ברצוננו להודות למרכז גנטיקה Caenorhabditis זנים, מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), קרן קנדה עבור חדשנות (CFI) למימון. ברצוננו להודות ד ר ליזהן חן (החוג למערכות תא ו אנטומיה, UT בריאות סן אנטוניו) עבור המאפשר שימוש בלתי מוגבל של מתקני המעבדה שלה עבור כל הניסויים C. elegans , כמו גם ד ר וואנג Exing (מנהל שותף, מתקן הדמיה אופטית UT בריאות סן אנטוניו) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו רוצים גם תודה ד ר מירון איגנטיוס למתן תמיכה ועידוד כדי להקל את. הצילומים.

1. כתם, תמונה lysosomes מעיים
<ol><li>זרע הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות עם OP50
	<ol>
<li>הכינו צלחות NGM לפי הפרוטוקול המומלץ19 ולאפשר את הצלחות סגור להתייבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לחסן OP50 חיידקים לתוך ציר מרק לוריא (LB) סטרילי ולגדול בתוך אמבט מים או חממה חזק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות או עד OD היא בין 0.2 0.4. הימנע משימוש תרבות חיידקי עם יתר > 1 או OD < 0.2.</li>
		<li>לאחר הצלחות NGM יבש, מקום טיפה (~ 30 µL) OP50 inoculum במרכז הצלחת, ולאחר מכן התפשטה הירידה לתוך תיקון בערך זה 2 ס"מ על 2 ס"מ בגודל. הערה: כל inoculum OP50 הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.</li>
		<li>היפוך הלוחות OP50 ברגע inoculum יבש (בערך 10 או 15 דקות) ולאחר מכן דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 36 שעות.</li>
		<li>לאחר 36 ה', להסיר את הלוחות מן החממה החנות ב 4 ° C עד לשימוש בעתיד. הערה: הלוחות צריך להיות טוב עבור חודש אחד עד 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>שכשהם cDCFDA כדי OP50
	<ol>
<li>כדי להשלים את cDCFDA על גבי לוחות OP50, להכין מלאי עבודה של 10 מ מ cDCFDA ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). שמור את הפתרון cDCFDA מוגן מפני אור וחנות ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>הנח בעדינות µL 100 בפתרון cDCFDA 10 מ מ על גבי המשטח של התיקון OP50 2 ס"מ x 2-ס מ, כך התיקון כולו מכוסה בצורה אחידה cDCFDA. הערה: חשוב מאוד כי התיקון כולו של OP50 מכוסה cDCFDA. אם נדרש, השתמש µL עד 150 של cDCFDA על כל צלחת. . זה גם הכרחי כי הפתרון cDCFDA לא להרחיב מעבר לגבולות התיקון OP50, מאז כל cDCFDA שזורם מתוך התיקון OP50 לא ישולבו לתוך האוכל, והתוצאה מכתימים בעוצמה מופחתת.</li>
		<li>למקם את הצלחות OP50 בקופסה כהה על גבי ספסל עד כל הפתרון cDCFDA נספג לתוך התיקון חיידקי (בדרך כלל כ- 25-30 דקות).</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת תולעים באמצעות cDCFDA
	<ol>
<li>ברגע cDCFDA יש חילחלו לחלוטין את התיקון OP50, במקום לא יותר מ-20 תולעים לכל צלחת, דגירה הלוחות הפוכה ב 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 14 h. הערה: מומלץ למקם את הצלחות cDCFDA בתיבה אטומה כדי למזער את החשיפה לאור.</li>
		<li>כדי לשלוט על צריכת ההבדלים בין ניסויים, לנרמל את אותות cDCFDA, (מומלץ) כתם משותף עם 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( difluoro) בורון (2.5 µL של פתרון טרי 1 מ מ), צבע אמין חלש acidotropic אשר הוא שאינו משתנה במידה רבה על הספקטרום pH חומצי (ראה טבלה של חומרים עבור שמות נפוצים של ריאגנטים). הערה: אינו מכתים תולעים בשביל פחות מ 14 h, מאז זה עשוי לספק עוצמת מוכתמים cDCFDA לקוי ולתת פרשנות שווא של lysosomal pH.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת שקופיות מיקרוסקופ
	<ol>
<li>במקום שתי רצועות מקבילים של תיוג הקלטת כ 3 ס מ זו מזו על משטח שטוח חלקה, כגון מראה (איור 1).</li>
		<li>מעיל השטח של המראה עם ספריי דוחה מים, תנגבי את הנוזל העודף.</li>
		<li>להמיס agarose 2% (מומס מזוקקים H2O) במיקרוגל עד נוזלי לגמרי, ואז תעברו במהירות הירידה עם מגלשת מיקרוסקופ, כך לשקופית ניצב הרצועות של מקום טיפת µL 50 agarose בין שתי רצועות של נייר דבק הקלטת. לאחר agarose התחזק, ויוצרים כרית מעגליות מתחת למגלשה, נהפוך את השקופית ולהוסיף 10-15 µL של אזיד הנתרן 5 מ מ (נאן3) על גבי משטח agarose. הערה: נאן3 הוא מעכב ציטוכרום C כי כאשר נעשה שימוש בריכוזים נמוכים, הפיכה anesthetizes תולעים, כך שהם לא יזוז במהלך דימות.</li>
		<li>לבחור תולעים מהצלחת OP50 בתוספת cDCFDA, ומעבירים אותם אל צלחת NGM נקי ללא כל OP50. לאפשר את התולעים לנוע לכמה שניות לאפשר רוב OP50 להסיר פני השטח של התולעים, ולאחר מכן להעביר את התולעים כדי לרפד את agarose המכיל אזיד הנתרן 5 מ מ.</li>
		<li>מיד לכסות את משטח agarose עם מכסה. הקפד הנח בעדינות בתגית כיסוי מבלי להחיל מדי לחץ, שכן התוצאה יכולה להיות תולעים מתפוצץ. הערה: חיידקים OP50 בתוספת cDCFDA לזרוח כאשר visualized באמצעות מיקרוסקופ, ולכן חשוב לנקות את התולעים הטובה ביותר ככל האפשר לפני שמניחים אותם על משטח agarose המכיל אזיד הנתרן. אם מכינים יותר מ 6 זנים של C. elegans (כולל N2, פראי סוג הבקרה), רצוי להכין את הדגימות בקבוצות של 6, על מנת להבטיח כי התולעים לא להתייבש על משטח agarose. ב זנים מסוימים, הפות מתחילה להיקרע לאחר תקופות זמן בעקבות לחץ הרכב מכסה, לכן חשוב לתכנן בהתאם.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית הערה: כמה מיקרוסקופים יש תכונה מובנית באופן אוטומטי מגביר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כדי לפצות על רמות מגוונות של זריחה. מיקרוסקופים כזה עשוי שלא לפעול היטב עבור הדמיה תולעים מוכתם cDCFDA, מאז הם מטבעם יאריכו את עוצמת קרינה פלואורסצנטית דגימות.<ol>
<li>לבצע הדמיה-מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל באמצעות עירור/פליטה אורכי גל מוגדר 488/530 ננומטר עבור cDCFDA. תמונות מטוס יחיד (לא Z-ערימות) של המעי lysosomes ולהשתמש רק lysosomes כי הם בפוקוס (עוצמת האות המקסימלי) על כימות עוצמת. הערה: אולי בגלל הבדלי צבע זמינות, lysosomes של תאי המעי האחורי ישירות אל הלוע לשמור על cDCFDA מכתים בעוצמה ללא התחשבות גנוטיפ או גיל, ומכאן להקפיד להימנע הדמיה lysosomes בתאים אלה.</li>
		<li>תמונה של השקופית המכילה 2 בן יום פראי סוג ש-n2 תולעים קודם. תוך כדי כך, להתאים את הפרמטרים הדמיה קונאפוקלית כגון עוצמת הלייזר, חריר, הצמצם כדי להבטיח כי cDCFDA מכתים בעוצמה הוא לא רווי. הערה: לאחר קביעת הגדרות אלה, אינם משנים אותם למשך כל ההדמיה ליום הזה.</li>
		<li>לכידת תמונות 1024 x 1024 פיקסלים של מטוס בודד של המעי (3 עד 4 תמונות לכל תולעת) באמצעות 60 X עדשת הגדלה. הערה: ספקטרום הפליטה cDCFDA בעיר וורמס תניב לשיא בולט יחיד-520 nm בד בבד עם שלה פלורסצנטיות דווח על הספקטרום20, המספקת הבדיקה אות מסוים כי הוא נבדל autofluorescence מעיים (איור 3).</li>
		<li>לייצא תמונת raw קונאפוקלית (קבצי. .lsm) .tiff קבצים לכל ערוץ.</li>
		<li>לאחר מכן, פתח ImageJ ולחץ על קובץ | פתח כדי לפתוח את קובץ התמונה כדי ניתן לכמת. לאחר טעינת התמונה, להשתמש בכלי בחירת צורת אליפסה ב ImageJ כדי לבחור אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>לאחר מכן, לחץ על נתח | מדד לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור זה רועי. בחר 4 – 5 lysosomes בפוקוס שונה לכל תמונה, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי הממוצע של כל אזור בעל עניין (ROI).</li>
		<li>עבור כל תמונה, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע באזור המעי בין lysosomes. להחסיר את ערכי העוצמה של קרינה פלואורסצנטית רקע מ ערכי העוצמה של זריחה lysosomal.</li>
		<li>בסך הכל, לאסוף את הערכים הבודדים בסביבות 30 עד 50 מנורמלת עבור עוצמת cDCFDA (בעלי חיים 6 עד 10) עבור כל זן נבדק. השתמש בערכים אלה כדי להתוות מגרש משערה ותיבת באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים. הערה: צביעת יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם גורמים כמו טמפרטורה, זמן הדגירה, הבריאות/עידן הכוללת של בעלי חיים כך השוואות עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרלוונטיים רק בתוך דגימות בתהליך הניסוי מכתימים אותה. לכן חשוב לעבד את הפקדים בכל ניסוי מוכתמים. לחשב הבדלים סטטיסטיים (t-בדיקות) באמצעות תוכנה סטטיסטית המתאים.</li>
		<li>כל תמונה זנים מאותו הניסוי (מוכתם באותו יום) ברצף, מקפיד לא לשנות הפרמטרים הדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration.">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li><li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+the+importance+of+maintaining+&amp;#34;clean&amp;#34;+cells.">Autophagy and aging: the importance of maintaining &amp;#34;clean&amp;#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li><li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson's+disease.">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li><li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+neurodegeneration:+a+critical+role+for+molecular+chaperones?.">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?.</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+chaperone-mediated+autophagy.">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li><li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process.">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li><li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging.">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+function+and+dysfunction:+mechanism+and+disease.">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function.">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li><li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease.">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age?.">How do intracellular proteolytic systems change with age?.</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+lysosomes+get+old.">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li><li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=btn1,+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3,+regulates+vacuole+homeostasis.">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants.">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li><li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast.">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li><li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li><li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li><li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence.">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li><li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging:+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis.">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li><li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8++T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells.">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li><li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice.">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li><li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+of+lipofuscin,+ceroid,+and+age+pigment-like+fluorophores.">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li><li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function.">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

מגוון רחב של אירועים תאית ומולקולרית לתרום הזדקנות, מושפע תכונות היסטוריית החיים וגורמים גנטיים. המחקר האחרון שלנו22 מרמז כי מחזור הרבייה ממלא תפקיד חשוב בשליטה על הכושר של סומא באמצעות ויסות lysosomal pH dynamics. הראנו שאת proteolysis lysosomal בתיווך הוא קידם בעוד חיות להתרבות באופן פעיל על י?...

המראה של אגרגטים חלבון מקובל להיות סימן היכר של הזדקנות התאים האיקריוטים1,2,3, היווצרות אשר נחשבת בקרב הנהגים עיקרון של הזדקנות ביולוגית הסלולר4 , 5 , 6 , 7. גדל ראיות כי כמו תאים גיל, פירוק חלבון פגום, מובילה לעלייה צבירת חלבון. נפילת proteolysis ב הזדקנות תאים כרוך ליקוי autophagy8 , כמו גם חלבון בתיווך פרוטאוזום השפלה9. לבסוף, חמצון החלבון בלתי הפיך הוא גדל בתאים הישנים, בהמשך ופוגע קטבוליזם חלבון10.
Autophagy. בהתחלה חשבו להיות תהליך לא בררניים עבור השפלה בכמות גדולה של חלבונים פגומים, אבל מחקרים אחרונים הראו ש-autophagy הזה הוא סלקטיבי מאוד קטבוליזם של אגרגטים חלבון לקוי organelles שאינם נוטה השפלה באמצעות מנגנוני אישור11האחרים חלבון. במהלך התהליך של autophagy, חלבונים פגומים, צבורים הן מבודדות לתוך שלפוחית כפול-הממברנה קרא את autophagosome. ואז, autophagosome הזה בין עם organelles חומצי בשם lysosomes, אשר מוביל השפלה של מטענים autophagosome12. Lysosomes מייצגים את מובילים של הנתיב autophagic ולהשתתף תהליכים תאיים שונים כגון תיקון קרום, בקרת גנים ברמת השעתוק חישה מזין; הדגשת תפקידם מרוכזת של הומאוסטזיס הסלולר (שבתוך הפניה למעורר 13). מספר מחקרים הראו אסוציאציה בין תלויי-גיל ירידה בתפקוד lysosomal הפרעות ניווניות שונות13. באופן עקבי, שחזור פונקציה lysosomal בתאים בוגרים יכולים לעכב את התחלתה של זיקנה פנוטיפים14,15. מחקרים של ההרכב של הסביבה שבה התרחשה intralumen מראים כי קריסת פונקציית lysosomal תאים בוגרים אינה עקב ירידה בייצור של פרוטאזות lysosomal16. לחלופין, שהוא הוצע כי אובדן intralysosomal חומציות, דרישה קריטי של פעילותה אנזימטיות, עשויה ביסוד ירידה בתיווך ליזוזום proteolysis17. כדי שתוכל לחקור את השערה זו, זה חיוני לפתח נוגדנים ופרוטוקולים כדי לחקור דינאמי לשינויים lysosomal pH של תאים חיים בצורה עקבית לשכפול.
המעי של C. elegans הוא הרקמה חילוף החומרים העיקריים בעיר וורמס וזה מווסת קריטי של הומאוסטזיס מערכתית ואת תוחלת החיים. פיתחנו מבחני להעריך את השינויים בהחומציות של לומן של lysosomes מעיים של תולעים כדי לקבוע כיצד בתיווך ליזוזום proteolysis תורמת להזדקנות. למרות fluorophores pH רגיש שימשו בעבר C . elegans כדי לסמן lysosomes מעיים, לא עוד היה מאמץ כדי לבסס פרוטוקול מוצלח שיכול לזהות עליות קטנות ב- lysosomal pH ויוו18. כאן, אנו מספקים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות אובדן של חומציות lysosomal בתאים מעיים של C. elegans באמצעות פרוטוקול האכלה פשוטה ונוחה המשלבת של pH רגיש fluorophore (cDCFDA) למזון OP50.

<table><tbody><tr><td>OP50 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-dichlorofluorescein diacetate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Commonly known as cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#039;H-2,2&#039;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Commonly known as Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth powder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol powder</td><td>Sigma</td><td>C3045&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mirror or other smooth flat surface</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא מערכת מודל זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אריכות ימים מסלולים התפתחותית. מחקרים כאלה מתבצעים על ידי השקיפות של החיה, היכולת להעביר ולהפוך מבחני גנטי, הקלות היחסית ביצירת החלבונים fluorescently שכותרתו, השימוש של צבעי פלורסנט, זה גם יכול להיות microinjected לתוך המוקדמת העובר או שולבו אוכל שלה (e. coli זן OP50) כדי להדביק תווית organelles הסלולר (למשל 9-diethylamino-5 שעות-benzo (א) phenoxazine-5-1 ו (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). כאן, אנו מציגים את השימוש ה-pH רגיש הפלורסנט זה כתמים lysosomes מעיים, מתן של הבדיקה חזותית של שינויים דינמיים, פיזיולוגיים של חומציות lysosomal תולעים בשידור חי. פרוטוקול זה לא למדוד lysosomal pH, אבל מעדיף שואפת להקים שיטה אמינה של הערכת פיזיולוגיים וריאציות הרלוונטיים ב lysosomal חומציות. cDCFDA הוא תרכובת תא-permeant המרת ניאון fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) על הידרוליזה על ידי תאיים esterases. פרוטונציה בתוך lysosomes מבצע השמנה cDCF ב organelles האלה, איפה זה מצטבר. עקב pKa שלה נמוכה של 4.8, צבע זה שימש חיישן ה-pH של שמרים. כאן נתאר את השימוש cDCFDA כתוספת מזון כדי להעריך את החומציות במעיים lysosomes ב C. elegans. טכניקה זו מאפשרת איתור lysosomes alkalinizing בבעלי חיים, , יש מגוון רחב של יישומים ניסיונית כולל מחקרים על הזדקנות autophagy, lysosomal להן.

cDCFDA כתמים lysosomes באופן תלוי-pH, ומאפשרת שלה נמוך pKa, ספיגת מוכן לתוך lysosomes של חיישן ה-pH אידיאלי21. cDCFDA מכתים בעוצמה הוא ביחס הפוך ל18,lysosomal pH (קרי מכתימים בעוצמה מתגבר ככל pH יורדת)22. cDCFDA אותות חלשים באופן עקבי lysosomes של בעלי החיים מט...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K Views.  University of Saskatchewan. מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Video: Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Biochemistry

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neuroscience

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Biology

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Immunology and Infection

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Medicine

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos