אנו מודים אן דודסון, סטפני היינריך עצה כיצד למטב את פרוטוקול smFISH, אקסבייר Darzacq בשביל לעזור עם פלטפורמת ניתוח, Haiyan הואנג לקבלת הצעות על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של המשפחה (5-FY15-99), הספסל צדקה סומך (00027344), קרן מחקר הסרטן של דיימון ראניון (35-15) וקרן גלן EÜ, של ה-NSF בוגר מחקר מלגת מענק מס DGE-1106400 לשם פורשים.

הערה: כל המאגרים ואמצעי התקשורת בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה1. פרטי הספק של ריאגנטים רשום את הטבלה של חומרים.
יום 1/יום 1-2:
הערה: עבור תרבות וגטטיבי, לגדול תאים יתר600 של 0.4-0.6 במדיום המועדפת. תרבות meiotic, לגרום לתאים עוברים מיוזה בשיטה המועדפת (בדרך כלל culturing ב יתר600 של 1.85).
1. לטעום קיבוע ועיכול
<ol><li>לתקן את סך של ~3.5 OD600 של תאים ב- 3% פורמלדהיד.<ol>
<li>לתרבות וגטטיבי, להוסיף 5.52 מ"ל של תרבות µL 480 של 37% פורמלדהיד צינורות חרוט 15-mL.</li>
		<li>תרבות meiotic, להוסיף 1840 µL התרבות µL 160 פורמלין 37% 2-mL microcentrifuge צינורות. היפוך ~ 5 פעמים כדי לערבב. התראה: פורמלדהיד הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום צינורות על תוף רולר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. עבור דגימות meiotic, לאחר תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, להמשיך לתקן בן לילה הלעפה תרוטרפמט 4, סיבוב. הערה: הקיבעון לילה מגבירה את הפארמצבטית ואיכות הנתונים smFISH השיג עבור דגימות meiotic. צריך להיות מותאם זמן קיבעון.</li>
	<li>בעוד הדגימות מטפלים, להפשיר 200 מ"מ Vanadyl Ribonucleoside תסביכים (VRC)-65 הלעפה תרוטרפמט לפחות 10 דקות.</li>
	<li>להכין מיקס מאסטר עיכול בשפופרת 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים µL 425 מ B מאגר עם 40 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט); לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 2125 µL של B מאגר עם µL 200 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט). מערבולת ~ 5 s כדי באופן מלא resuspend את VRC לפני הוספת לתערובת הראשית, אשר תופיע ירוק חום בהיר לאחר VRC תוספת. הערה: תוספת של VRC במהלך עיכול משפר מרקם של תוצאות smFISH, פוטנציאל על ידי עיכוב את הזיהום נוקלאז שהציג את התערובת zymolyase, אשר מטוהר מכל תמצית גולמי. צריך להיות מותאם כמות VRC נדרש בשלב זה.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות וגטטיבי, centrifuge הצינורות ב g x ~ 1057 למשך 3 דקות. לקבלת דוגמאות meiotic (לאחר קיבוע לילה), צנטריפוגה-21,000 g x עבור 1.5 מינימלית Decant או תשאף את תגובת שיקוע פורמלדהיד לטמיון. הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל B מאגר קר על-ידי pipetting למעלה ולמטה או היפוך הצינורות, כקבוצה – עלים לערבב. העברת דגימות צמח צינורות 2-mL לאחר resuspension.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend התאים 1.5 מ ב מאגר קר</li>
	<li>צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית להסיר את עיקר הנוזל על ידי השאיפה ואקום או pipetting, משאיר מאחור ~ 100 µL.</li>
	<li>Resuspend התאים ב- 1.5 מיליליטר קר מאגר ב צנטריפוגה ב 21,000 x g עבור 1.5 מינימלית וביופסיה הנוזל לחלוטין על ידי ואקום או pipetting.</li>
	<li>Resuspend תאים µL 425 מיקס מאסטר עיכול, בקצרה מערבולת כדי resuspend. להוסיף 5 µL של zymolyase 10 מ"ג/מ"ל 100T כל שפופרת. הערה: מערבולת zymolyase בכל פעם לפני הוספת הצינורות. להוסיף zymolyase כל שפופרת בנפרד, במקום להוסיף לתערובת הראשית. שני צעדים לעזור לשמור על מערכת העיכול עקביות בין צינורות כי zymolyase ארגונייט שוקע במהירות.</li>
	<li>מערבולת 2-3 s לערבב. מקם את הצינורות על תוף רולר ולאחר לעכל-30 הלעפה תרוטרפמט למשך 15-30 דקות. תאי צמח, meiotic בשלבים המוקדמים, זה בדרך כלל לוקח ~ 15 דקות, meiotic prophase, meiotic חטיבות, זה בדרך כלל לוקח ~ 30 דקות. הערה: לבדוק במיקרוסקופ כל 5 דקות אחרי 15 דקות, ולהפסיק את העיכול כאשר ~ 80% של תאים מופיעות שאינם שקופים-השבירה. מנקודה זו ואילך, התאים הם מאוד שבירים. להתמודד עם תאים בעדינות וכדי להימנע משימוש השאיפה ואקום או vortexing.
</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את הנוזל לחלוטין על-ידי pipetting.</li>
	<li>בעדינות resuspend תאים עם 1 מ"ל של מאגר B על ידי pipetting 1 - 2 פעמים למעלה ולמטה כדי לערבב.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית נוזל B מאגר להסיר על-ידי pipetting. Resuspend בעדינות תאים 1 מ"ל אתנול 70% (מדולל עם מים ללא RNase).</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3.5-4 שעות.</li>
</ol>2. הכלאה
<ol><li>להביא formamide בטמפרטורת החדר (עבור aliquot 50-mL, זה לוקח ~ 30 דקות באמבט מים). הערה: אל תפתח את הבקבוק formamide עד הבקבוק מגיע לטמפרטורת החדר כדי למנוע חמצון של formamide. התראה: Formamide הוא רעיל. לטפל ולחסל לפי תקנות מוסדיים.</li>
	<li>הכינו 10% formamide שטיפת מאגר צינור חרוטי 15-mL.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות 500 להסיר µL של 70% אתנול על-ידי pipetting. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי resuspend התאים הנותרים ולאחר מכן להעביר את התאים נמוך-אדהזיה צינורות. הערה: באמצעות צינורות אדהזיה נמוך מאוד מפחית איבוד תאים במהלך שוטף עוקבות.</li>
	<li>Centrifuge צינורות שוב ב g ~ 376 x עבור 3 מינימלית הסר כל האתנול על-ידי pipetting.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 10% formamide שטיפת מאגר, ובעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים כדי resuspend את התאים.</li>
	<li>לאפשר את התאים לשבת בטמפרטורת החדר למשך ~ 20 דקות בעת הכנת הפתרון הכלאה. עבור מדגם 1, מערבבים 50 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), 5 µL של 200 מ מ VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- µL 1 של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי). לקבלת דוגמאות 5, מערבבים 250 µL הכלאה מאגר (חדר הזמנית), µL 25 מ מ 200 VRC (התחמם עד 65 הלעפה תרוטרפמט) ו- 5 µL של כל בדיקה (200 ננומטר הסופי).<ol>
<li>הפשרת הכלאה מאגר (קפוא ב-20 הלעפה תרוטרפמט) לטמפרטורת החדר לפני פתיחת צינור כדי למנוע חמצון formamide.</li>
		<li>לאחר הוספת את 200 מ"מ VRC, מערבולת עבור 5-10 s לפני הוספת את הגששים, אשר תוכנן, שנרכשו באופן מסחרי, מחדש בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>אם שני רגשים שיתוף incubated, להוסיף 1 µL של ה-1:10 לדילול המניות בדיקה #1, כמו גם µL 1 של ה-1:10 דילול של המניה בדיקה #2, כדי לגרום לדילול הסופית ~ שבערך עבור בדיקה או. הריכוז הדרוש עבור יחס אות לרעש בצורה הטובה ביותר צריך להיות מותאם (ראה דיון לפרטים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.</li>
	<li>הוסף לפחות 50 µL של הכלאה פתרון כל שפופרת. קפיצי הצינורות לערבב.</li>
	<li>תקופת דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט על תוף רולר לפחות 16 שעות בחושך.</li>
</ol>יום 2/יום 3
3. שטיפת והדמיה
<ol><li>להביא formamide בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו 10% formamide שטיפת מאגר (FWB) צינור חרוטי 15-mL.</li>
	<li>להסיר את הצינורות רולר התוף ולמקם אותם לתוך תיבת מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לתוך. פסולת מסוכנת על-ידי pipetting.</li>
	<li>Resuspend ב 1 מ"ל של 10% FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.</li>
	<li>דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע על פסולת מסוכנת על-ידי pipetting, µL ~ 50 תעזוב.</li>
	<li>. בינתיים, מכינים דאפי/FWB צינור חרוטי 15-מ ל: עבור מדגם 1, מערבבים 1000 µL 10% formamide שטיפת מאגר עם µL 1 של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. לקבלת דוגמאות 10, מערבבים 10 מ ל 10% formamide שטיפת מאגר עם 10 µL של 5 מ"ג/מ"ל דאפי. Resuspend ב 1 מ"ל של דאפי/FWB מאת בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.</li>
	<li>דגירה-30 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות (לא סיבוב) בתיבת מכוסה בנייר כסף.</li>
	<li>הפשרת אקונומיקה נגד ריאגנטים על קרח.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-g x ~ 376 עבור 3 מינימלית הסר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. אם יש צורך, צנטריפוגה שוב כדי להסיר כל תגובת שיקוע.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות זה לא תמונה מיד, resuspend בגדר ב- 50 µL של מאגר GLOX ללא אנזימים. Pipet למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים כדי לערבב.<ol>
<li>לשמור כל הדגימות unimaged בתיבת מכוסה בנייר כסף-הלעפה תרוטרפמט 4 עד מוכן לתמונה. כאשר מוכנים תמונה, centrifuge את הדגימות ב g x ~ 376 למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע לחלוטין על-ידי pipetting. Resuspend ב GLOX עם אנזימים כמפורט להלן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבלת דוגמאות להיות עם תמונה באופן מיידי, להוסיף 15-20 µL GLOX מאגר עם אנזימים. בעדינות pipet למעלה ולמטה כדי לערבב. הערה: אמצעי האחסון הוסיף יכול להשתנות בהתאם לגודל בגדר התא. אנו ממליצים resuspending בגדר ב µL 15 GLOX מאגר עם אנזימים, לבדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ. אם תאים צפופים מדי (תאים clumping אחד מעל השני), להוסיף מאגר נוסף GLOX עם אנזימים. אם תאים דליל מדי, centrifuge את הדגימה ולהסיר ~ 5 µL של המאגר.</li>
	<li>Pipet 5 µL אל coverslip (18 מ מ x 18 מ מ, מס ' 1), ולשים coverslip בשקופית.</li>
	<li>לשים מחיקה מעבדה על גבי השקופית איפה מניחים את coverslip. לחץ בעדינות על המחיקה מעבדה כדי להגדיר שקופיות (צריך לראות נוזלי יורד מכל ארבעה קצוות coverslip).</li>
	<li>להעביר את השקופית לחדר מיקרוסקופ בתוך קופסה מכוסה על ידי רדיד אלומיניום.</li>
	<li>תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב זריחה עם הגדלה גבוהה (60-100 X) מפתח נומרי גבוהה. הערה: כדי לאסוף את המספר המקסימלי של הפוטונים הנפלטים על ידי הגששים smFISH, מיקרוסקופ קונפוקלי אינם מומלצים, כפי שהם להגביל באופן משמעותי את כמות האור להיות שנאספו. כאן, נאספו הנתונים על מיקרוסקופ מצויד 100 X, המטרה נה 1.4, באמצעות מסננים CY5 (EX632/22, EM679/34) עם תמונה-1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; ודאפי (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, ט 32-50% כדאי גם לרכוש תמונת ייחוס בהיר-שדה. לרכוש 15-25 פרוסות עם גודל צעד של 0.1-0.2 µm, מ לחלוטין מתחת המוקד של שדה הראייה כדי לחלוטין לעיל, על מנת להבטיח כי כל המקומות RNA התפקדו.</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>לנתח את הנתונים smFISH עם כלי ניתוח smFISH שפורסמו כגון דגים-חשבים17 ו- StarSearch2, או עם תוכניות בהזמנה אישית, בהתאם לדרישות המדויקות של הניסוי. הערה: צינור ניתוח טוב צריך לאפשר למשתמשים לקבוע סף כדי להפריד בין המקומות RNA נכון מהרקע, פלט נתונים סטטיסטיים כגון הקואורדינטות X, Y ו- Z (אופציונלי), את העוצמה של כל מקום, מספר המקומות בכל תא , והתאמת ואולי פרמטרים כדרך לסנן גילויים שווא.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

פרוטוקול המובאת כאן נגזרת אחרים שפורסמו smFISH פרוטוקולים2,3,21,22,23, במיוחד ממוטב עבור רקע המתח שמרים SK1. הפרמטרים ממוטב כללו את מספר הטלפון הנייד, קיבוע משך, מהירות צנטריפוגה, משך, משך העיכול, מאגר עיכול, בדיקה לריכוז מאגר הכלאה. לא עברו אופטימציה פרמטרים אחרים כגון הכלאה טמפרטורה ומשך. בחלק זה, אנו חולקים כמה הערות שיעזרו לך להתאים את פרוטוקול זה איזשהו רקע המתח שמרים, את תנאי הגידול של עניין.
דופן התא של ניצני שמרים היא אחד האתגרים הגדולים נגד קבלת תמונות באיכות גבוהה smFISH ניצני שמרים כי קיר התא מונעת חדירה בדיקה. העיכול לא שלם של דופן התא על-ידי zymolyase מוביל הכלאה לא יעיל של המחקרים וכל השתנות גבוהה-לתא אות. אולם, עיכול יתר יכול להפוך את התאים שברירית מדי, המוביל משמעותית תא הפסד במהלך השלבים כביסה ותא מתפוצץ במהלך הכנת שקופית עבור הדמיה. לפיכך, אופטימיזציה של משך הזמן של מערכת העיכול היא קריטית. אנו ממליצים על ביצוע ניסוי smFISH טייס על ידי באותה דגימת זרע עבור כמויות שונות של זמן. במקרה שלנו, השגנו את הנתונים smFISH הטוב ביותר אם עצרנו העיכול כאשר ~ 80% של תאים הפך ללא-השבירה. בדרך כלל, עבור הצמיחה באותו המצב, זנים מוטציה גנטית יכול להיות מתעכל בתזמון דומה. עם זאת, משך הזמן של מערכת העיכול שונה בהשוואה בין תנאי גידול שונים, בשלבים שונים של מיוזה בניצני שמרים. ברגע התזמון נקבע, האיכות של smFISH הוא לשחזור. הערה כי עבור זנים מוטציה עם סינתזת דופן התא פגום ו/או הרכב, מערכת העיכול ועלול להסתיים בתוך פחות מ 15 דקות השימוש של קבוצות שונות של zymolyase עשויים גם מעט לשנות את התזמון לעיכול.
ריכוז אופטימלי בדיקה יש צורך להשיג יחס אות לרעש גבוה. אנחנו תוכנן ורכש מסחרית הגששים smFISH שלנו. הגששים טוב (לעיתים קרובות 20-מרס) צריך להיות אחוז של GC הנע בין 35% ל-45%, מרווח מינימלי של 2 זוגות בסיס בין הגששים, אשיג נמוכה. השתמשנו מעצב מבוסס-אינטרנט בדיקה מהיצרן כדי ליצור רשימה של הגששים, אם היו מספיק הגששים לבחירה, נשתמש האלגוריתם הפיצוץ במסד הנתונים של הגנום Saccharomyces לחסל את הגששים עם יותר מ 17 בסיסי זוגות חפפו עם אזורים אחרים גנומית. בחרנו את יותר photostable הפלורסנט (CAL עבור חיל הים 590) עבור ערכת בדיקה anneals לאזור ייחודי של NDC80luti (CF 590) כי בקבוצה זו, המספר של הגששים זה מרוצה כל הקריטריונים לעיל (20 הגששים) היה נמוך יותר מאשר המספר המינימלי המומלץ על ידי היצרן (~ 25 הגששים). לאחר לשחזר את הפתרון בדיקה בעקבות הוראות היצרן, עשינו 1:10 דילול של הפתרון מניות ומאוחסנת הפתרון מדולל 5-µL aliquots ב-20 הלעפה תרוטרפמט. כל aliquot היה בשימוש פעם אחת בלבד. עבור אופטימיזציה, לעשות סידורי דילולים מ ה-1:10 מדולל פתרון ובדיקה הריכוז אשר מניב את יחס אות לרעש הטוב ביותר. אנו ממליצים על ביצוע סדרת דילול 1:250, שבערך, 1:1000, 1:2000 מן המלאי המקורי. במקרה שלנו, גורם לדילול שבערך הביא יחס אות לרעש הטוב ביותר, עבור ערכות בדיקה CF 590 והן Q 670.
הזמן האופטימלי קיבוע חיוני גם עבור smFISH מוצלחת בניצני שמרים. אנחנו נמצא באותו קיבעון לילה-הלעפה תרוטרפמט 4, במקום תיקון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, לשפר באופן משמעותי את אחידות ואיכות התוצאות smFISH עבור דגימות meiotic. למרות שלא בדקנו איך לילה קיבוע העלולים להשפיע דגימות צמח, קיבוע בטמפרטורת החדר פעלה היטב את מצב גידול זה. לפיכך, כדי למטב את פרוטוקול smFISH עבור זנים חדשים או תנאי הגידול, מומלץ החל זמן קצר קיבוע בטמפרטורת החדר והגברת הזמן קיבוע אם השתנות גבוהה של האות הוא נתקל.
לעומת אחרים שפורסמו פרוטוקולים3,22,23, פרוטוקול שלנו משתמש החומר המדכא RNase VRC במהלך לעיכול, ריכוז גבוה יותר של VRC במהלך הכלאה. תוספת של VRC בשני שלבים אלה לשפר את העקביות של תוצאות smFISH, אולי על ידי יותר שמירה על מולקולות RNA נגד נוקלאז פעילות, אשר עשוי להיות מוצג על ידי שילוב zymolyase (האנזים מטוהר מכל תמציות גולמי, עשויים להכיל RNase מזהמים). לפיכך, אנו ממליצים להשתמש כמות VRC כפי שמפורט ב פרוטוקול או אפילו גבוה יותר ריכוזי VRC למיטוב שלנו.
חלק ניכר של התאים ייתכן שיאבדו במהלך השלבים כביסה B מאגר והן המאגר לשטוף formamide. כדי לצמצם את איבוד תאים, אחד יכול להגביר את מהירות צנטריפוגה. במקרה שלנו, באמצעות במהירות גבוהה (21,000 x g) הצניפה הדגימות שלנו במהלך B מאגר שוטף איבוד תאים מופחתת באופן משמעותי. עם זאת, תאים להפוך שברירי לאחר עיכול zymolyase, אז מהירות צנטריפוגה שינוי אינו מומלץ. במקום זאת, אנו מציעים שימוש השפופרות נמוך-הידבקות של מדעי בארה ב, אשר במידה רבה לעזור הצניפה התאים במהלך שוטף במאגר לשטוף formamide. בסך הכל, פרוטוקול שלנו בעקביות ליצור של טפט של תאים צפוף מספיק עבור הדמיה יעיל. בדרך כלל, 7 שדות ראייה אמור להניב > מתאים כימות 130 תאים.
לבסוף, חשוב לקבוע פרמטרים אופטימליים עבור ואת התוצרים לצורך, על סמך ניתוח תמונות. כדי לזהות כתמים smFISH, תוכניות שפורסמו ניתוח נפוץ לסנן את תמונות raw באמצעות גאוסיאנית הקרנל כדי להסיר רקע אות ובקש למשתמשים לקבוע את יחס אות לרעש לשימוש עבור כל קבוצה של תמונות2,17. למרבה הצער, אין כיום סטנדרט יחיד שבו נקבעים הפרמטרים הנכון, אז כמה בדיקות אמפירי של הגדרות שונות אלה יש צורך. כדי להגדיר את הפרמטרים הדרושים עבור כל אחד מהצעדים הללו, אחד צריך iteratively קלט סטים שונים של פרמטרים לבדוק עד כמה התוצאות המתקבלות מכל ערכה תואם את זה של ספירה ידנית בתאים נציג כמה. ברגע אחד קבוצת הפרמטרים נמצא, זה יכול לשמש עבור רוב הדימויים שהושג למרות תנאי גידול שונים ורקעים גנטי.
בנוסף, אחד יכול לבדוק אם הקרנה בעוצמה מקסימלית של תמונות smFISH יכולה להתבצע לפני כימות22. שלב זה מפשט את אלגוריתם זיהוי ספוט, מפחיתה באופן משמעותי את הזמן דימות, אף במחיר של מידע שעשוי להיות שימושי על נקודות בודדות, כגון לוקליזציה subcellular שלהם. במקרה שלנו, מספר מולקולות mRNA המיוצר על ידי הגן NDC80 היה נמוך מספיק המקומות היו מופרדים היטב לאחר העיבוד הזה (לא נדיר עבור תעתיקים של ניצני שמרים3,7). במקרים בהם colocalization ניתוח ביקורתי, הצינור ניתוח צריך לקבוע את המיקום של כל נקודה smFISH בכל אחד מהערוצים להעריך colocalization. תלוי השאלות הספציפיות הנשאלת, פרטים אחרים כגון העוצמה של כל מקום ייתכן גם צריך להיות מופק הצינור לצורך ניתוח נוסף. אופטימיזציה של המפתח צעדים בפרוטוקול, הצינור ניתוח התמונה מכריע בהשגת באיכות גבוהה של נתונים smFISH ללמוד את סוגיית הריבית.

דינמי בקרת גנים כוננים הפיתוח של אורגניזם, כמו גם את תגובתה עקה, זיהום, שינויים בחילוף החומרים. מחקרים המתמקדים תקנה תעתיק להסתמך על טכנולוגיות המודדים RNA שפע. שיטה אחת כזו, כינה פלורסצנטיות הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH), משמשת לצורך זיהוי של מולקולות RNA בודדים תאים בודדים1,2. שיטה זו מאפשרת מדידה של מידת ההשתנות לתא בביטוי הגנים והנחישות של לוקליזציה RNA תאיים.
בשיטה smFISH הנפוצות ביותר, דורש זיהוי מולקולת ה-RNA בודדים מרובים קצר DNA רגשים (לעיתים קרובות ~ 48 20-מר הגששים) כי הם משלימים אל המטרה RNA הם מצומדת כדי לצבוע פלורסנט באותו. איגוד של בדיקה ניאון יחיד התוצאה היא האות חלש, אך האות מהאנסמבל של כל את הגששים חזקים. תכונה זו משפר באופן משמעותי את יחס אות לרעש, כי אף-על-פי בדיקה אחת בנוסח מחייב את המטרה, אות כזה צפוי להיות חלש מאוד לעומת זו של יעד מולקולת רנ א3. בתוך שגיאה של זיהוי, מספר מולקולות RNA יכול להיות נספרים, בהשוואה על פני תנאי הגידול השונות ובקרב מוטציות שונות.
מאז פיתוח הראשון, smFISH הותאם ללמוד היבטים שונים של ג'ין הביטוי4, כגון שעתוק התארכות1,2, החדרת5,6, תעתיק מתפוצץ7 , 8 , 9, תאיים ביטוי allelic10,11,12, ו- RNA לוקליזציה13,14,15. לאחרונה, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי ללמוד את הביטוי של שתי התמליל איזופורמים של אותו גן, שבו התעתיק קצר isoform (NDC80ORF) יש רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך (NDC80luti )16. כדי לזהות באופן ייחודי את איזופורמים mRNA שני, היינו שתי ערכות בדיקה: קבוצה אחת היא ספציפית רצף ייחודי של NDC80luti, ומאגד הסט השני, מצומדת כדי עוד הפלורסנט, לאזור משותף שני איזופורמים. NDC80luti RNA מזוהה כמו כתם colocalized עם שני אותות פלואורסצנט, ואילו NDC80ORF RNA היא זו מכילה רק את האות מ ערכת בדיקה. מאז המספר NDC80ORF תעתיקים מחושבת באמצעות שיטת "חיסור", יעילות גבוהה של בדיקה הכלאה, יחס אות לרעש גבוה יש צורך בביטחון לזהות כתמים smFISH ולהפחית את השגיאה הפצת.
מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטבים לביצוע smFISH של שמרים ניצני האפייה. ב פרוטוקול זה, מספר הטלפון הנייד, קיבוע זמן, זמן עיכול, מערכת העיכול מאגר, בדיקה לריכוז הכלאה מאגר המשמש את הניסויים smFISH אופטימציה להצגה SK1 זן הרקע של cerevisiae ס שעברו וגטטיבי צמיחה או מיוזה. עם זאת, אנחנו גם לציין בכתב יד זה: (1) השיטה כדי לבדוק את איכות הנתונים smFISH לאחר ייבוא תמונות, ושלבים (2) בפרוטוקול שיחייבו נוספים מיטוב עבור רקעים זן שונה, תנאי הגידול.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

קרינה פלואורסצנטית הכלאה בחיי עיר מולקולה בודדת (smFISH) היא טכניקה חזקה ללמוד ביטוי גנים בתאים יחיד בשל יכולתה לזהות ולספור מולקולות RNA בודדים. משלימה לשיטות המבוססת על רצף עמוק, smFISH מספק מידע על וריאציית לתא בשפע התעתיק ולוקליזציה subcellular של RNA נתון. לאחרונה, השתמשנו smFISH ללמוד את הביטוי של הגן NDC80 במהלך המיוזה בניצני שמרים, בתעתיק שני אילו איזופורמים קיים ויש isoform קצר תעתיק רצף כולו שלו שיתף את isoform ארוך. בביטחון לזהות כל isoform התעתיק, אנחנו ממוטב smFISH הידוע הפרוטוקולים והשיג בעקביות גבוהה ואיכות smFISH נתונים על הדגימות שנרכש במהלך ניצני שמרים מיוזה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ממוטבת, הקריטריונים שבהם אנו משתמשים כדי לקבוע אם מתקבל באיכות גבוהה של נתונים smFISH ולאחר כמה טיפים ליישום פרוטוקול זה זני שמרים ותנאי גידול אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K Views.  University of California, Berkeley. קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Developmental Biology

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochemistry

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video