smFISH ידוע במדידת המספר המוחלט כמיקום תת-תאי של mRNAs. פרוטוקול sMFISH שני הצבעים שלנו יש את היכולת הנוסף של מדידת הקינטיקה של שעתוק והשפלה mRNA. בשיטה זו, ניתן לעבד דגימות רבות בו זמנית ללא תוספת זמן או מאמץ.
לדוגמה, ארבעה ניסויים בקורס זמן המניבים 48 דגימות יכולים להיות מעובדים להדמיה בשמונה שעות. הפרוטוקול שלנו ישים באופן נרחב עבור גנים רבים ומינים חיידקיים. כדי להכין תלושי כיסוי ושקופיות זכוכית לניסוי.
השתמש מטליות למקם תלושי כיסוי ומחלקות בצנצנת Coplin המכיל 100% אתנול ולמקם את הצנצנת באמבט מים קולי לספק במשך 15 עד 20 דקות. בסוף sonication לשטוף את השקופיות לכסות מחליק שלוש עד ארבע פעמים עם מים טהורים במיוחד לפני מילוי הצנצנת עם 70% אתנול וחוזר על sonication. כאשר כל שלבי sonication נעשים, לייבש את הכיסוי מחליק ומחליק עם גז חנקן.
מקם את מחליקי הכיסוי בתיבת קצה פיפיאט ריקה של 1000 מיקרוליטר והצב את השקופיות בתיבת שקופית נקייה. לאחר מכן, בעקבות החורים של תיבת קצה פיפטה להשתמש סמן הידרופובי לצייר עיגולים על תלושי הכיסוי ולהחיל טיפה 20 microliter של 0.1% פולי l לינזין על כל בארות אלה. כדי להקים ניסוי קורס זמן, להוסיף 750 microliters מתרבות E.coli 20 מיליליטר גדל אקספוננציאלית לצינור תרבות 1.5 מיליליטר מסומן זמן אפס.
ומיד להפוך את הצינור. לגרום ביטוי LAC Z עם 0.2 כדי IPTG מילימולר אחד ולהתחיל טיימר. לאחר בדיקת שעון הזמן, לאסוף את תרבות התא בכל נקודת זמן ניסיונית רצופה כפי שהוכח רק.
בנקודת הזמן המתאימה במהלך הניסוי, להוסיף חמישה מילימולרים ONPF לבקבוק כדי להדחיק את ביטוי LAC Z ולהמשיך לדגום את התרבויות כדי לעקוב אחר השפלה mRNA. בסוף קורס הזמן מדגם רכישה, הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ואחריו דגירה על קרח במשך 30 דקות. בסוף צנטריפוגת הדגירה הדגימות כדי להסיר את התיקון ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את supernatant.
להשעות מחדש את החיידקים במיליליטר אחד של DEPC PBS ולשטוף את התאים פעמיים נוספות במיליליטר אחד של PBS DEPC טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את התאים 30 microliters של PBS DEPC טרי. עבור חלחלה של התאים.
ראשית להוסיף את המדגם מכל נקודת זמן ל בארות הידרופובי בודדות על אחד אתנול מעורק זכוכית מכסה מחליק. ולאפשר לתאים לדבוק בכיסוי עם דגירה של 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של 70% אתנול לכל באר.
לאחר ארבע דקות, שאף את האתנול מכל באר, כך שה בארות יבשות לחלוטין. לאחר הכביסה מוסיפים 30 מיקרוליטרים של פתרון טרום הכלאה לכל באר של תאים מחלחלים, ו דגירה התאים במשך 30 דקות בתנור 37 מעלות צלזיוס. החלף את פתרון ההכלאה מראש עם כ 30 microliters של פתרון הכלאה בדיקה לכל באר.
ולכסות את התא בנייר אלומיניום במשך שעתיים דגירה בתנור 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה להשתמש פיפטה רב ערוצית לשטוף את בארות שלוש עד חמש פעמים עם 30 microliters של פתרון לשטוף לגם לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, דגירה התאים במשך 15 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני לשטוף את בארות חמש פעמים עם 30 microliters של PBS DEPC טרי לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את כל הנוזלים מהכיסוי. ולהוסיף ארבעה microliters של PBS DEPC טרי לכל באר. השתמש מדפים כדי למקם בזהירות את המכסה להחליק על שקופית זכוכית מעקרת אתנול בצד למטה, ולהשתמש מסטיק שיניים סיליקון כדי לאטום את הקצוות של החלקת המכסה.
כדי לאתר אזור מעניין, בחר את המצב החי של הדמיית ניגודיות פאזה ותמרן את מוט ההיגוי של הבמה כדי לשנות את שדה המבט בתוך באר. ממוקם באזור שבו צפיפות התאים אופטימלית והתאם את מוקד Z כך שתמונות תא ניגוד הפאזה נמצאות במוקד. לאחר מכן רכשו תמונה C five עם חשיפה של ארבע שניות, תמונת C שלוש עם חשיפה של שתי שניות ותדמית ניגודיות פאזה עם חשיפה של 0.2 שניות לכ-10 אזורים שונים ל הבאר.
לחלופין, ניתן להפעיל רכישה של NDI שבה תמונות C חמש, C שלוש וחדות פאזה נרכשות בסדרות. לאחר הדמיה של כל הבארות, פתחו כלי פילוח תאים מתאים ולחץ על מחסנית. טען את תמונות ניגודיות הפאזה מעניינות ובחר מסגרות עצמאיות ולחץ על מ לחשב את פרופיל הפאזה כאפס.
כדי להתחיל את תהליך הפילוח שבמהלכו יזהו את התאים ויחושבו קווי המתאר שלהם. טען את הפרמטרים המופיעים בתיקיה GitHub ולחץ על כל המסגרות. בסוף העיבוד בחר מיתאר כדי להמחיש את רשת שינוי.
לאחר מכן, תחת לשונית זיהוי ספוט, בטל את הסימון של מחסנית, בדוק רשתות שינוי ולחץ על שפשוף כדי להתחיל בזיהוי הנקודה וכימות בהתבסס על שני המדידות של D Gaussian. בחר את התיקיה המכילה את התמונות הפלואורסצנטיות ואת קובץ רשת שינוי שחושב זה הרגע מתוך הליך זיהוי התאים וציין את שם הקובץ שאליו יישמרו תוצאות זיהוי הספוט. לאחר מכן השתמש בזרימת העבודה של ניתוח התמונה המסופקת ב- GitHub כדי לנתח את תמונות הפלואורסצנטיות.
בשדה מלא זה של תצוגה כ 500 תאי E.coli בצפיפות טובה עבור פילוח התא ניתן לראות. המורפולוגיה של התאים בתמונות ניגודיות הפאזה צריכה להישאר דומה לזו של תאים חיים למטרות פילוח. אם התאים מחלחלים יתר על כן, המורפולוגיה שלהם תהפוך לבלתי מתאימה לפילוח.
ההתפלגות של כתמי נקודה lac Z mRNA לפני אינדוקציה אינה מתאימה היטב עם הפצה נורמלית או פואסון בשל נוכחותם של כתמים עם התעצמויות גבוהות. כאשר הביטוי של lac Z הוא המושרה האות של חמישה mRNA X lac פריים עולה לפני שלוש האות העיקרי Lac Z mRNA עולה. אם הביטוי של Lac Z מודחק הן חמשת ושלושת אותות ה-MRNA המובילים של Lac Z פוחתים.
כדי להשיג את קצב התארכות התמלול, עלייתם של חמשת ושלושת האותות המובילים מתאימים לקווים. בעוד שיעור השפלה mRNA מתקבל על ידי התאמת אזור הריקבון עם פונקציה מעריכית. מכיוון שדג מולקולה בודדת הוא טכניקה של תא יחיד, ניתן לנתח גם את השונות בין התא לתאים בתעתיק.
בנוסף, ניתוח של colocalization של חמישה פריים ושלושה פריים Lac Z mRNA מאפשר את הצפיפות של פולימראזים RNA על הגן Lac Z להיות מכומת. כמו דגימות מנקודות זמן שונות מטופלים בו זמנית במהלך הליך זה. חשוב לשמור על הדגימה מופרדת בזמן שהם בצינורות ועל החלקת הכיסוי.
באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה חד-תאית זו של מולקולה בודדת. חוקרים יכולים כעת לחקור כיצד קינטיקה של שעתוק והשפלת mRNA קשורה למספרים המוחלטים או למיקומים התת-תאיים של mRNAs.
