Gracias a la melodía Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita y Donna Runft por sus esfuerzos en ayudar a desarrollar el modelo de pez cebra. La investigación divulgada aquí fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud, números de concesión R21AI095520 y R01AI127390 (a Jeffrey H. Withey). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne. Este método primero fue descrito en Runft et al. 12
1. determinación de los niveles de colonización Intestinal
Nota: Colonización Intestinal es la métrica más útil en el modelo del pez cebra como puede ser utilizado para comparar la aptitud relativa de varias cepas de V. cholerae o los efectos de las mutaciones o golpes de gracia del gene.
<ol><li>Inoculación de pez cebra por inmersión Nota: Este medio de exposición se asemeja a curso natural de la infección.<ol>
<li>Preparación de V. cholerae
		<ol>
<li>Inocular los 5 mL de caldo de lisogenia (LB) con un aislado V. cholerae Colonia de una LB plato e incubar a 37 ° C con agitación (180 rpm) durante 6-8 h (la cultura).</li>
			<li>Inocular 25 mL de medio fresco de LB en autoclave en un matraz cónico de 250 mL con 50 μl de la cultura durante la noche anterior. Incubar de 16 – 18 h a 37 ° C con agitación (150 rpm).</li>
			<li>Leer la densidad óptica a 600 nm (OD600) de una dilución 1/10 de la noche a la mañana cultura para estimar el número de bacterias por mL (el OD600 = 1 es ~ 109 UFC/mL.)</li>
			<li>Recoger las células por centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos Retire los medios con una pipeta o retirar en una solución desinfectante. Resuspender las células en PBS estéril a la concentración deseada, típicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS. Nota: Aquí, nos referimos a agua de ósmosis inversa autoclave con sales de mar de 60 mg/L como agua estéril infección.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculación e incubación
		<ol>
<li>Coloque un vaso de precipitados de 400 mL que contiene 200 mL de agua estéril infección un pez cebra cuatro o cinco.</li>
			<li>Añadir 1 mL de V. cholerae (del paso 1.1.1.4.) para obtener la concentración deseada de la infección (normalmente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) en 200 mL de agua de la infección.</li>
			<li>Cubrir el vaso con una tapa perforada para evitar que los peces saltando; la parte superior de una caja de punta de 200 μL funciona bien para esto.</li>
			<li>Marcar cada vaso y colocarlos en una incubadora de frente de vidrio fijada a 28 ° C para la duración del experimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Procedimiento para la exposición transitoria Nota: Una exposición transitoria a V. cholerae (típicamente 6 h) seguida de la eliminación de las bacterias inoculación es útil para estudiar la transmisión y para la cuantificación más exacta de la bacteria excreta.<ol>
<li>Después de 6 h de exposición, vierta el agua del vaso a través de una rejilla para recoger los peces. Deseche el agua infectado en un recipiente de cloro para matar la V. cholerae.</li>
			<li>Coloque el pescado quitado en un vaso de precipitados de 200 mL de agua estéril infección. Permitir a los peces a nadar en esta agua limpia durante 5 minutos eliminar las bacterias de la superficie de los peces.</li>
			<li>Repita el procedimiento neto (paso 1.2.2) y coloque el pescado en un nuevo vaso de precipitados de 200 mL de agua estéril infección. Mantener los peces en este vaso para la duración del experimento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasia
	<ol>
<li>Cuando el experimento ha llegado a su punto final deseado, tomar una muestra de la infección agua (15 mL es suficiente) permitir conteos bacterianos excretados y la medición de la diarrea (como análisis de mucina, contenido de proteína o OD), si lo desea (sección 2).</li>
		<li>Vierta el resto del agua a través de una rejilla (para recoger el pescado) en cloro para matar el V. cholerae en el agua.</li>
		<li>Coloque el pescado en un vaso que contiene agua de infección y 336 μg/mL de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Metanosulfonato) e incubar los peces en esta solución de Metanosulfonato por 20 min a TA. Nota: Los balancines fueron esterilizados con una solución de cloro 10%.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección
	<ol>
<li>Preparación de pescado<ol>
<li>Sacar un pez fuera de la solución de Metanosulfonato con una cuchara desechable de plástico y colóquelo en la superficie de disección.</li>
			<li>Coloque el pescado con su lado ventral hacia arriba y el pin a través de la quijada más baja, con el extremo romo del perno del ángulo lejos del centro del cuerpo. Coloque otro pin justo posterior al ano, también en ángulo lejos del cuerpo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Exposición del tracto intestinal<ol>
<li>Limpiar la superficie ventral de los peces con un paño sin pelusa humedecido en etanol al 70%.</li>
			<li>Esterilizar un bisturí y tijeras de Vannas por inmersión en etanol al 70% y les llamas.</li>
			<li>Haga una pequeña incisión longitudinal en el vientre debajo de la piel por penetrar las escalas y con el bisturí. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo, ya que el tracto intestinal se encuentra debajo de la piel.</li>
			<li>Con las tijeras, extender la incisión cuidadosamente a lo largo de la longitud del cuerpo, corte no más profundo que el nivel de la piel y evitando el ano.</li>
			<li>Hacer dos cortes laterales con las tijeras hacia la cabeza de los peces para permitir una apertura de la incisión.</li>
			<li>Perno de la piel en cada lado de las incisiones laterales en la superficie de disección, pesca los pernos hacia fuera, lejos del cuerpo. Nota: Las puntas de los pernos fueron esterilizadas previamente por flameado con alcohol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Eliminación del tracto intestinal Nota: El tracto intestinal debe verse como un tubo muy delgado, pálido encima de los otros órganos.<ol>
<li>Llama-esterilizar las pinzas y luego usarlos para eliminar todo el tracto intestinal (generalmente 12-15 mm de longitud). Colocar el intestino en un tubo de homogeneización que contiene perlas de vidrio (ver pasos 1.4.1–1.4.2) y 1 mL de 1 x PBS o LB, en el hielo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneización
	<ol>
<li>Preparar los tubos de homogeneización adelantado por verter ~1.5 g de perlas de vidrio de 1 mm en 2 mL tubos de tapón de rosca (llenarlos aproximadamente mitad de camino) y luego esterilizarlas en autoclave.</li>
		<li>Añadir 1 mL de LB estéril o de 1 x PBS.</li>
		<li>Una vez que los intestinos del pez cebra han sido tornillo adicional (paso 1.3.3.1) a los tubos, las tapas muy bien y luego fijar los tubos en el homogenizador vórtex.</li>
		<li>Homogeneizar las muestras durante 1 min en la configuración máxima, luego enfriar en hielo durante 1 – 2 minutos repiten este ciclo de homogeneización una vez más para una homogeneización completa. Nota: También funciona varios otros métodos de homogeneización.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación de los niveles de colonización intestinal
	<ol>
<li>Preparar los tubos (tubos de ensayo de vidrio o tubos de microcentrífuga de 1,5 mL) para la dilución seriada de la homogeneizado agregar 900 μl de LB o 1 x PBS a cada tubo. Para cada pescado, preparar los tubos 5 y 6 y hacer 10 veces diluciones seriadas del homogeneizado intestinal mediante la adición de 100 μl de homogenado al primer tubo Vortex para mezclar y luego agregar 100 μl del primer tubo al segundo tubo.</li>
		<li>Repita este procedimiento hasta que todas las diluciones se han preparado.</li>
		<li>Placa de 100 – 200 μL de cada dilución en placas de LB agar que contiene 100 μg/mL de estreptomicina (si está usando cepas resistentes a estreptomicina) y 40 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubar las placas a 30 ° C durante 16-18 h.</li>
		<li>Después de la incubación durante la noche, contar las colonias de V. cholerae en las placas, usando un contador de colonias automático o manualmente contando las colonias; es útil marcar las colonias contadas con una punta de marcador.</li>
		<li>Determinar la UFC por intestino de pescado multiplicando el recuento de placa por el factor de dilución de la suspensión, teniendo en cuenta el volumen que era plateado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medición de la diarrea de pescado
Nota: Cuatro métricas diferentes fueron utilizados para determinar diarrea de peces: los niveles de mucina en el agua, los niveles de proteína total de excreta en el agua, el OD600 de agua y el V. cholerae UFC en el agua13. Diarrea normalmente se hace visualmente evidente aproximadamente 6 h después de la exposición del pez cebra a V. cholerae como se describió anteriormente.
<ol><li>
Determinar niveles de mucina Nota: La secreción de mucina es inducida durante la colonización de V. cholerae y es una buena medida de los niveles de excreción, especialmente temprano en la infección13. La mucina es una variación de la microtitulación ácido Schiff ensayo19.<ol>
<li>Preparar los siguientes materiales: ácido solución 50% (w/v) y 0,1% ácido solución de trabajo (10 μl del stock de ácido 50% a 5 mL de ácido acético al 7%, utilice inmediatamente después de hacer), normas de mucina, placas de microtitulación de 96 pocillos, Schiff reactivo.<ol>
<li>Preparar normas de mucina suspendiendo las siguientes cantidades de mucina (de un tipo de estómago porcino III) en un tampón de acetato de sodio (100 mM sodio acetato, 5mM EDTA, pH a 5.5 con ácido acético glacial): 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL, 150 μg/mL , 100 μg/mL, 75 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL y 10 μg/mL. Preparar la placa mediante la adición de 100 μl de infección agua a cada pocillo que se utilizarán en el análisis como sigue: en blanco de 1 x PBS; mucina estándares como se describe anteriormente, o una muestra de agua de la infección de peces. Hacer cada muestra por triplicado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Añadir 50 μl de solución de ácido peryódico 0.1% fresco cada uno bien con una pipeta multicanal y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.</li>
		<li>Envolver la placa firmemente en plástico e incubar a 37 ° C por 1 – 1,5 horas.</li>
		<li>Enfriar la placa a temperatura ambiente durante 5 – 10 minutos añadir 100 μl de en solución (reactivo de Schiff de) para cada bien y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclarlo.</li>
		<li>Envolver la placa en papel plástico e incubar a temperatura ambiente en una plataforma oscilante hasta que el color ha desarrollado; el color se desarrolla generalmente dentro de 20 minutos, leer la absorbancia a 560 nm utilizando un lector de placas.</li>
		<li>Trazar una curva estándar de mucina (OD560vs μg/mL mucina estándar). Determinar los niveles de mucina de las incógnitas, identificando donde el OD560 cada desconocido cae en la curva estándar y la correspondiente concentración de mucina para ese valor de la lectura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar los niveles de proteína Nota: Además de mucina, niveles de proteína total en el agua son otro proxy para los niveles de diarrea (heces líquidas nublada) producido por los peces. Este procedimiento utiliza un ensayo estándar de Bradford para estimar niveles de proteína. Niveles de proteína se calculan en base a una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA).<ol>
<li>Mezclar 100 μl de uno de los niveles de BSA (ver nota más abajo) o 100 μl de infección (agua desde el vaso de precipitados que contenga peces infectados) con 900 μl de Bradford reactivo de ensayo (el reactivo de análisis de proteínas Pierce funciona bien para esto) en una cubeta desechable. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 2 minutos. Nota: Las siguientes normas de BSA fueron utilizadas: 1.800 μg/mL, 1.000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 50 μg/mL y 25 μg/mL. Las normas de BSA se diluyeron en agua destilada esterilizada.</li>
		<li>Leer OD660 de cada estándar o muestra a través de un espectrofotómetro.</li>
		<li>Trazar la curva estándar de BSA (OD660vs μg/mL). Determinar los niveles de proteína de las incógnitas por determinar donde OD660 cada desconocido cae en la curva estándar de BSA y lea la concentración de mucina correspondiente para ese valor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medida OD600 Nota: La presencia de diarrea (heces líquidas nublada) es visiblemente evidente después de que varios h y OD600 determinación simple pueden utilizarse para cuantificar esto.<ol>
<li>Invertir el tubo que contiene el agua de infección varias veces para distribuir el contenido. Añadir 1 mL de la muestra de agua a una cubeta desechable. Use 1 mL de agua estéril infección como control negativo.</li>
		<li>Realizar una medición "en blanco" en el espectrofotómetro a 600 nm, utilizando la muestra de control negativo. Leer cada muestra de agua a 600 nm y registro de los resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinación de excreta V. cholerae UFC/mL después de la infección Nota: Un componente importante de la diarrea producida por el pez cebra a través de la V. cholerae. La determinación de las UFC/mL se puede utilizar para fines tales como la estimación de la replicación bacteriana en el tracto intestinal del pescado y como una medida de una dosis infecciosa en experimentos de transmisión. Esta medida se realiza mejor cuando ha ocurrido una infección transitoria. Si se utiliza una infección 24 h, este ensayo mide el inóculo combinado plus excreta V. cholerae.<ol>
<li>Tomar una muestra de agua en el momento deseado y diluirlo en serie como se describió anteriormente.</li>
		<li>Las diluciones seriadas en medios selectivos (agar LB con estreptomicina u otro antibiótico apropiado o DCLS) de la placa e incubar a 30 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Contar las colonias. Calcular la UFC por mL de agua como se describe en el paso 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra es un modelo relativamente nuevo para el estudio de V. cholerae pero tiene mucho potencial para el descubrimiento futuro de aspectos desconocidos de V. cholerae biología y patogénesis11,12,13 . El modelo de pez cebra adulto tiene las ventajas de ser ambos naturales V. cholerae host que contiene microbiota intestinal intacta, maduro y un modelo ambiental. Desventajas del modelo son que lo...

Vibrio cholerae es una bacteria acuática, gram-negativa que provoca la cólera de la enfermedad humana como diarrea esporádica1,2. V. cholerae se encuentra en el medio ambiente en muchas áreas del globo, a menudo asociado con otros organismos acuáticos. Estos organismos asociando incluyen plancton, masas de huevos de insectos, crustáceos y vertebrados peces especies3,4,5,6,7. Varios estudios han aislado V. cholerae de los tractos intestinales de peces en diferentes áreas geográficas7,8,9,10. La presencia de V. cholerae en pescados indica que los peces pueden actuar como un reservorio ambiental. Peces también podrían estar implicados en la transmisión de la enfermedad a los seres humanos y en la difusión geográfica de V. cholerae las cepas6.
Para entender mejor cómo V. cholerae interactúa con pescado, Danio rerio, mejor conocido como pez cebra, fue desarrollado como un sistema modelo para el estudio de V. cólerae11. Pez cebra son nativas de Asia meridional, incluyendo la región de la bahía de Bengala, que se piensa para ser el primer reservorio de V. cholerae. Antes del primer comienzo pandemia de cólera en 1817, cólera no había divulgado fuera de lo que hoy es India y Bangladesh. Por lo tanto, pez cebra y V. cholerae seguramente asociados con otros sobre escalas de tiempo evolutivo, sugiriendo que pez cebra se encuentran a V. cholerae en el ambiente natural12.
El modelo de pez cebra para V. cholerae es simple de ejecutar y se puede utilizar para estudiar el patógeno entero ciclo de vida de V. cholerae . Peces están expuestos a V. cholerae por bañarse en el agua que ha sido inoculado con una cantidad conocida de V. cholerae. Dentro de unas horas, colonización intestinal tiene lugar, seguido por la producción de diarrea. Diarrea consiste en mucina, proteínas, bacterias excretadas y otros contenido intestinal. El grado de diarrea puede cuantificarse usando unos simples medidas13. V. cholerae que ha sido excretada por los peces infectados puede entonces pasar al infectar peces ingenuos, completando el ciclo infeccioso. Por lo tanto, el modelo de pez cebra recapitula el V. cholerae enfermedades humanas proceso12,14.
Lo más frecuentemente usado V. cholerae modelos animales han sido históricamente ratones y conejos14,15,16,17,18. Estos modelos han sido instrumentales en la adición a nuestro conocimiento de V. cholerae patogenia. Sin embargo, porque los ratones y los conejos no son natural V. cholerae hosts, hay limitaciones qué aspectos del ciclo de vida V. cholerae pueden ser estudiado. La colonización de V. cholerae de ratones y conejos por lo general requiere la ausencia de microbiota intestinal o un tratamiento previo con antibióticos para dañar la microbiota intestinal. Ambos modelos requieren sonda nasogástrica para introducir las bacterias del tracto digestivo o manipulación quirúrgica para inyectar directamente las bacterias en los intestinos. Pez cebra tienen una ventaja en que peces adultos con una microbiota intestinal intacta son fácilmente colonizados y el proceso infeccioso ocurre naturalmente, sin ninguna manipulación necesaria.
El presente trabajo muestra la utilización del pez cebra como modelo en la infección por V. cholerae . La infección, la disección, enumeración de colonización V. choleraey la cuantificación de la diarrea causada por V. cholerae será descrito12,13. Este modelo es probable ser útil para los científicos interesados en el proceso de la enfermedad de V. cholerae y el V. cholerae ambiental estilo de vida.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NUAIRE, Plymouth, MN</td>
			<td>Auto Flow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>Geaesys 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex homogenizer</td>
			<td>Minibeadbeater24</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Ohaus, Columbia, MD</td>
			<td>Adventurer Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Stirer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated colony counter</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>120417B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 ml glass beakers</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated lids</td>
			<td>Microtip holder with holes from tip box</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic spoons</td>
			<td>Office Depot, Boca Raton, FL</td>
			<td>D15-25-7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Tank System</td>
			<td>Aquaneering, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water Purifier</td>
			<td>Aqua FX</td>
			<td>TK001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net</td>
			<td>Marina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fish food</td>
			<td>Tetra fin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine Shrimp</td>
			<td>Red jungle brand</td>
			<td>O.S.I. pro 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>10000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td>
			<td>15000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml screw cap tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>02-681-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm glass beads</td>
			<td>Bio Spec</td>
			<td>11079110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads for spreading</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>18406-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Midsci, Valley Park, MO</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning Falcon, Corning, NY</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Fisher Brand, Hampton, NH</td>
			<td>13675K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipettes</td>
			<td>Sartorius Biohit, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>m1000/m200/m20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips</td>
			<td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td>
			<td>24-150RS/24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>VWR Life Science, Radnor, PA</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>10651745001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>84655-250 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periodic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>10450-60-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from porcine stomach</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>M2378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>9046-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td>
			<td>Thermo, Waltham, MA</td>
			<td>22660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teast Extract</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NACL</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCBS Agar</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>265020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCLS Agar</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>70135-500gm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

Vibrio cholerae es mejor conocido como el agente infeccioso que causa el cólera enfermedad humana. Fuera del huésped humano, V. cholerae sobre todo existe en el medio acuático, donde interactúa con una variedad de especies acuáticas más altas. Vertebrados peces son conocidos por ser un anfitrión de medio ambiente y son un reservorio potencial de V. cholerae en la naturaleza. V. cholerae y las especies de peces teleósteos Danio rerio, conocidas comúnmente como el pez cebra, originan el subcontinente indio, lo que sugiere una interacción prolongada en ambientes acuáticos. Pez cebra son un organismo modelo para estudiar muchos aspectos de la biología, incluyendo enfermedades infecciosas. Pez cebra puede ser fácilmente y rápidamente colonizado por V. cholerae después de la exposición en agua. Colonización intestinal por V. cholerae conduce a la producción de la diarrea y la excreción de replicado V. cholerae. Estos excretan bacterias puede entonces ir a colonizar nuevos huéspedes de pescado. Aquí, demostramos cómo evaluar V. cholerae-colonización intestinal en pez cebra y cómo cuantificar V. cholerae-indujo diarrea de pez cebra. El modelo de colonización debe ser útil a los investigadores que están estudiando si los genes de interés pueden ser importantes para la colonización del huésped o supervivencia ambiental. La cuantificación de pez cebra diarrea debe ser útil a los investigadores estudiar cualquier patógeno intestinal que están interesados en explorar el pez cebra como modelo.

V. cholerae la colonización del tracto intestinal de pez cebra
Para proporcionar un ejemplo de los niveles de colonización típica que observamos, inocularon 5 x 106 UFC de la pandemia EL Tor V. cholerae cepa N16961 en 200 mL de agua en un vaso de precipitados que contiene varios peces cebra. Después de 6 h de infección, los peces eran lavados en agua dulce y transferidos a un vaso de precipitados d...

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Pez cebra son un natural Vibrio cholerae anfitrión y se puede utilizar para recapitular y estudiar el ciclo infeccioso de colonización a la transmisión. Aquí, demostramos cómo evaluar niveles de colonización de V. cholerae y cuantificar diarrea en pez cebra.

Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K vistas.  Wayne State University School of Medicine. Pez cebra son un natural Vibrio cholerae anfitrión y se puede utilizar para recapitular y estudiar el ciclo infeccioso de colonización a la transmisión. Aquí, demostramos cómo evaluar niveles de colonización de V. cholerae y cuantificar diarrea en pez cebra.

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Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por 1 H espectroscopía de RMN

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Investigación

Inmunología e Infección

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonización de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Un método para modificar genéticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Aislados Clínicos y Ambientales

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...