Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . 12
1. determinação dos níveis de colonização Intestinal
Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.
<ol><li>Inoculação de zebrafish por imersão Nota: Este meio de exposição assemelha-se o curso natural da infecção.<ol>
<li>Preparação do V. cholerae
		<ol>
<li>Inocular 5ml de caldo lisogenia (LB) com um isolado V. cholerae colônia de um LB da placa e incubar a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para 6-8 h (cultura durante a noite).</li>
			<li>Inocule 25 mL de meio fresco de LB esterilizado em um Erlenmeyer de 250 mL com 50 µ l de cultura acima durante a noite. Incube-16 – 18 h a 37 ° C, com agitação (150 rpm).</li>
			<li>Ler a densidade óptica em 600 nm (OD600) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD600 = 1 é 10 ~9 UFC/mL.)</li>
			<li>Colher as células por centrifugação a 6.000 g durante 10 min. remover a mídia com uma pipeta ou derramá-lo fora em uma solução desinfetante. Ressuspender as células em PBS estéril para a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS. Nota: Aqui, nos referimos a autoclavado osmose reversa água contendo sais de 60 mg/L do mar como água estéril de infecção.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculação e incubação
		<ol>
<li>Colocar um copo de 400 mL, contendo 200 mL de água estéril infecção zebrafish quatro ou cinco.</li>
			<li>Adicione 1 mL de V. cholerae (da etapa 1.1.1.4.) para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) em 200 mL de água de infecção.</li>
			<li>Cobrir o recipiente com uma tampa perfurada para evitar que os peixes saltem para fora; parte superior de uma caixa de dica de 200 µ l funciona bem para isso.</li>
			<li>Etiquete cada copo e colocá-los em uma incubadora de vidro da frente regulado a 28 ° C, para a duração do experimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Procedimento para a exposição transitória Nota: Uma exposição transitória para o V. cholerae (tipicamente de 6 h) seguida da remoção das bactérias inoculando é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa de bactérias excretadas.<ol>
<li>Após 6 h de exposição, deite fora a água do copo através de uma rede para recolher os peixes. Descarte a água infectada dentro de um recipiente de água sanitária para matar o V. cholerae.</li>
			<li>Coloque o peixe removido em um copo de 200 mL de água estéril de infecção. Permitir que os peixes a nadar nessa água limpa por 5 min remover as bactérias de superfície do peixe.</li>
			<li>Repita o procedimento líquido (etapa 1.2.2) e coloque o peixe em um novo copo de 200 mL de água estéril de infecção. Mantenha o peixe este copo para a duração do experimento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanásia
	<ol>
<li>Quando o experimento alcançou seu ponto final desejado, tirar uma amostra da infecção água (15 mL é geralmente suficiente) permitir excretadas contagens bacterianas e a medição de diarreia (tais como o ensaio de mucina, teor de proteínas e/ou OD), se desejado (secção 2).</li>
		<li>Despeje o restante da água através de um arrastão (para recolher os peixes) em água sanitária para matar o V. cholerae na água.</li>
		<li>Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 µ g/mL de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) e incube-os peixes nesta solução tricaina por 20 min no RT Nota: As redes de pesca foram esterilizados com uma solução de água sanitária 10%.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecação
	<ol>
<li>Preparação de peixes<ol>
<li>Escave um peixe para fora a solução tricaina com uma colher de plástico descartável e coloque-o na superfície de dissecação.</li>
			<li>Posição o peixe com o seu lado ventral virada para cima e pino através do maxilar inferior, com a extremidade romba do pino angular longe do centro do corpo. Coloque outro pino só posterior ao ânus, também em ângulo longe do corpo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Exposição do trato intestinal<ol>
<li>Limpe a superfície ventral do peixe com uma limpeza de fiapos, embebida em etanol 70%.</li>
			<li>É necessário esterilize um bisturi e Tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e em chamas-los.</li>
			<li>Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga apenas sob a pele, penetrando as escalas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, como o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.</li>
			<li>Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, evitando o ânus e a corte não mais profundo do que o nível da pele.</li>
			<li>Fazer dois cortes laterais com a tesoura em direção a cabeça do peixe para permitir uma abertura da incisão.</li>
			<li>Pino da pele de cada lado das incisões laterais à superfície dissecação, dobrando os pinos para fora, longe do corpo. Nota: As pontas dos pinos foram previamente esterilizadas por flamejante-los com álcool.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Remoção do trato intestinal Nota: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido, muito fino, em cima de outros órgãos.<ol>
<li>Flama-esterilizar o fórceps e então usá-los para remover todo trato intestinal (geralmente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo grânulos de vidro (ver passos 1.4.1–1.4.2) e 1 mL de 1X PBS ou LB, no gelo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização
	<ol>
<li>Preparar os tubos de homogeneização com antecedência pelo derramamento ~1.5 g de grânulos de vidro de 1 mm em 2 mL tampa de rosca tubos (preenchê-los aproximadamente na metade do caminho) e então esterilizá-los em autoclave.</li>
		<li>Adicione 1 mL de LB estéril ou 1X PBS.</li>
		<li>Uma vez que os intestinos de zebrafish tem sido parafuso adicionado (etapa 1.3.3.1) para os tubos, as tampas na muito firmemente e prenda os tubos num homogeneizador vórtice.</li>
		<li>Homogeneizar as amostras por 1 min na configuração máxima e, em seguida, fixe-los no gelo para 1 a 2 min. Repita este ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa. Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também irão funcionar.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificar os níveis de colonização intestinal
	<ol>
<li>Prepare tubos (tubos de ensaio de vidro pequeno ou tubos de microcentrifuga de 1,5 mL) para a diluição serial do homogenate adicionando 900 µ l de LB ou 1X PBS a cada tubo. Para cada peixe, preparar tubos de 5 – 6 e fazer 10 vezes diluições em série do homogenate intestinal adicionando-se 100 µ l de homogeneizado para o primeiro tubo, num Vortex para mistura e em seguida, adicionar 100 µ l do tubo do primeiro para o segundo tubo.</li>
		<li>Repita este procedimento até que todas as diluições foram preparadas.</li>
		<li>Placa de 100 a 200 µ l de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 µ g/mL de estreptomicina (se usando cepas resistentes de estreptomicina) e 40 µ g/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incube as placas a 30 ° C para 16 – 18 h.</li>
		<li>Após a incubação durante a noite, contagem das colónias V. cholerae nas placas, usando um contador de colônia automática ou manualmente, contando as colônias; é útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.</li>
		<li>Determine o CFU por intestino de peixe multiplicando-se a contagem de placa pelo factor de diluição da suspensão, tendo em conta o volume que foi chapeado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medição de diarreia de peixe
Nota: Quatro métricas diferentes foram usadas para avaliar a diarreia de peixe: os níveis de mucina na água, os níveis de proteína excretados geral em água, o OD600 da água e o V. cholerae CFU na água13. Diarreia normalmente torna-se visualmente evidente aproximadamente 6 h após a exposição do zebrafish para V. cholerae conforme descrito acima.
<ol><li>
Determinar os níveis de mucina Nota: A secreção de mucina é induzida durante a colonização de V. cholerae e é uma boa medida de níveis de excreção, especialmente no início de infecção13. O ensaio de mucina é uma variação sobre o ácido periódico microtiter Schiff ensaio19.<ol>
<li>Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.<ol>
<li>Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL. Preparar a placa adicionando-se 100 µ l de infecção a água a cada poço que será usado no ensaio da seguinte forma: em branco 1X PBS; padrões de mucina conforme descrito acima, ou uma amostra de água da infecção de peixe. Fazer cada amostra em triplicado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione 50 µ l de solução de ácido periódico fresca de 0,1% para cada um bem com uma pipeta multicanal e misturá-lo pipetando subindo e descendo várias vezes.</li>
		<li>Embrulhe em filme plástico da placa e incubar a 37 ° C para 1-1.5 h.</li>
		<li>Fixe a placa até à temperatura de 5 a 10 min. Adicione 100 µ l de solução de fucsina (do reagente de Schiff) a cada poço e pipeta para cima e para baixo misturá-lo.</li>
		<li>Embrulhe o prato em filme plástico e incube-lo à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço até que desenvolveu a cor; a cor é geralmente desenvolvida dentro de 20 min. ler a absorvância a 560 nm, utilizando um leitor de placa.</li>
		<li>Traça uma curva padrão de mucina (OD560vs µ g/mL mucina padrão). Determine os níveis de mucina do soldado desconhecido, identificando onde o OD560 cada desconhecido cai na curva padrão e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar os níveis de proteína Nota: Além de mucina, níveis de proteína total na água são outro proxy para os níveis de diarreia (fezes nublado, líquido) produzidos pelos peixes. Este procedimento usa um ensaio de Bradford padrão para estimar os níveis de proteína. Níveis de proteína são estimados com base em cima de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).<ol>
<li>Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min. Nota: As seguintes normas de BSA foram utilizadas: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Os padrões de BSA foram diluídos em água destilada esterilizada.</li>
		<li>Leia o OD660 de cada norma, ou prove-los usando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Traça a curva padrão BSA (OD660vs µ g/mL). Determine os níveis de proteína do soldado desconhecido, identificando onde OD660 cada desconhecido cai sobre a curva padrão de BSA e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medida OD600 Nota: A presença de diarreia (fezes nublado, líquido) manifesta-se visivelmente após vários h e uma simples determinação de600 OD podem ser usados para quantificar isso.<ol>
<li>Inverta o tubo contendo água a infecção várias vezes para distribuir o conteúdo. Adicione 1 mL da amostra de água para uma cubeta descartável. Use 1 mL de água estéril infecção como controlo negativo.</li>
		<li>Realizar uma medição "em branco", utilizando o espectrofotômetro a 600 nm, utilizando a amostra de controlo negativo. Leia cada amostra de água a 600 nm e registar os resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação de excretada V. cholerae UFC/mL após a infecção Nota: Um componente importante da diarreia produzida pelo zebrafish é excretado V. cholerae. A determinação da CFU/mL pode ser utilizada para fins tais como estimar a replicação bacteriana no trato intestinal peixe e como uma medida de uma dose infecciosa em experimentos de transmissão. Esta medida é feita melhor quando uma infecção transitória tem ocorrido. Se uma infecção de 24 h é usada, este ensaio medirá o inóculo combinado, mais o excretados V. cholerae.<ol>
<li>Tirar uma amostra de água no ponto de tempo desejado e diluí-la em série conforme descrito anteriormente.</li>
		<li>As diluições de série em meios selectivos (ágar-ágar LB contendo estreptomicina ou outro antibiótico apropriado ou DCLS) da placa e incube-os a 30 ° C por 24 h.</li>
		<li>Conte as colônias. Calcule o UFC / mL de água, conforme descrito na etapa 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera.">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li><li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+non-O1,+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea,+Kolkata,+India.">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li><li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods.">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li><li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae:+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population.">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li><li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae.">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40 (2001).</li><li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae.">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li><li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae.">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).</li><li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou,+Burkina+Faso.">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li><li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank.">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li><li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Vibrio+cholerae+in+fresh+fish+and+ceviche+in+Guadalajara,+Mexico.">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li><li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens.">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li><li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission.">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li><li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model.">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suckling+mouse+model+of+cholera.">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li><li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine.">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li><li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment.">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li><li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea.">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li><li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits.">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+acid-Schiff's+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format.">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li><li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+non+O1,+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore,+south+India.">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li><li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1/O139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast.">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que...

Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes6.
Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae11. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural12.
O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples13. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo12,14.
O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos14,15,16,17,18. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.
O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE, Plymouth, MN</td>
			<td>Auto Flow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>Geaesys 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex homogenizer</td>
			<td>Minibeadbeater24</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Ohaus, Columbia, MD</td>
			<td>Adventurer Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Stirer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated colony counter</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>120417B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 ml glass beakers</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated lids</td>
			<td>Microtip holder with holes from tip box</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic spoons</td>
			<td>Office Depot, Boca Raton, FL</td>
			<td>D15-25-7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Tank System</td>
			<td>Aquaneering, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water Purifier</td>
			<td>Aqua FX</td>
			<td>TK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td>Marina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish food</td>
			<td>Tetra fin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine Shrimp</td>
			<td>Red jungle brand</td>
			<td>O.S.I. pro 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>10000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>15000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml screw cap tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>02-681-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Bio Spec</td>
			<td>11079110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads for spreading</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>18406-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Midsci, Valley Park, MO</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning Falcon, Corning, NY</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>13675K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td>Sartorius Biohit, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>m1000/m200/m20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>24-150RS/24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Science, Radnor, PA</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>10651745001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>84655-250 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periodic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>10450-60-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from porcine stomach</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>M2378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>9046-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teast Extract</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NACL</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCBS Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>265020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCLS Agar</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>70135-500gm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.

V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish
Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 106 UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção c...

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

Vídeo: Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Imunologia e Infecção

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Otimizando modelos de peixe-zebra GF: geração, manutenção e estudos microbianos

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autor em destaque: Estabelecendo o peixe-zebra livre de germes para estudos de relacionamento entre microbiota e hospedeiro

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.