תודה נילי מלודי, ג'ון אלן, באזל Abuaita, ו דונה Runft על מאמציהם בסיוע לפיתוח המודל דג זברה. המחקר דיווחו כאן נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספרי פרס R21AI095520 ו- R01AI127390 (כדי ג'פרי ה Withey). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווין סטייט. שיטה זו תוארה לראשונה בשנת Runft. et al. 12
1. קביעת רמות קולוניזציה מעיים
הערה: קולוניזציה מעיים הוא מדד שימושי ביותר במודל דג זברה כמו זה יכול לשמש כדי להשוות את הכושר היחסי של זנים שונים נ' cholerae או את ההשפעות של מוטציות או הסתרה ג'ין.
<ol><li>חיסון של דג זברה על ידי טבילה הערה: פירוש של חשיפה דומה את המסלול הטבעי של זיהום.<ol>
<li>הכנת נ' cholerae
		<ol>
<li>לחסן מ ל מרק lysogeny (ליברות) עם מבודדים נ' cholerae המושבה מ LB צלחת, תקופת דגירה זה ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) של 6-8 h (לילה תרבות).</li>
			<li>לחסן 25 מ של טרי בינוני LB בלוק בבקבוקון חרוט 250 מ עם 50 µL של התרבות לילה לעיל. תקופת דגירה זה של 16 – 18 h ב 37 ° C עם טלטול (150 סל ד).</li>
			<li>לקרוא את הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של 1/10 לדילול של התרבות לילה כדי להעריך את מספר החיידקים לכל mL (ה OD600 = 1 הוא ~ 109 CFU/mL.)</li>
			<li>הקציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g עבור 10 דקות להסיר את המדיה עם פיפטה או שופכים אותו לתוך פתרון החיטוי. Resuspend התאים ב- PBS סטרילי לריכוז הרצוי, בדרך כלל בין 1 x 107 עונה 1 פרק 1010 מ"ל ל- PBS. הערה: הנה, אנחנו מתייחסים מים אוסמוזה הפוכה בלוק המכיל מלחי ים 60 מ ג/ליטר כ סטרילי זיהום מים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
חיסון, דגירה
		<ol>
<li>מניחים דג זברה ארבעה או חמישה לתוך גביע 400 מ ל המכיל 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית.</li>
			<li>להוסיף 1 מ"ל של נ' cholerae (מתוך שלב 1.1.1.4.) כדי להכניס את ריכוז זיהום הרצוי (בדרך כלל 5 x 104 ל- 5 x 107 CFU/mL) 200 מ של זיהום מים.</li>
			<li>לכסות את. הספל עם מכסה מחורר כדי למנוע את הדגים קופצים החוצה; העליון של תיבה עצה 200 µL עובד עליו היטב.</li>
			<li>תווית לכל כוס כימית, למקם אותם לתוך חממה חזית הזכוכית שוכן בגובה 28 º C משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
נוהל חשיפה חלוף הערה: חלוף חשיפה נ' cholerae (בדרך כלל 6 h) ואחריו הסרת של החיידק לחסן שימושית עבור הלומדים את השידור, כימות מדויקת יותר של החיידקים מופרש.<ol>
<li>לאחר 6 שעות של חשיפה, שופכים את המים הספל דרך מחוך כדי לאסוף את הדגים. למחוק את המים נגועים לתוך מכולה של אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae.</li>
			<li>מניחים את הדג שהוסר ב גביע 200 מיליליטר מים דלקת סטרילית. לאפשר את הדגים לשחות במים נקיים זה עבור 5 דקות כדי להסיר את החיידקים משטח של הדג.</li>
			<li>חזור על הפעולות נטו (שלב 1.2.2) ומניחים את הדגים בתוך החדש של 200 מ ל סטרילי זיהום מים. לשמור את הדגים בתוך זה משך זמן הניסוי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המתת חסד
	<ol>
<li>כאשר הניסוי הגיעה נקודת הסיום הרצוי שלו, לקחת דגימה של הזיהום מים (15 מ ל היא בדרך כלל מספקות) כדי לאפשר מופרש ספירת חיידקים ועל המידה של שלשול (כגון mucin assay, תכולת החלבון ו/או יתר), אם הרצויה (סעיף 2).</li>
		<li>יוצקים את שארית המים דרך מחוך (כדי לאסוף את הדגים) לתוך אקונומיקה כדי להרוג את נ' cholerae במים.</li>
		<li>מניחים את הדג לתוך גביע המכילים זיהום מים בתוספת µg 336/mL של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine), דגירה הדג בפתרון זה tricaine למשך 20 דקות ב- RT. הערה: רשת הדיג חיטוי עם פתרון 10% מלבין.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה
	<ol>
<li>הכנת דגים<ol>
<li>סקופ דג מחוץ הפתרון tricaine עם כפית פלסטיק חד פעמיות ומניחים אותו על פני השטח ויבתר.</li>
			<li>מיקום הדג עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה, pin זה דרך הלסת התחתונה, עם הצד הקהה של ה-pin בזווית מהמרכז של הגוף. במקום אחר pin רק האחורי עד פי הטבעת, גם בזווית, והגוף.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חשיפה של מערכת העיכול<ol>
<li>ספוגית (גחוני) של הדג עם מגבון נטולת טבול 70% אתנול.</li>
			<li>לחטא סכין ומספריים Vannas על ידי טובלים אותם 70% אתנול בוער להם.</li>
			<li>עושים חתך קטן לאורכו בבטן רק מתחת לעור על ידי חדירה המאזניים באמצעות את האזמל. תיזהרי לא לחתוך יותר מדי עמוק, כמו מערכת העיכול ממוקם בדיוק מתחת לעור.</li>
			<li>בעזרת המספריים, להרחיב את החתך בקפידה לאורך הגוף, חיתוך לא עמוק יותר מאשר רמת העור והימנעות פי הטבעת.</li>
			<li>לעשות שני חתכים לרוחב עם המספריים לכיוון הראש של הדג כדי לאפשר פתיחה של החתך.</li>
			<li>להצמיד את העור בכל צד של חתכים לרוחב השטח ויבתר לדוג את הסיכות החוצה מהגוף. הערה: הקצוות של הסיכות בעבר חיטוי על ידי שלהוב אותם עם אלכוהול.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הסרה של מערכת העיכול הערה: מערכת העיכול צריך להיות גלוי כמו צינור חיוור, רזה מאוד על האיברים האחרים.<ol>
<li>להבה-לעקר את המלקחיים ולאחר מכן להשתמש בהם כדי להסיר את כל מערכת העיכול (בדרך כלל 12-15 מ"מ אורך). מקם את המעי לתוך צינור המגון המכילה חרוזי זכוכית (ראה שלבים 1.4.1–1.4.2) ו 1 מ"ל של 1 x PBS או LB, על קרח.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>המגון
	<ol>
<li>להכין הצינורות המגון מראש מאת g ~1.5 השוטף של חרוזי זכוכית 1 מ מ לתוך 2 mL צינורות פקקי בורג (למלא אותם בערך בחצי הדרך), ואז לחטא אותם על-ידי autoclaving.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של LB סטרילי או 1 x PBS.</li>
		<li>ברגע במעי דג זברה היו מוסף (שלב 1.3.3.1) את הצינורות, בורג הפקקים בחוזקה, ולאחר מכן לאבטח את צינורות מהמגן מערבולת.</li>
		<li>Homogenize הדגימות עבור 1 דקות על ההגדרה המרבי, ולאחר מכן מגניב אותם על קרח דק 1-2 לחזור מחזור המגון זה פעם נוספת עבור המגון מלאה. הערה: מספר שיטות חלופיות המגון גם יעבוד.</li>
	</ol></li>
	<li>לכימות קולוניזציה מעיים רמות
	<ol>
<li>להכין צינורות (מבחנות זכוכית קטנים או צינורות microcentrifuge 1.5 mL) דילול homogenate טורי על-ידי הוספת µL 900 ק ג או 1 x PBS כל שפופרת. עבור כל דג, להכין 5 – 6 צינורות ולעשות דילולים טורי 10-fold של homogenate המעי על ידי הוספת µL 100 של homogenate הרכבת התחתית הראשונה, vortexing זה לערבב ולאחר מכן הוספת 100 µL ברכבת התחתית הראשונה הצינור השני.</li>
		<li>חזור על הליך זה עד דילולים כל היה מוכן.</li>
		<li>צלחת 100-200 µL של כל דילול על פלטות אגר LB המכיל 100 µg/mL של סטרפטומיצין (אם משתמשים זנים עמידים בפני סטרפטומיצין) ו- µg/mL 40 של X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
		<li>לאחר לילה הדגירה, לספור מושבות נ' cholerae על הלוחות, באמצעות מונה הניתן המושבה אוטומטית או ידנית לספור את המושבות; זה עוזר לסמן את המושבות שנספרו עם טיפ סמן.</li>
		<li>לקבוע את CFU לכל דג המעי על ידי הכפלת הרוזן צלחת הגורם דילול של ההשעיה, לוקח בחשבון את עוצמת הקול זה היה מצופה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מדידה של דגים שלשול
הערה: ארבעה מדדים שונים שימשו להערכת דגים שלשול: רמות mucin המים, את רמות החלבון המופרשת הכוללת את המים, את יתר600 של המים, את נ' cholerae CFU מים13. שלשול בדרך כלל הופך להיות ראייה ברורה כ 6 שעות לאחר החשיפה של דג זברה כדי נ' cholerae כמתואר לעיל.
<ol><li>
לקבוע רמות mucin הערה: הפרשת Mucin הנגרמת במהלך הקולוניזציה נ' cholerae , הוא מדד טוב של רמות הפרשה, ובמיוחד בתחילת זיהום13. Mucin וזמינותו הינה וריאציה על החומצה המחזורית microtiter assay שיף19.<ol>
<li>להכין את החומרים הבאים: 50% (w/v) חומצה המחזורית פתרון מניות ו- 0.1% חומצה המחזורית הפתרון עובד (µL 10 של המניה המחזורית חומצה 50% יתווספו 5 מ ל חומצה אצטית 7% — להשתמש מיד לאחר ביצוע), mucin סטנדרטים, 96-ובכן microtiter צלחות, שיף מגיב.<ol>
<li>הכנת תקנים mucin על ידי השעיית הכמויות הבאות של mucin (מתוך הבטן חזירי סוג III) במאגר אצטט נתרן (100 מ מ סודיום אצטט, 5 מ מ EDTA, pH ל 5.5 עם חומצה אצטית): 400 µg/mL 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150-µg/mL , µg 100/mL, µg 75/mL, µg 50/mL, µg 25/mL ו- 10 µg/mL. להכין הצלחת על-ידי הוספת µL 100 של זיהום מים כל טוב זה ישמש בבית וזמינותו כדלקמן: ריק 1 x PBS; סטנדרטים mucin כמתואר לעיל, או דגימת מים מן הזיהום דגים. כל מדגם דולר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להוסיף 50 µL טריים 0.1% חומצה המחזורית לפתרון אחד טוב עם פיפטה רב-ערוצי ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
		<li>עוטף את הצלחת היטב בניילון נצמד, דגירה זה ב 37 ° C עבור h 1-1.5.</li>
		<li>מגניב את הצלחת עד בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות להוסיף 100 µL Fuchsin פתרון (ריאגנט של שיף) כל טוב, וכל pipet למעלה ולמטה כדי לערבב את הכל.</li>
		<li>עוטף את הצלחת בניילון נצמד, דגירה זה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה עד צבע פיתחה; הצבע הוא פותח בדרך כלל בתוך 20 דקות לקרוא את ספיגת-560 nm שימוש בקורא צלחת.</li>
		<li>להתוות עקומה סטנדרטי mucin (OD560לעומת µg/mL mucin רגיל). לקבוע את רמות mucin הנעלמים על ידי זיהוי איפה OD560 נודע לכל נופל על העקומה רגיל ולקרוא את הריכוז mucin המתאים עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקבוע רמות החלבון הערה: מלבד mucin, הכולל רמות חלבון במים הם proxy נוספת עבור הרמות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) המיוצר על ידי הדג. הליך זה משתמש assay ברדפורד סטנדרטיים כדי להעריך את רמות החלבון. רמות החלבון מוערך על פי עיקול רגיל אלבומין שור (BSA).<ol>
<li>מערבבים 100 µL של אחד הסטנדרטים BSA (ראה הערה להלן) או 100 µL של זיהום מים (מים מן כשהספל המכיל דגים נגועים) עם µL 900 של ברדפורד ריאגנט assay (פירס חלבון assay הכימית עובד עליו היטב) ב cuvette חד פעמיות. דגירה כל דוגמאות בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. הערה: תקני BSA הבאים שימשו: 1,800 µg/mL 1,000 µg/mL, µg 750/מ"ל, 500 µg/mL, µg 250/mL, µg 125/mL, µg 50/mL, 25 µg/mL. הסטנדרטים BSA היו מדולל במים מזוקקים בלוק.</li>
		<li>לקרוא את יתר660 של כל תקן או לטעום אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>מגרש העקומה סטנדרטי BSA (OD660לעומת µg/mL). לקבוע את רמות החלבון של הנעלמים על-ידי זיהוי איפה OD660 נודע לכל נופל על העקומה סטנדרטי BSA ולקרוא את הריכוז mucin המתאימים ביותר עבור ערך זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדד יתר600 הערה: הנוכחות של שלשול (צואה מעונן, נוזלי) ניכרת בעליל לאחר מספר h ונחישות פשוט OD600 יכול לשמש כדי לכמת את זה.<ol>
<li>היפוך הצינור המכיל את זיהום המים מספר פעמים לפיזור אחיד של התוכן. להוסיף 1 מ"ל של דגימת מים cuvette חד פעמיות. השתמש 1 מ"ל של מים דלקת סטרילית של הפקד שלילי.</li>
		<li>לבצע מדידה "ריק" באמצעות את ספקטרופוטומטרים ב 600 nm באמצעות המדגם שליטה שלילי. לקרוא כל מדגם המים ב 600 nm ולהקליט התוצאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קביעת מופרש נ' cholerae CFU/mL לאחר ההדבקה הערה: מרכיב עיקרי של השלשול שמפיק את דג זברה מופרש נ' cholerae. הקביעה של CFU/mL יכול לשמש למטרות כגון הערכת את שכפול חיידקים דגים העיכול וכן מידת המינון זיהומיות בניסויים שידור. פעולה זו נעשית כאשר זיהום חלוף התרחש. אם זיהום 24 שעות ביממה, וזמינותו הזה ימדוד את inoculum משולב בתוספת של excreted נ' cholerae.<ol>
<li>קח דגימת מים בנקודת הזמן הרצויים, באופן סדרתי למהול אותו כפי שתואר לעיל.</li>
		<li>לוחית רישוי של דילולים טורי במדיה סלקטיבית (המכיל סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה מתאימה נוספת או DCLS אגר ליברות), דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לספור את המושבות. לחשב את CFU לכל מיליליטר מים כפי שמתואר בשלב 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera.">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li><li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+non-O1,+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea,+Kolkata,+India.">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li><li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods.">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li><li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae:+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population.">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li><li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae.">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40 (2001).</li><li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae.">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li><li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae.">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).</li><li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou,+Burkina+Faso.">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li><li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank.">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li><li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Vibrio+cholerae+in+fresh+fish+and+ceviche+in+Guadalajara,+Mexico.">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li><li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens.">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suckling+mouse+model+of+cholera.">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li><li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine.">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li><li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment.">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li><li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea.">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li><li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits.">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+acid-Schiff's+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format.">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li><li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+non+O1,+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore,+south+India.">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li><li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1/O139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast.">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דג זברה היא מודל חדש יחסית ללמוד נ' cholerae אך טומן בחובו הרבה הבטחה הגילוי העתידי של היבטים לא מוכרת של נ' cholerae ביולוגיה ו פתוגנזה11,12,13 . המודל דג זברה למבוגרים יש את היתרונות של להיות טבעי שני מארח נ' cholerae המכיל microbiota מעיים ללא פ...

ויבריו cholerae הוא חיידק הימית, גראם שליליים, הגורמת של מחלות אנושיות כולרה, כמו גם שלשול נמשך "טפטוף"1,2. (פ') cholerae נמצא בסביבה בתחומים רבים של העולם, קשורה לעיתים קרובות עם אורגניזמים ימיים אחרים. אורגניזמים שיוך אלה כוללים פלנקטון, ביצה חרקים ההמונים, רכיכה חוליות דגים מינים3,4,5,6,7. מספר מחקרים שללו נ' cholerae מ ספינלי מעיים של דגים ב אזורים גאוגרפיים שונים7,8,9,10. הנוכחות של נ' cholerae בדגים מציין כי דגים עשוי לפעול כמו מאגר הסביבה. גם יכול להיות מעורב דגים בהעברת המחלה לבני, פיזור גיאוגרפי נ' cholerae זנים6.
כדי להבין טוב יותר איך נ' cholerae אינטראקציה עם דגים, רזבורה rerio, הידועה יותר בשם דג זברה, פותחה כמערכת מודל לימוד נגד כולרהe11. דג זברה הם ילידי דרום אסיה, כולל באזור מפרץ בנגל, אשר נחשב מאגר המוקדם של נ' cholerae. עד הראשון כולרה מגיפה בשנת 1817, כולרה לא דווח כי מחוץ מה שעכשיו הודו ובנגלדש. לכן, דג זברה, נ' cholerae כמעט בוודאות הקשורים אחד לשני על סולמות אבולוציוני, רומז כי דג זברה הם שורה נ' cholerae הסביבה הטבעית12.
דג זברה המודל נ' cholerae פשוטה לביצוע והוא יכול לשמש כדי לחקור את כל פתוגניים נ' cholerae מחזור החיים. דגים נחשפים נ' cholerae על ידי רחצה במים אשר חיסנה עם מספר ידוע של נ' cholerae. בתוך מספר שעות, קולוניזציה מעיים מתקיים, ואחריו את הייצור של שלשול. שלשול מורכב mucin, חלבונים, החיידקים מופרש ותוכן מעיים אחרים. ניתן לכמת את מידת שלשול באמצעות מדידות פשוטות מספר13. (פ') cholerae זה יש כבר מופרש על ידי דגים נגועים יכול להמשיך להדביק לדגים נאיביים, להשלמת המעגל זיהומיות. לפיכך, המודל דג זברה recapitulates נ' cholerae מחלות אנושיות תהליך12,14.
בשימוש לעתים קרובות ביותר נ' cholerae חייתיים היו עכברים וארנבות,14,15,16,17,18. מודלים אלה סייעו בהוספת לידע שלנו של נ' cholerae פתוגנזה. עם זאת, כי עכברים וארנבות, אינם טבעיים נ' cholerae מארחים, קיימות מגבלות אילו היבטים של מחזור חיי נ' cholerae יכול להילמד. הקולוניזציה נ' cholerae של עכברים וארנבות, דורש בדרך כלל העדר של microbiota מעיים או רעלני באנטיביוטיקה כדי לפגוע microbiota של המעי. שני הדגמים דורשים gavage להציג לחיידקים מערכת העיכול או מניפולציה כירורגי ישירות להחדיר את החיידקים לתוך המעיים. דג זברה יש יתרון בכך דג בוגר עם microbiota מעיים ללא פגע הם התנחלו בקלות תהליך זיהומיות קורה באופן טבעי, ללא כל פעולה הדרושה.
העבודה הנוכחית ממחישה את הניצול של דג זברה כמודל באיזמיר נ' cholerae זיהום. הזיהום, דיסקציה, ספירה של להמדינות נ' cholerae, כימות של שלשול הנגרם על ידי נ' cholerae יהיה לתאר12,13. מודל זה סביר להניח שתהיה שימושית למדענים מעוניין תהליך המחלה נ' cholerae והן בסגנון נ' cholerae סביבתיים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Machine</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated colony counter</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml glass beakers</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforated lids</td><td>Microtip holder with holes from tip box</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic spoons</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>Fish Tank System</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO Water Purifier</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Fish net</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fish food</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp</td><td>Red jungle brand</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw cap tubes</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1 mm glass beads</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads for spreading</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plate</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipettes</td><td>Sartorius Biohit, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>periodic acid</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from porcine stomach</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

ויבריו cholerae ידועה בתור הסוכן זיהומיות הגורמת הכולירע מחלות אנושיות. בחוץ הפונדקאי. האנושי, נ' cholerae בעיקר קיימת בסביבה המימית, איפה זה מקיים אינטראקציה עם מגוון מינים ימיים גבוה יותר. דגים חוליות ידועים להיות מארח הסביבה והם פוטנציאל נ' cholerae מאגר בטבע. גם נ' cholerae וגם מיני דגים teleost רזבורה rerio, הידוע בכינויו דג זברה, מקורן היבשת ההודית, רומז על אינטראקציה ארוכת שנים בסביבות מימיות. דג זברה הם אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה, כולל מחלות זיהומיות. דג זברה יכול בקלות, במהירות קולוניה נ' cholerae לאחר חשיפה במים. קולוניזציה מעיים מאת נ' cholerae מוביל את הייצור של שלשול הפרשה של משוכפלים נ' cholerae. אלה מופרש חיידקים יכולים אז קדימה ליישב פונדקאים חדשים של דגים. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae-קולוניזציה מעיים דג זברה ואיך לכמת נ' cholerae-induced דג זברה שלשול. המודל קולוניזציה צריך להועיל לחוקרים הלומדים אם הגנים של עניין עשוי להיות חשוב עבור המארח קולוניזציה ו/או להישרדות סביבתיים. כימות של דג זברה שלשול צריך להיות שימושי החוקרים ללמוד כל פתוגן מעיים המעוניינים לחקור את דג זברה כמערכת מודל.

(פ') cholerae התיישבות ספינלי מעיים דג זברה
כדי לספק דוגמה של רמות קולוניזציה אופייני שלנו להתבונן, אנחנו מחוסן 5 x 106 CFU של מגיפת באל תור נ' cholerae המתח N16961 ב 200 מ של מים בתוך המכיל מספר דג זברה. לאחר 6 שעות של זיהום, הדגים היו נשטפים במי?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model at JoVE.com

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ' cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

Video: Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Developmental Biology

אופטימיזציה של מודלים של דגי זברה GF: ייצור, תחזוקה ומחקרים מיקרוביאליים

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

מחבר זרקור: הקמת דגי זברה נטולי חיידקים למחקרי יחסי מיקרוביוטה-פונדקאי

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה