, מזון יכולים להיכלל בתוך הצינורות הדגימה. במקרה זה, זה חיוני כי האוכל הוא מאובטח, לא הופכים יצאה ממקומה במהלך הסיבוב.</li>
	<li>לטעון את צינורות assay זכוכית לתוך יחידת REQS ולאבטח אותם עם גומי טבעות O. אם עובדים עם אחד או יותר סקס/גנוטיפ, באמצעות עיצוב בלוק אקראי או אקראיות של העמדה של החיות REQS יבטל כל תופעות מיקום פוטנציאליים. אקראיות יכולה להיות מושגת על-ידי הקצאת כל מבחנה מספר אקראי, לדוגמה ממבוסס-אינטרנט מחולל מספרים אקראיים (למשל, https://www.randomizer.org/) או בגיליון אלקטרוני ולאחר מכן מזמין את הבקבוקונים בהתבסס על מספר אקראי.</li>
	<li>מניחים את REQS החממה להבטיח טמפרטורה קבועה, לחות, אור תנאים. ודא כי כבלי נתונים והן כוח מחוברים כראוי.</li>
	<li>לאפשר את החיות להתאושש מן ההרדמה, כדי להתרגל לסביבה חדשה עבור 1 h.</li>
	<li>להתחיל את הניסוי על ידי ייזום סבב REQS במהירות הרצויה. הערה: אפשרות נוספת היא לאסוף נתוני פעילות בסיסית תחילה מן החיות לפני אתחול של סיבוב, ואחריו הקלטה רמות הפעילות בתגובה לגירוי המסתובבת.</li>
	<li>ליזום איסוף נתונים על-ידי פתיחת התוכנה DAMsystem308 (פתיחה פשוט איסוף הנתונים יוזם תוכנה). נתונים נכתבות בקובץ טקסט במרווח קבוע (כאן, 5 דקות); במידת הצורך, לשנות את ההגדרות מרווח זמן בלשונית "העדפות" (ראה שלב 1.4).</li>
	<li>כדי להבטיח כי הנתונים מועברים בהצלחה אל המחשב, פתח את קובץ הטקסט שנוצר על ידי התוכנה DAMsystem308 לאחר מרווחי זמן אחד או שניים חלפו, לאשר כי נתונים נכתבים לקובץ. לסגור ולפתוח מחדש את הקובץ כדי לראות את הנתונים של כל נקודות זמן נוסף. לאסוף נתונים עבור הסכום הרצוי של זמן; בדוגמה זו, 2 h. הערה: אל תפתח החממה במהלך תקופת assay, החיות רגישים מאוד כל הפרעה, סביר להניח יגיב עם פעילות מוגברת.</li>
	<li>בסוף התרגיל וזמינותו, לסיים את איסוף הנתונים על-ידי סגירת התוכנה DAMsystem308, ואז לכבות את REQS. להסיר את החיות של הצינורות assay זכוכית ולנקות את הצינורות. בעלי החיים ניתן להעביר בחזרה לתוך צלוחיות אוכל אם חוזרים עליו נדרשים אמצעים בגילאים שונים. הערה: אם מקרי מוות מתרחשים בתקופת המשטר התרגיל, זה צריך להיות הקליטה הנוכחות של זבובים מתים יכולים להשפיע פעילות ספירות. מניסיוננו עם DGRP2 קווים לטוס12,13, להתאמן סל ד 4 2 h לא לגרום ישנם מקרי מוות, אך זנים חלשים יותר יכול. להגיב בצורה שונה.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את הקובץ. txt עם התווית "Monitor1", המיוצר על ידי התוכנה DAMSystem308.</li>
	<li>בדוק את קובץ הנתונים על בעיות אולי התרחשו במהלך רכישת נתונים (נקודות זמן שלא נענתה, וכד' טבלה 1). במידת הצורך, לצנזר את הקובץ על-ידי הסרת נקודות נתונים ב ההתחלה ואת הסוף של ההקלטה.</li>
	<li>באמצעות תוכנה סטטיסטית שתבחר (למשל, R), לנתח את הנתונים שנאספו. ליצור סטטיסטיקה תיאורית, לבצע ניתוח השונות (ANOVA) לחקור תופעות כגון מין, גנוטיפ, אם הנתונים מופצים בדרך כלל. אם הנתונים אינם מופצים בדרך כלל, השתמש בשיטות שאינן פרמטרי, כגון בדיקות Kruskal-איי ווליס, כדי להשוות בין קבוצות. הניתוחים הספציפי הנדרש תלוי השאלה מדעיים ספציפיים, הנבחנים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rieder, L. E., Larschan, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wisdom+from+the+fly.">Wisdom from the fly.</a> Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+fly:+A+primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-training+in+young+Drosophila+melanogaster+reduces+age-related+decline+in+mobility+and+cardiac+performance.">Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance.</a> PLoS One. 4 (6), e5886 (2009).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li><li>Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+training+protocol+and+longitudinal+performance+assays+for+Drosophila+melanogaster.">Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Mendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TreadWheel:+A+novel+apparatus+to+measure+genetic+variation+in+response+to+gently+induced+exercise+for+Drosophila.">The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila.</a> PLoS One. 11 (10), e0164706 (2016).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li><li>Watanabe, L. P., Riddle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Rotating+Exercise+Quantification+System+(REQS),+a+novel+Drosophila+exercise+quantification+apparatus.">Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus.</a> PLoS One. 12 (10), e0185090 (2017).</li><li>Reed, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-by-diet+interactions+drive+metabolic+phenotype+variation+in+Drosophila+melanogaster.">Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).</li><li>Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298 (2015).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines.">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li><li>Mackay, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Berlandi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swing+Boat:+Inducing+and+recording+locomotor+activity+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer's+disease.">Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease.</a> Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Sci Rep. 5, 8454 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כמו התוצאות נציג להמחיש, REQS הוא מסוגל באופן מדויק מדידת הפעילות של פעילות גופנית דרוזופילה. REQS הוא גמיש ומאפשר לחוקרים על מגוון שאלות המחקר הקשורות תרגיל ביולוגיה או תרגיל התערבויות. ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול כדי לסמן. קודם כל, זה חיוני כדי לבדוק את ההתקנה של REQS על מנת להבטיח כי העבר...

לאחרונה, חוקרים החלו להשתמש זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster ללמוד תרגיל ביולוגיה. Melanogaster ד כבר מערכת מודל גנטי שנים מעל 1001,2. עם זאת, מחקר דרוזופילה הפך התרומה לא רק גנטיקה, אלא גם ממגוון של דיסציפלינות אחרות לרבות הנוירו-ביולוגיה, ביולוגיה התנהגותית פיזיולוגיה3. בשנת 2009, מגדל כוח, המכשיר התרגיל הראשון עבור דרוזופילה היה מתואר4. המגדל כוח מנצל תגובה שלילית geotaxis של החיות. כאשר דרוזופילה נוטים לעבור לחלק העליון של המתחם שלהם. תגובה זו מעוגנת היטב, הוא הבסיס של וזמינותו הפופולרי "טבעת" (מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי5) המשמש להערכת יכולת טיפוס ו/או כושר גופני ב דרוזופילה. המגדל חשמל משתמשת זרוע מכנית מחובר יחידה מוטורית להרים שוב ושוב את ערכה של חיות בתוך מתחמים שלהם על ידי מספר סנטימטרים ושחרורם חזרה לקרקע לזירוז התגובה geotaxis שליליות (Tinkerhess et al. . 20126 לספק וידאו המדגימה את השימוש המגדל כוח). טיפול ממושך על המגדל כוח ובכך מגדיל את הסכום של פעילות גופנית (ריצה או טיסה) החיות לבצע בהשוואה לבעלי שליטה שאינו מטופל ומעל הזמן מוביל ביצועים משופרים ב וזמינותו הטבעת עבור כושר גופני4. לכן, עבודה זו הפגין את הכדאיות של שימוש דרוזופילה כמודל עבור תרגיל ביולוגיה.
כדי להרחיב את הרפרטואר של כלים למחקר דרוזופילה תרגיל, 2016, מנדז ועמיתיו תיאר מכונת דרוזופילה התרגיל השני, Treadwheel7. בדומה למגדל כוח, Treadwheel מנצלת את התגובה geotaxis שלילי של דרוזופילה. עם זאת, תגובה זו הנגרמת על ידי המשך הסיבוב של מתחמים בעלי חיים, ולא על-ידי הרמת ושחרורם כמו מגדל כוח. שיטה זו אינדוקציה עדינה ומאפשרת עבור משטר התרגול מונחה סיבולת נוסף זה מונע כל טראומה פיזית שעלולים להתרחש במהלך פעילות גופנית במגדל כוח (ראה Katzenberger, אר ג'יי. ואח 20138 עבור השפעת חזר פיזית טראומה על בריאות דרוזופילה). בדומה מגדל כוח4, תרגיל היחס לבעלי חיים על Treadwheel מוביל למגוון של תגובות פיזיולוגיות, לרבות שינויים כושר גופני, רמות טריגליצרידים, משקל הגוף7. לכן, שתי שיטות משלימות זמינים עבור דרוזופילה ביולוגים ללמוד תרגיל.
מגבלה אחת של המגדל הכוח וגם את Treadwheel היא חוסר היכולת למדוד את כמות הפעילות הנגרמת על ידי טיפול פעילות גופנית. ניתוח של וידאו-הקלטות שנלקחו Treadwheel הדגים שהיו הבדלים משמעותיים בין זנים שונים דרוזופילה איך הם מגיבים הטיפול תרגיל7. באופן ספציפי, הזנים למד differed ב עד כמה פעילות נוספים שבעלי החיים לבצע כאשר גירוי7. התבוננות זו בקשה אותנו לפתח מערכת התרגיל השלישי, סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS), המאפשרת לנו למדוד רמות פעילות בעלי חיים במהלך הסיבוב-induced תרגיל9. REQS משתמשת פעילות זמינים מסחרית ניטור יחידת המותקנת על זרוע מסתובבת כדי לעורר פעילות גופנית דרך סיבוב כמו Treadwheel. עבודה ראשונית עם REQS. מאשרות את זה מבחינה גנטית זנים דרוזופילה — המינים - יכול לקבל תגובות שונות באופן משמעותי גירוי המסתובבת ואת ובכך כמות תרגיל המושרה אינו זהה בין אחרים שונים9 . לפיכך, REQS עכשיו מאפשר דרוזופילה ביולוגים למדוד את כמות תרגיל המושרה על ידי הטיפול, פתיחת מגוון של השדרות מחקר חדש במגרש האימונים.
כאן נתאר בפירוט כיצד להשתמש את REQS על כימות של תרגיל סיבובי. REQS המניע את תרגיל הסיבוב, בעת ובעונה אחת מודדת את רמות פעילות של בעלי החיים מטופלים. REQS הוא מסוגל להכיל מגוון של תוכניות פעילות גופנית, החל התם 2 h רציף תרגיל המשטר המודגמות כאן על שיטות אימון מרווח יותר מורכב כפי שתואר על ידי מנדז, עמיתים7. גירוי יכול להיות מותאם ויה מהירות סיבוב (בין כ 1-13 סיבובים כל דקות). בהתאם צג פעילות היחידה להשתמש בהם כדי לייצר את REQS, שיטה זו היא יכולת הסתגלות הניתוח של זבובים יחיד או אוכלוסיות גדולות של בעלי חיים. הודות צדדיות הזה, REQS מספקת דרוזופילה חוקרים עם מערך של הזדמנויות ללמוד, למשל, משטרים שונים פעילות גופנית, תזונה התערבויות או השפעת צפיפות אוכלוסין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Activity Monitor&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">LAM25H</td>
			<td style="width:287px;">REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Telephone Cord Detangler</td>
			<td style="width:147px;">Uvital</td>
			<td>uv20170719</td>
			<td>REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial closures (flugs)</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">49-102</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vials&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td>32-120</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture netting</td>
			<td style="width:147px;">Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">173090</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cornmeal</td>
			<td style="width:147px;">Pepsico</td>
			<td>43375</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molasses</td>
			<td style="width:147px;">Golden Barrel</td>
			<td>BLA-GAL</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">66-103</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inactive Dry Yeast</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62-106</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">20-258</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic acid</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-271</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring exercise levels in drosophila melanogaster using the rotating exercise quantification system (reqs)

דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל חדש ללימודי ביולוגיה פעילות גופנית. עד כה, שתי מערכות התרגיל המרכזי, המגדל כוח, Treadwheel את תוארו. עם זאת, שיטה כדי למדוד את כמות פעילות בעלי חיים נוספים המושרה דרך הטיפול התרגיל יש שהיה חסר. סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) ממלא את הצורך הזה, מתן מידת פעילות בעלי חיים חיות חווה תרגיל סיבובי. פרוטוקול זה פרטים כיצד להשתמש את REQS כדי להעריך את פעילות בעלי חיים במהלך תרגיל סיבובי, ממחיש את סוג הנתונים יכולה להפיק. . הנה, נדגים איך REQS משמש למדידת הבדלים ספציפיים מין או זן בפעילות תרגיל המושרה. REQS יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעה של אחרים ניסיוני פרמטרים שונים כגון גיל, תזונה או אוכלוסייה בגודל בפעילות תרגיל המושרה. בנוסף, זה יכול לשמש כדי להשוות את היעילות של פעילות גופנית שונה הכשרה פרוטוקולים. חשוב מכך, היא מספקת הזדמנות לתקנן את תרגיל טיפולי בין זנים, ומאפשר החוקר להשיג כמויות שוות של פעילות בין קבוצות במידת הצורך. לפיכך, REQS הוא משאב חדש הבולטים לביולוגים התרגיל עובד עם מערכת מודל דרוזופילה ומשלים תרגיל מערכות קיימות.

הפלט הפעלה בודדים עם REQS הוא טבלת נתונים המיוצר על ידי התוכנה DAMSystem308, אשר יסומנו כסעיפים "Monitor1.txt" כברירת מחדל (עבור ראה דוגמה 1 קובץ משלים). קטע מתוך טבלה כזו מוצג בטבלה 1. כל עמודה מכילה את הנתונים טיוב assay בודדים, בעוד השורות להכיל את הפעילות נמדד בכל מרווח ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS at JoVE.com

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) יכול לגרום תרגיל דרוזופילה melanogaster באמצעות סיבוב בעוד בו-זמנית מדידת כמות הפעילות המבוצעת על ידי בעלי החיים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת המפרט כיצד למדוד רמות הפעילות של חיות חווה תרגיל סיבובי טיפולים באמצעות את REQS.

מדידת רמות פעילות גופנית ב- דרוזופילה melanogaster באמצעות מערכת כימות בתרגיל סיבוב (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

measuring-exercise-levels-drosophila-melanogaster-using-rotating

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

7.4K Views.  University of Alabama at Birmingham. סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) יכול לגרום תרגיל דרוזופילה melanogaster באמצעות סיבוב בעוד בו-זמנית מדידת כמות הפעילות המבוצעת על ידי בעלי החיים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת המפרט כיצד למדוד רמות הפעילות של חיות חווה תרגיל סיבובי טיפולים באמצעות את REQ...

Video: Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

TreadWheel: מרווח אימון פרוטוקול בעדינות המושרה תרגיל דרוזופילה melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.