Wir bedanken uns bei Anne Dodson und Stephanie Heinrich für Ratschläge, wie Sie das SmFISH-Protokoll zu optimieren, Xavier Darzacq für helfen bei der Analyseplattform, Haiyan Huang für Anregungen über die statistische Auswertung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) und Glenn Foundation zu EÜ und NSF Graduate Research Fellowship Grant No unterstützt. DGE-1106400, JC.

Hinweis: Alle Puffer und in diesem Protokoll verwendeten Medien sind in Tabelle 1aufgeführt. Die Herstellerinformationen für Reagenzien wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Tag 1/Tag 1-2:
Hinweis: Für die vegetative Kultur wachsen Sie Zellen zu einem OD-600 von 0,4 bis 0,6 in ein bevorzugtes Medium. Induzieren Sie für die meiotische Kultur Zellen Meiose eine bevorzugte Methode (in der Regel in einem OD-600 von 1,85 Kultivierung) zu unterziehen.
1. Probe Fixierung und Verdauung
<ol><li>Insgesamt ~3.5 OD600 Zellen in 3 % Formaldehyd zu beheben.<ol>
<li>Fügen Sie für vegetative Kultur 5,52 mL Kultur zu 480 µL 37 % Formaldehyd in 15 mL konische Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Meiotische Kultur fügen Sie 1840 µL der Kultur zu 160 µL 37 % Formaldehyd in 2-mL Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Invertieren ~ 5 Mal zu mischen. Achtung: Formaldehyd ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Bandage bei Raumtemperatur für 20 min Rohre aufsetzen. Für meiotische Proben nach der Fixierung bei Raumtemperatur für 20 min Befestigung über Nacht bei 4 ° c weiter, drehen. Hinweis: Die Übernachtung Fixierung erhöht die Reproduzierbarkeit und die Qualität der SmFISH Daten für meiotische Proben. Fixierzeit sollte optimiert werden.</li>
	<li>Während der Proben beheben, tauen Sie 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplexe (VRC) bei 65 ° c für mindestens 10 min auf.</li>
	<li>Verdauung-master-Mix in einem 15-mL-Tube vorzubereiten: 425 µL Puffer B mix für 1 Probe mit 40 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c); 2125 µL Puffer B mix für 5 Proben mit 200 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c). Vortex ~ 5 s voll Aufschwemmen der VRC vor dem Hinzufügen zu den master-Mix, der leicht bräunlich grün nach VRC Zugabe erscheint. Hinweis: Zugabe von VRC während der Verdauung verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch Hemmung der Nuklease Verunreinigung durch die Zymolyase-Mischung, die aus Rohöl Extrakt gereinigt wird eingeführt. Die Höhe der VRC erforderlich bei diesem Schritt sollte optimiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für vegetative Proben Schläuche am ~ 1057 X g 3 Minuten lang. Für meiotische Proben (nach der Übernachtung Fixierung) Zentrifugieren bei 21.000 x g für 1,5 min. Dekantieren oder Aspirieren des Überstands zu Formaldehyd Verschwendung. Hinweis: Die Zentrifugation Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B durch pipettieren rauf und runter oder durch Umkehrung der Rohre und streichen um zu mischen. Übertragen Sie vegetative Proben auf 2-mL-Tuben nach Wiederfreisetzung.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B. Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. Absaugen der Flüssigkeit vollständig durch Vakuum oder pipettieren.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in 425 µL Verdauung master-Mix und kurz Vortex zu Aufschwemmen. Jedes Rohr 5 µL 100 t 10 mg/mL Zymolyase hinzufügen. Hinweis: Vortex Zymolyase jedes Mal, wenn die Rohre vor hinzufügen. Fügen Sie Zymolyase für jedes Rohr einzeln hinzu, anstatt zu den master-Mix. Beide Schritte helfen Verdauung Konsistenz unter den Röhren zu gewährleisten, weil Zymolyase schnell ausfällt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s zu mischen. Legen Sie die Röhren auf eine Bandage, und bei 30 ° c für 15-30 min zu verdauen. Für vegetativen Zellen und meiotischen Anfangsphase in der Regel dauert es ca. 15 min und meiotischen Divisionen und meiotischen Prophase dauert in der Regel ~ 30 min. Hinweis: Überprüfen Sie auf dem Mikroskop alle 5 min nach 15 min und stoppen Sie die Verdauung zu, wenn ~ 80 % der Zellen nicht transparent und nicht-Refraktive erscheinen. Von diesem Zeitpunkt an Zellen sind sehr zerbrechlich. Handhaben Sie Zellen vorsichtig und vermeiden Sie die Verwendung von Vakuum Aspiration oder Vortexen.
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen die Flüssigkeit vollständig durch pipettieren.</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen Zellen mit 1 mL Puffer B durch pipettieren oben und unten 1 - 2 Mal zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen Puffer B Flüssigkeit durch pipettieren. Aufschwemmen Sie sanft Zellen in 1 mL 70 % igem Ethanol (mit RNase-freies Wasser verdünnt).</li>
	<li>3,5-4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>2. Hybridisierung
<ol><li>Formamid auf Raumtemperatur bringen (für 50-mL-aliquoten, dauert es ca. 30 min im Wasserbad). Hinweis: Öffnen Sie die Formamid-Flasche nicht, bis die Flasche Raumtemperatur zur Vermeidung von Oxidation von Formamid erreicht. Achtung: Formamid ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen 500 µL 70 % Ethanol durch pipettieren. Sanft nach oben und unten zu Aufschwemmen der verbleibenden Zellen, und übertragen Sie dann die Zellen auf niedrigem Kraftschlußbeiwert Röhrchen pipettieren. Hinweis: Mit niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre stark Zellverlust reduziert, bei nachfolgenden Wäschen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen das Ethanol durch pipettieren.</li>
	<li>Hinzufügen 1 mL 10 % Formamid Waschpuffer und sanft pipettieren rauf und runter 2-3mal Aufschwemmen der Zellen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die bei Raumtemperatur für ~ 20 min sitzen, während der Vorbereitung der Hybridisierung-Lösung. Vermischen Sie für 1 Probe 50 µL der Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 5 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 1 µL jede Sonde (200 nM Final). Vermischen Sie für 5 Proben 250 µL Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 25 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 5 µL jede Sonde (200 nM Final).<ol>
<li>Tauen Sie Hybridisierung Puffer (bei-20 ° c eingefroren) auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Tube um Formamid Oxidation zu verhindern.</li>
		<li>Nach Zugabe von 200 mM VRC, Wirbel für 5-10 s vor dem Hinzufügen der Sonden sind die entwickelt und kommerziell erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert.</li>
		<li>Wenn zwei Sonden Co inkubierten sind, fügen Sie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #1 bestand, sowie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #2 Lager, zu einer Endverdünnung von ~ 1: 500 für jede Sonde. Die Konzentration für die beste Signal-Rausch-Verhältnis muss optimiert (siehe Diskussion für Details).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>Jedes Rohr mindestens 50 µL der Hybridisierung Lösung hinzufügen. Streichen Sie die Rohre zu mischen.</li>
	<li>Mindestens 16 Stunden im Dunkeln bei 30 ° c auf eine Bandage inkubieren.</li>
</ol>2/3 Tag
3. Waschen und imaging
<ol><li>Bringen Sie Formamid auf Raumtemperatur.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer (FWB) in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Röhren aus der Bandage und legen Sie sie in ein Feld Folie abgedeckt, um vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>In 1 mL 10 % FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Überstands um gefährliche Abfälle durch pipettieren entfernen und verlassen Sie ~ 50 µL zu.</li>
	<li>Unterdessen bereiten DAPI/FWB in einem 15 mL konische Röhrchen: 1000 µL 10 % Formamid Waschpuffer mit 1 µL von 5 mg/mL DAPI für 1 Probe vermischen. Mischen Sie für 10 Proben 10 mL 10 % Formamid Waschpuffer mit 10 µL von 5 mg/mL DAPI. In 1 mL DAPI/FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Anti-Bleichmittel Reagenzien auf Eis Auftauen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands vollständig durch pipettieren. Bei Bedarf wieder entfernen Sie alle des Überstands Zentrifugieren.</li>
	<li>Für Proben, die nicht sofort abgebildet sind, erneut das Pellet in 50 µL GLOX-Puffer ohne Enzyme. Pipettieren rauf und runter 3-bis 4-Mal zu mischen.<ol>
<li>Halten Sie alle unimaged Proben im Feld Folie bedeckt bei 4 ° c bis bereit zu Bild. Wenn Sie bereit zum Bild, die Proben bei ~ 376 X g für 2 min zentrifugieren und überstand vollständig durch pipettieren entfernen. Aufschwemmen Sie in GLOX mit Enzymen wie unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie für die Proben sofort abgebildet wird 15-20 µL GLOX-Puffer mit Enzymen. Pipettieren Sie sanft auf und ab zu mischen. Hinweis: Das Volume hinzugefügt kann variieren abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Wir empfehlen resuspending das Pellet in 15 µL GLOX-Puffer mit Enzymen und prüfen die Zelldichte am Mikroskop. Wenn Zellen sind zu dicht (Zellen verklumpen übereinander), fügen Sie zusätzliche GLOX-Puffer mit Enzymen. Wenn Zellen zu spärlich sind, Zentrifugieren der Probenmaterials und ~ 5 µL Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Pipettieren 5 µL auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm, Nr. 1), und setzen Sie das Deckglas auf einer Folie.</li>
	<li>Setzen Sie eine Labor wischen auf der Folie platziert das Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf das Labor-Tuch, Folie festlegen (siehe flüssige Abspringen von allen vier Rändern der das Deckglas sollte).</li>
	<li>Übertragen der Folie auf das Mikroskop-Zimmer in einer Box von Alu-Folie abgedeckt.</li>
	<li>Bild mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit starker Vergrößerung (60-100 X) und hoher numerischer Apertur. Hinweis: Um die maximale Anzahl der Photonen, die durch die SmFISH Sonden zu sammeln, sind konfokale Mikroskope nicht empfohlen, da sie die Menge des Lichtes zu erhebenden erheblich einschränken. Hier die Daten auf einem Mikroskop, ausgestattet mit einem 100 X 1,4 NA Ziel, Verwendung von Filtern CY5 (EX632/22, EM679/34) abgebildet bei 1,3 s, 100 % T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 % T; und DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32-50 % T. Hellfeld Referenzbild sollte auch erworben werden. Erwerben von 15-25 Scheiben mit einer Schrittweite von 0,1-0,2 µm, von ganz unten im Mittelpunkt das Sichtfeld zu ganz oben, um sicherzustellen, dass alle die RNA-Spots entfallen.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Analysieren Sie die SmFISH-Daten mit veröffentlichten SmFISH Analyse-Tools wie Fisch-Quant17 und StarSearch2oder kundenspezifischen Programmen, je nach der genauen Anforderungen des Experiments. Hinweis: Eine gute Analyse-Pipeline soll erlauben den Benutzern, eine Schwelle, die wahre RNA-Spots vom Hintergrund zu trennen, und Ausgang Statistiken wie die X, Y und Z Koordinaten (optionalen) und die Intensität von jedem Fleck, die Anzahl der Plätze in jeder Zelle zu bestimmen , und eventuell Anpassung als ein Weg, um Fehlalarme herausfiltern.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. 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H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. 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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Das Protokoll hier vorgestellten stammt von anderen veröffentlichten SmFISH Protokolle2,3,21,22,23, und ist speziell für den Hefe-Stamm Hintergrund SK1 optimiert. Die Parameter optimiert enthalten Zellzahl, Fixierung Dauer, Zentrifugation Geschwindigkeit und Dauer, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer. Andere Parameter wie Hybridisierung Temperatur und Dauer wurden nicht optimiert. In diesem Abschnitt haben wir ein paar Hinweise, die helfen würden, dieses Protokoll Hefe-Stamm-Hintergrund und die Wachstumsbedingungen von Interesse anzupassen.
Die Zellwand der angehende Hefe ist eine große Herausforderung gegen hochwertige SmFISH Bilder in der angehenden Hefe zu erhalten, weil die Zellwand Sonde Eindringen verhindert. Unvollständige Verdauung der Zellwand von Zymolyase führt zu ineffizienter Hybridisierung von Sonden und hohe Variabilität von Zelle zu Zelle im Signal. Aber können über Verdauung Zellen zu schwach zu machen, führt zu erheblichen Zell-Verlust während der Waschschritte und Zelle platzt während der Vorbereitung der Folie für die Bildgebung. Daher ist es entscheidend, die Dauer der Verdauung zu optimieren. Wir empfehlen die Durchführung eines pilot SmFISH Experiments durch Verdauung derselben Probe für unterschiedlich lange. In unserem Fall haben wir die besten SmFISH Daten Wenn wir die Verdauung hielten bei ~ 80 % der Zellen nicht Refraktive wurde. In der Regel können für dasselbe Wachstum, verschiedene genetische mutierte Stämme mit ähnlicher Timing verdaut werden. Allerdings unterscheidet sich die Dauer der Verdauung Vergleich unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und verschiedenen Phasen der Meiose in der angehenden Hefe. Sobald der Zeitpunkt bestimmt ist, ist die Qualität der SmFISH reproduzierbar. Hinweis kann für mutierte Stämme mit defekten Zellwand-Synthese und/oder Zusammensetzung, Verdauung in weniger als 15 min. Einsatz verschiedener Chargen Zymolyase durchgeführt werden kann auch leicht die Verdauung Timing ändern.
Optimale Sonde Konzentration ist erforderlich, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Wir entwarfen und unsere SmFISH Sonden im Handel gekauft. Gute Sonden (oft 20-Mers) sollte einen Prozentsatz von GC von 35 % bis 45 %, ein Mindestabstand von 2 Basenpaare zwischen Fühler und geringe Kreuzreaktivität haben. Wir einen Web-basiertes Sonde Designer vom Hersteller verwendet, um eine Liste der Sonden generieren, und gäbe es genügend Sonden zur Auswahl, wir würde Nutzen des BLAST-Algorithmus in der Saccharomyces-Genom-Datenbank die Sonden mit mehr als 17 Basenpaaren überlappt zu beseitigen mit anderen genomischen Regionen. Wir entschieden uns für mehr photostabilen Fluoreszenzfarbstoff (CAL-Fluor-590) für die Sonde gesetzt, die die einzigartige Region NDC80Luti (CF 590) glüht, weil in dieser Reihe, die Anzahl der Sonden, die alle der oben genannten Kriterien (20 Proben) zufrieden niedriger als war die minimale Anzahl der vom Hersteller empfohlenen (~ 25-Sonden). Nach dem Neuaufbau der Sonde Lösung nach den Anweisungen des Herstellers, wir machten eine 01:10 Verdünnung der Stammlösung und die verdünnte Lösung in 5 µL Aliquots bei-20 ° c gelagert. Jedes aliquoten wurde nur ein einziges Mal verwendet. Für die Optimierung sollte man serielle Verdünnungen ab dem 01:10 verdünnt, Lösung und testen, welche Konzentration das beste Signal-Rausch-Verhältnis ergibt. Wir empfehlen, dass eine Verdünnungsreihe 1: 250, 1: 500, 1: 1000 und 1: 2000 aus dem ursprünglichen bestand. In unserem Fall führte ein Verdünnungsfaktor von 1: 500 das beste Signal-Rausch-Verhältnis für die CF-590 und Q-670-Sonde-Sets.
Optimale Fixierung ist auch entscheidend für erfolgreiche SmFISH in der angehenden Hefe. Wir fanden, dass über Nacht Fixierung bei 4 ° c, anstatt Befestigung bei Raumtemperatur für 20 min, verbessert die Konsistenz und Qualität der SmFISH Ergebnisse für meiotische Proben. Obwohl wir nicht getestet haben, wie über Nacht Fixierung vegetative Proben auswirken könnten, Fixierung bei Raumtemperatur gut für dieses Wachstum Zustand gearbeitet. Also, um das SmFISH-Protokoll für neue Stämme oder Wachstumsbedingungen zu optimieren, empfehlen wir beginnend mit kurze Fixierzeit bei Raumtemperatur und Erhöhung der Fixierzeit, wenn hohe Variabilität des Signals aufgetreten ist.
Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen3,22,23, nutzt unser Protokoll die RNase-Inhibitor VRC während der Verdauung und eine höhere Konzentration von VRC während Hybridisierung. Ergänzung der VRC in diesen zwei Schritten verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch eine bessere Erhaltung der RNA-Moleküle gegen Nuklease Aktivität, die durch die Zymolyase-Mischung eingeführt werden können (das Enzym wird aus groben Extrakten gereinigt und RNase enthalten kann (Verunreinigungen). Daher empfehlen wir die Menge der VRC wie entnehmen Sie bitte unserem Protokoll oder sogar höhere Konzentrationen von VRC für Optimierung.
Ein erheblicher Teil der Zellen kann während Waschschritten in Puffer B und die Formamid Waschpuffer verloren. Um Zellverlust zu reduzieren, könnte man die Zentrifugation Geschwindigkeit erhöhen. In unserem Fall wäscht mit einer hohen Geschwindigkeit (21.000 x g) zu unseren Proben innerhalb der Puffer B Pellets deutlich reduzierten Zellverlust. Jedoch werden die Zellen sehr zerbrechlich nach Zymolyase Verdauung, daher Zentrifugation Geschwindigkeit ändern nicht empfohlen. Stattdessen empfehlen wir die niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre aus USA, die wesentlich dazu beitragen, die Zellen während der Wäschen in der Formamid Waschpuffer pellet. Insgesamt kann unser Protokoll konsequent eine Monolage Zellen dicht genug für die effiziente Bildgebung generieren. In der Regel 7 Gesichtsfelder nachgeben sollte > 130 Zellen geeignet für Quantifizierung.
Zu guter Letzt ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Parameter für und die Ausgänge von Bildanalyse erforderlich. Um SmFISH Flecken zu erkennen, veröffentlichten Analyse-Programme häufig filtern die raw-Bilder mit "glockenförmig" Kernel um Hintergrundsignal zu entfernen, und fordern Sie die Benutzer zu bestimmen, das Signal-Rausch-Verhältnis, für jeden Satz von Bildern2,17zu verwenden. Leider gibt es derzeit kein einheitlichen Standard die richtigen Parametern bestimmt, und so einige empirische Tests diese unterschiedlichen Einstellungen ist notwendig. Zur Einstellung der Parameter für jeden dieser Schritte benötigt, braucht man iterativ unterschiedliche Parameter eingeben und überprüfen, wie gut die Ergebnisse aus jedem Satz entspricht, die von der manuellen Zählung in ein paar repräsentative Zellen. Sobald eine Reihe von Parametern gefunden wird, kann es für den Großteil der Bilder, die trotz unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und genetische Hintergründe verwendet werden.
Darüber hinaus kann man testen, ob maximale Intensität Projektion der SmFISH Bilder vor der Quantifizierung22durchgeführt werden kann. Dieser Schritt den spot Erkennungsalgorithmus vereinfacht und reduziert bildgebenden Zeit, allerdings auf Kosten der potenziell nützliche Informationen zu einzelnen Flecken, wie ihre subzelluläre Lokalisation. In unserem Fall war die Anzahl der mRNA-Moleküle, die durch das NDC80 -gen produziert niedrig genug, dass die Flecken gut, nach dieser Bearbeitung (nicht selten getrennt wurden für Transkripte in angehende-3,7 Hefe). In Fällen, in denen die ns1 Analyse entscheidend ist, muss die Analyse Pipeline zur Bestimmung der Position jeder SmFISH Stelle in jedem Kanal ns1 beurteilen. Je nach den konkreten Fragen gestellt, weitere Informationen wie die Intensität von jedem Fleck möglicherweise auch die Pipeline zur weiteren Analyse entnommen werden. Optimierung des Schlüssels Schritte in das Protokoll und die Bild-Analyse-Pipeline ist entscheidend bei der Beschaffung von hohen Qualität der SmFISH Daten, die Frage von Interesse zu studieren.

Dynamische Regulation der Genexpression treibt die Entwicklung eines Organismus, sowie seine Reaktion auf Umwelteinflüsse, Infektionen und Veränderungen im Stoffwechsel. Studien, die sich auf transcriptional Regelung setzen auf Technologien, die RNA Fülle zu messen. Eine solche Methode, als einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) dient zur Erkennung von einzelnen RNA-Moleküle in einzelne Zellen1,2. Diese Methode ermöglicht die Messung der Zell-Zell-Variabilität in der Genexpression und Bestimmung der intrazellulären RNA-Lokalisierung.
In der am häufigsten verwendeten SmFISH-Technik erfordert Erkennung von einem einzelnen RNA-Molekül mehrere kurze DNA-Sonden (oft ~ 48 20-Mer Sonden), die komplementär zu der Ziel-RNA und sind auf der gleichen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Bindung von einzelnen fluoreszierende Sonden führt zu schwaches Signal, aber das Signal aus dem Ensemble der Sonden ist robust. Diese Funktion verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, denn obwohl eine einzelne Sonde Ziel Bindung aufweisen kann, solches Signal erwartet wird sehr schwach im Vergleich zu der der Ziel-RNA-Molekül3. Innerhalb Fehler erkennen kann die Anzahl der RNA-Moleküle gezählt und verglichen, in ganz verschiedenen Wachstumsbedingungen und unter verschiedenen Mutanten.
Seit seiner ersten Entwicklung ist SmFISH angepasst worden, um verschiedene Aspekte der Gene Expression4, z. B. Transkription Dehnung1,2,5,6, transkriptionelle platzen7 Spleißen studieren , 8 , 9, intrazelluläre allelic Ausdruck10,11,12und RNA Lokalisierung13,14,15. Vor kurzem haben wir diese Methode verwendet, um die Expression von zwei Transkript Isoformen des gleichen Gens, in dem studieren der kurzen Transkript Isoform (NDC80ORF) hat seine gesamte Sequenz gemeinsam mit der langen Isoform (NDC80Luti )16. Zur eindeutigen Identifizierung der beiden Isoformen von mRNA, wir verwendeten Sonde zweierlei: ein Satz bezieht sich auf die einzigartige Abfolge der NDC80Lutiund die andere Gruppe, zu einem anderen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert bindet an die gemeinsame Region der beiden Isoformen. NDC80Luti RNA wird als ein colocalized Ort mit beide fluoreszierende Signale identifiziert, während die NDC80ORF RNA ist derjenige, der nur das Signal aus dem gemeinsamen Sonde Set enthält. Da die Anzahl der der NDC80ORF Abschriften wird berechnet, indem eine "Subtraktion" Methode, hohe Effizienz der Sonde Hybridisierung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis sind notwendig, um selbstbewusst SmFISH Flecken erkennen und reduzieren Fehler Ausbreitung.
Dieses Whitepaper beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Durchführung von SmFISH in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. In dieses Protokoll, die Zellenzahl, Fixierzeit, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer für die SmFISH Experimente verwendet wurden optimiert für den SK1 Stamm Hintergrund S. Cerevisiae unterziehen vegetative Wachstum oder Meiose. Allerdings haben wir auch in diesem Manuskript beachten: (1) die Methode zum Überprüfen der Qualität der SmFISH Daten nach der Bildaufnahme und (2) die Schritte in das Protokoll, die zusätzliche Optimierung für verschiedene Belastungen Hintergründe und Wachstumsbedingungen erfordern.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) ist eine leistungsstarke Technik, Genexpression in Einzelzellen aufgrund seiner Fähigkeit, zu erkennen und zählen die einzelnen RNA-Moleküle zu studieren. Ergänzend zu deep Sequencing-basierte Methoden, SmFISH liefert Informationen über die Zell-Zell-Variation im Transkript Überfluss und die subzelluläre Lokalisation einer bestimmten RNA. Vor kurzem haben wir SmFISH verwendet, um die Expression des Gens NDC80 während der Meiose in der angehenden Hefe zu studieren, in welche zwei Niederschrift Isoformen vorhanden und kurze Niederschrift Isoform hat seine gesamte Sequenz mit der langen Isoform geteilt. Um jede Abschrift Isoform selbstbewusst zu identifizieren, wir optimierte bekannt SmFISH Protokolle und erzielt hohe Konsistenz und Qualität der SmFISH Daten für die Proben während angehende erworben Hefe Meiose. Hier beschreiben wir diese optimierte Protokoll, die Kriterien, die wir verwenden, um festzustellen, ob hoher Datenqualität SmFISH gewonnen wird, und ein paar Tipps für die Durchführung dieses Protokolls in anderen Hefestämme und Wachstumsbedingungen.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K Aufrufe.  University of California, Berkeley. Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Serie: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Forschung

Genetik

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Entwicklungsbiologie

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochemie

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biologie

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli mit Zwei-Farben-Einmolekülfluoreszenz in Situ-Hybridisierung

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Zusammenfassung

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