אנו מודים ד ר חסן Yardimci, Dr.Sevim Yardimci של פרנסיס קריק המכון סוג לעזור בניסויים מולקולה בודדת, ד ר דניאל Duzdevich מהמעבדה של ד ר אריק ג גרין של אוניברסיטת קולומביה, ד ר שמש Yujie באוניברסיטת פקין, ד ר צ'ן Chunlai של באוניברסיטת צינג לדיון שימושי. מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין 31371264, 31401059, צוות החדשנות הבינתחומי CAS ואחווה את ניוטון מתקדם (NA140085) של החברה המלכותית.

1. הכנת המצע DNA λ-ARS317
<ol><li>ה-DNA המצע בנייה ואריזה<ol>
<li>לעכל λ יליד הדנ א באמצעות Xhoאני האנזים; להגביר את קטע DNA 543 בן שלוש bp כיוון ARS317 של ה-DNA גנומי של ניצני שמרים באמצעות תחל המכיל 20 bp הומולוגי רצף של במעלה הזרם, במורד הזרם של Xhoאני האנזים באתר למדא הדנ א. להוסיף 100 ננוגרם של Xhoעיכלתי λ DNA ו-10 נג ה-DNA קטע כדי 10 µL של מערכת התגובה רקומבינציה הומולוגית, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>כדי לארוז את ה-DNA λ רקומבינציה, להוסיף 25 µL של למדא תמציות אריזה לתוך המוצר רקומבינציה, דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף µL 25 נוספים של למדא תמציות אריזה לתוך הצינור התגובה. להמשיך דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.</li>
		<li>להוסיף 500 µL מאגר דילול סטרילי (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.3), 100 מ מ NaCl, 10 מ מ MgCl2) לתוך מערכת התגובה ומערבבים בעדינות על-ידי הפעלת הצינור למטה מספר פעמים. להוסיף 25 µL של כלורופורם, לערבב בעדינות, לאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של phage ארוז 100 µL של חיידקים LE392MP (תרבותי-0.8 - 1.0 באמצעות מדיום LB הוספה עם 10 מ מ MgSO4) לתוך צינור חדש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.</li>
		<li>להוסיף 200 µL תערובת phage-חיידק לתוך אגר oftop 4 מ"ל (LB בינוני + 0.7% אגר + 10 מ מ MgSO4, מקורר עד 48 ° C). לערבב באופן מיידי על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים, יוצקים אותו לתוך צלחת מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) ליברות.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לבין מסך הפלקיו λ-ARS317 באמצעות PCR וסדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ה-DNA טיהור המצע מ11,lysates הנוזלי18<ol>
<li>בוחר הפלאק אחד לתוך µL 200 של ddH סטרילי2O עם 10 מ מ MgCl2 ו- 10 ננומטר CaCl2. מערבבים עם 200 µL של חיידקים LE392MP (בתרבית לילה במדיום ליברות), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>להוסיף את התערובת phage-חיידק 100 מ של NZCYM (10 גרם/ליטר NZ-אמין, 5 g/L שמרים לחלץ, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino Hydrolysate, ואת 2 g/L MgSO4·7H2O) בינוני ותרבות 7 h ב- 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 250 µL של כלורופורם לתוך התרבות ומנערים עוד 10 דקות.</li>
		<li>העברת התרבות לתוך בקבוקון 200 מ. הוסף 5.8 גר' NaCl (הריכוז הסופי של 1 מ'), מערבבים כדי להמיס בעבודת יד, דגירה על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את שאריות תאים. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך בקבוקון 200 מ"ל ולהוסיף 10% יתד8000 (m/V). מערבבים לפרק על ידי מכשיר מלהיב מגנטי ו דגירה על קרח במשך 30 דקות או יותר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את bacteriophage. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend את התמיסה ב 2 מ"ל phage דילול המאגר. להעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 10 µL של RNase (הריכוז הסופי הוא µg 20/mL) µL 40 של DNase (הריכוז הסופי הוא µg 5/mL). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>להוסיף 2 מ"ל של 0.3 M טריס-HCl (pH 9.0), EDTA 100 מ מ + 1.25% מרחביות, µL 15 proteinase K (הריכוז הסופי הוא 10 µg/mL). דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>להוסיף 2 מ"ל של אשלגן טרום מקורר אצטט (3 מ', pH 4.8), דגירה הצינור על קרח למשך 10 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את החומרים לא מסיסים.</li>
		<li>להוסיף x 0.7, כמות אלכוהול איזופרופיל לתוך תגובת שיקוע. לערבב על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים ולאחר תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב RT, כדי לזרז את הדנ א. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף את ה-DNA, ברגע עם 70% אתנול על ידי צנטריפוגה-g 8,000 x עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Elute ה-DNA באמצעות µL 500 טה מאגר (טריס-HCl, EDTA 1 מ מ, 10 מ מ pH 8.0) בעדינות, ולהעביר את ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ.</li>
		<li>לחלץ את ה-DNA פעמיים באמצעות פנול: כלורופורם על ידי צנטריפוגה ב 8000 g למשך 10 דקות.</li>
		<li>לזרז עם 0.7 x נפח אלכוהול איזופרופיל. מערבבים לפנות הצינור הפוך למטה בעדינות, צנטריפוגה ב g 8,000 x 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף פעם עם 70% אתנול, resuspend ב µL 200 של טה. למדוד את ריכוז הדנ א, ולאחסן ב-20 ° C ב- 12.5 µg aliquots.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 דנ א Biotinylation
<ol><li>כדי phosphorylate biotinylated oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ביוטין-3') משלימים לקצה השמאלי של ילידי λ ה-DNA, להוסיף 1 µL (100 מיקרומטר) של oligonucleotides, µL 7.5 של ddH2O, 1 µL של 10 x ליגאז מאגר 0.5 µL של T4 PNK. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>Λ-ARS317 phosphorylate, להוסיף µg 12.5 של λ-ARS317, 3 µL של 10 x ליגאז מאגר, µL 1 של T4 PNK, ו- ddH2O לנפח הכולל של µL 30. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>כדי anneal oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 0.5 µL של phosphorylated oligonucleotides, µL 195 ddH2O, µL 25 × 10 ליגאז מאגר לתוך הצינור λ phosphorylated-ARS317. לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להפוך את בלוק חימום, ולתת המגניבים הדגימה כדי מתחת 33 ° C בבלוק.</li>
	<li>כדי מאתרים ומפסיקים את oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 1 µL של T4 DNA ליגאז ו µL 0.63 של ATP (200 מ מ). לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 h או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש. הערה: כדי להימנע נפרדים הדנ א, כל השלבים ערבוב צריכה להיעשות על ידי בעדינות מתהפך ברכבת התחתית, במקום במעורבב באמצעות פיפטות.</li>
</ol>3. Coverslip וניקוי Functionalization
<ol><li>Coverslip ניקוי<ol>
<li>מקום 20 coverslips לתוך צנצנות צביעת 4 (5 coverslips/צנצנת), sonicate במשך 30 דקות אתנול, ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים.</li>
		<li>Sonicate במשך 30 דקות עם 1 מ' אשלגן הידרוקסידי (KOH), ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים. חזור על אתנול וביו -KOH sonication פעם אחת.</li>
		<li>Sonicate עם אצטון במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם הנדסה גנטית H2O היטב (לפחות 3 פעמים). הערה: אצטון יש להסיר ביסודיות על ידי שטיפה בעזרת הנדסה גנטית H2O, כי זה עלול לגרום לפיצוץ כאשר הממס האורגני (כגון אצטון) מעורבב עם הפתרון פיראניה בטעות14.</li>
		<li>למקם את coverslips לתוך פיראניה פתרון (3:1 תערובת של H2אז4 ו- 30% H2O2) דגירה ב 95 ° C עבור 1 h. הערה: פתרון פיראניה הוא אנרגטי מאוד, סחף, לכן השתמש בזהירות. בעת הכנת פיראניה פתרון, להוסיף 50 מ של2O H2 תחילה לתוך גביע זכוכית 500 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 150 מ ל H2אז4 לאט לתוך הספל.</li>
		<li>לשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 5 פעמים. לאחר מכן לשטוף את כל coverslip עם הנדסה גנטית H2O ביסודיות באמצעות 3 ספלים מלאים הנדסה גנטית H2O, לייבש את coverslip באמצעות נייר מקצה coverslip. למקם את coverslip לתוך הצנצנת מכתימים ויבש את coverslip ביסודיות בתנור 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.<ol>
<li>לשטוף את coverslip עם מתנול ומניחים את הצנצנת מכתימים לתוך התנור 110 ° C שוב להתייבש היטב את coverslip. הערה: ייבוש ביסודיות את coverslip הוא מאוד חשוב, מכיוון APTES יש הרבה מבנים משטח אפשרי ברגע שזה בנוכחות מים19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip functionalization<ol>
<li>להוסיף 70 מ של פתרון silane (93% מתנול, 5% אצטית, ו- 2% APTES) לתוך כל צנצנת, לדפוק את הכובע ולהזמין את הצנצנת בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
		<li>שטוף ויבש על coverslips כפי שמתואר בשלב 3.1.5, אלא לייבש את coverslips ביסודיות באמצעות גז חנקן במקום הצבת אותם בתנור.</li>
		<li>יתמוסס 150 מ ג של mPEG (מתוקסי-פוליאתילן גליקול) ו- 6 מ ג של ביוטין-יתד (ביוטין-פוליאתילן גליקול) 1 מ"ל של 0.1 M מתוצרת טרייה NaHCO3 (pH 8.2) ביסודיות. צנטריפוגה ואז בגיל 17, g 000 x עבור 1 דקות להסיר יתדות קשי תמס. הערה: NaHCO טריים3 הוא מוכן; יש צורך להתאים את החומציות.</li>
		<li>מקם את coverslips silanized בתיבות והניח שני coverslips קטן על שני הקצוות של coverslips silanized. פיפטה 100 µL של פג פתרון על מרכז coverslip silanized, מקום אחר silanized coverslip על גבי.</li>
		<li>הוסף כמה הנדסה גנטית H2O בתיבה כדי לשמור את זה לח, דגירה על coverslips עם פג פתרון לפחות 3 שעות בחושך. הדגירה לילה יכול לעבוד גם כן.</li>
		<li>להפריד את זוגות coverslip תמשיך את פני השטח functionalized, לשטוף את coverslips באמצעות הנדסה גנטית H2O בהרחבה ו לייבש אותם עם גז חנקן.</li>
		<li>סמן את הצד functionalized של coverslips באחת הפינות באמצעות עט מרקר, שמור על הצד functionalized כלפי מעלה, מקם אותם בתוך קופסאות, לאחסן את הקופסאות desiccator ואקום במשך חודש.</li>
		<li>כדי לאחסן את coverslips למשך זמן ארוך יותר, מקום אחד coverslip לתוך צינור 50 מ ל קדח עם חור אחד על הכובע שלו, ואז לשים את הצינור לתוך שקית ניילון, לסגור את השקית בעזרת חותם ה ואקום. בדרך זו, coverslips שניתן לאחסן ב-20 ° C כ- 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. זרימה תא הרכבה
<ol><li>חותכים ערוץ 15 מ"מ × 2 מ"מ במרכז של פיסת נייר-דבק כפול (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כבטלן.</li>
	<li>לקלף הצד נייר של הקלטת דו-צדדית והדבק אותו בשקופית זכוכית עם שני חורים. לחץ כדי להסיר בועות אוויר. על סמך הניסיון שלנו, קל להסיר בועות אוויר על ידי פילינג בצד נייר מאשר הצד פלסטיק של הקלטת דו-צדדית.</li>
	<li>חתך של coverslip functionalized (60 מ"מ × 24 מ"מ) לתוך ארבע חתיכות (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כוס יהלום שקצהו הסופר, ולהסיר את הלכלוך באמצעות גז חנקן. זכור לשמור את functionalized בצד פנים למעלה.</li>
	<li>לקלף את הצד פלסטיק של הקלטת דו-צידית, הדבקת השקופית-coverslip functionalized. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר בין coverslip את הקלטת. הסרת בועות אוויר ביסודיות יכול להגן על התא זרימה דולף בזמן מאגרי נשאבו לתוכה.</li>
	<li>הכנס כניסת ו עודפים צינורות לתוך חורים קטנים וגדולים, בהתאמה. לתקן את הצנרת באמצעות אפוקסי.</li>
	<li>משאבה µL 20 של streptavidin (0.2 מ"ג/מ"ל) לתא זרימה באמצעות מזרק באופן ידני, דגירה-RT למשך 10 דקות. ואז לשאוב מאגר חסימה10 לתא זרימה כדי להחליף את streptavidin, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>5. הדמיה מולקולה בודדת
<ol><li>להשיג את היישור מוקד של אדום, מרחיקת אדום עם A5 בשקופית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בדיקת #1 על ידי עירור בו זמנית באמצעות 532 ננומטר לייזר ו- 640 ננומטר לייזר. לייצר תמונות גל כפול עם פיצול אופטיקה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>מניחים את התא זרימה על המיקרוסקופ וחבר שלה אבובים עודפים חיבור לצנרת יותר עם קפיץ 10 מ"ל להתקין משאבת אינפוזיה אוטומטיות/גמילה לתכנות. הערה: שאיבה מאגרי לתוך התא זרימה המוזכרים להלן אמצעי מהאמנה מאגרי לאורך צינור כניסת התא זרימה המזרק.</li>
	<li>משאבה מאגר חסימה ב- µL 500/דקה לתוך התא זרימה כדי להוציא אוויר במהירות ולהבטיח כי המאגר בתא זרימה זו אינה חסומה. לאחר מכן לשאוב את המאגר חסימה ב- µL 200/דקה לתוך התא זרימה, הפוך לאורך צינור עודפים כדי להסיר בועות אוויר לאורך צינור כניסת והתא זרימה ביסודיות. הערה: כל מאגרי שאוב לתוך התא זרימה צריך להיות degassed, desiccator ואקום לפחות 15 דקות לפני השימוש.</li>
	<li>להוסיף 0.5 µL של ה-DNA λ-ARS317 biotinylated µL 80 מאגר חסימה, לנפח את זה לתוך התא הזרימה ב- µL 25/דקה למשך 2 דקות. ואז שטפי DNA λ-ARS317 באמצעות µL 200 מאגר חוסמת בקצב של µL 50/min.</li>
	<li>משאבה µL 200 של איגוד מאגר10 בקצב של 50 µL/דקה כדי להסיר את המאגר חסימה בתא זרימה.</li>
	<li>הוספת 0.2 µL של מצופים streptavidin Qdot705 (1 מיקרומטר) ו- 0.2 µL של biotinylated אורק (1.2 מיקרומטר) לתוך צינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואז להוסיף 20 µL של איגוד מאגר לתוך הצינור, ומניחים אותו על קרח. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא כ-10 ננומטר.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של אורק-Qdot705 (10 ננומטר), µL 1 של DTT (100 מ מ), µL 1 של ATP (200 מ מ) לתוך µL 96 איגוד המאגר. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא 0.2 ננומטר.</li>
	<li>משאבה µL 20 של nM 0.2 אורק-Qdot705 בקצב של 10 µL/דקה לתוך התא זרימה. לשטוף החוצה של אורק-Qdot מוגזמת705 באמצעות µL 200 איגוד מאגר בקצב של µL 100/min. ואז המשאבה מאגר מחייב עם 30 nM SYTOX תפוז לתוך התא זרימה כתם DNA סובסטרטים בקצב של µL 100/min.</li>
	<li>לרגש את האות705 אורק-Qdot, SYTOX כתום צבעונית דנ א אות באמצעות 405 ננומטר לייזר ו- 532 ננומטר לייזר, בהתאמה. לצפות את האותות בו זמנית עם 100 תזרים µL/דקה באמצעות מסנן bandpass Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) והקלט את התמונות על ידי EM-CCD עם ms 100 לכל מסגרת. לאסוף 20 אוספי תמונות מתחומים שונים.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>חיתוך תמונות באמצעות התוכנה פיג'י עם תוסף חדש, שהוא שונה על-ידי עצמנו בהתבסס על התוסף התמונה (OI_cut_RGBmerge) שפותח על ידי במעבדה ד ר רון העמקים באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.<ol>
<li>לחתוך ערימה של תמונות (512 × 512 פיקסלים) לתוך שתי ערימות של תמונות (256 × 256 פיקסלים). אחד הוא 532 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת, והשני הוא 405 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תהליך 61 תמונות רציפים באמצעות פרויקט פיג'י-תמונות-ערימות-Z (בעוצמה ממוצעת).</li>
	<li>למדוד אורך הדנ א (DNAL) ואת המרחק מאתר של אורק-Qdot מחייב705 (Lאורק) על ה-DNA של הדי קשורה סוף באופן ידני.</li>
	<li>לחשב את התוצאה של Lאורק/Lהדנ א באמצעות excel, לנתח את הנתונים באמצעות שיטת האתחול מאת R, ולאחר מכן ליצור ההיסטוגרמה ובכושר הפצות לפי עקומת גאוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria.">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots:+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors.">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots.">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA.">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li><li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot.">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li><li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system.">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li><li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level.">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).</li><li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation:+origin+specificity,+licensing,+and+firing+at+the+single-molecule+level.">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li><li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes.">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies.">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li><li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single-molecule+approach+to+visualize+the+nucleosome+assembly+in+yeast+nucleoplasmic+extracts.">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li><li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li><li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+&#955;+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates.">A bacteriophage &#955; DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li><li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes.">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li><li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את האינטראקציה בין החלבון התווית על-ידי Qdot ה-DNA λ site-specifically ששונתה באמצעות TIRFM בתא-זרימה. הצעדים הנדרשים כוללים שינוי בייעודי לאתר של DNA המצע, דנ א biotinylation, coverslip ניקוי functionalization, זרימה-תא הכנה ואני הדמיה מולקולה בודדת. ישנן שתי נקודות מפתח יש לציין. ראשית, כל ה...

אינטראקציות בין חלבונים ודנ א חיוניים רבים תהליכים ביולוגיים מורכבים, כגון שכפול ה-DNA, DNA לתקן שעתוק. למרות גישות קונבנציונליות יש לשפוך אור על המאפיינים של תהליכים אלה, מנגנונים מרכזיים רבים עדיין אינם ברורים. לאחרונה, עם טכניקות מולקולה בודדת המתפתחת, חלקם של המנגנונים היו כשהיא ממוענת1,2,3.
היישום של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ על להמחיש בעיקר אינטראקציות חלבון-DNA בזמן אמת תלויה ההתפתחות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית וזונדים פלורסנט. עבור מחקר מולקולה בודדת, חשוב לה תווית החלבון עניין גשש פלורסנט מתאים מאחר ומערכות גילוי פלורסצנטיות הם בעיקר זמינים מסחרית.
פלורסנט חלבונים משמשים בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, הבהירות פלורסנט נמוך ויציבות נגד photobleaching להגביל את היישום שלה במבחני מולקולה בודדת רבים. נקודות קוונטיות (Qdots) הם זעיר פולט-אור חלקיקים4. בשל תכונותיהם אופטי ייחודי, Qdots בהירים 10 - 20 פעמים, מספר אלפי פעמים יציב יותר מאשר בשימוש נרחב אורגניים צובעת5. יתר על כן, Qdots יש גדולים סטוקס shift (ההפרש בין המיקום של פסגות עירור, פליטה)5. לכן, ניתן להשתמש Qdots תצפית ותיק (דקות עד שעות), רכישת תמונות עם יחס אות לרעש גבוה, בזמן שהם לא יכול להיות מנוצל על מבחני כמותית.
עד כה, ישנן שתי גישות לתייג את חלבון המטרה עם Qdots site-specifically: תיוג בסיועם של7,6,Qdot מצומדת ראשית או משנית של נוגדנים8; או תיוג היעד החלבון עם Qdots ישירות, אשר מבוססת על האינטראקציה חזקה בין ביוטין ו streptavidin9,10,11,12,13. מצופים Streptavidin Qdots זמינים מסחרית. במחקר האחרון שלנו, site-specifically biotinylated חלבונים בניצני שמרים עם יעילות גבוהה היו מטוהרת על-ידי co-ביטוי של בירה וחלבונים מתויג אבי in vivo10. על ידי16,1715,14,מבחני יחיד מולקולה הפעולות הבאות ואופטימיזציה, ראינו את האינטראקציות בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ודנ א-באמצעות רמת מולקולה בודדת TIRFM10.
כאן, אנו בוחרים את ניצני שמרים מקור זיהוי מורכבים (ORC), אשר ניתן באופן ספציפי לזהות, לאגד הרצף באופן עצמאי שכפול (ARS), כמו שלנו חלבון עניין. הפרוטוקול הבא מציג הליך שלב אחר שלב של ויזואליזציה האינטראקציה של התווית על-ידי Qdot אורק עם ארס של שימוש TIRFM. הכנת המצע דנ א שונה site-specifically, biotinylation את ה-DNA, הניקוי coverslip functionalization, את מכלול תאי זרימה ואת ההדמיה מולקולה בודדת מתוארים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית תרם תרומות גדול בניתוח במנגנונים של תהליכים ביולוגיים מורכבים ברמת מולקולה בודדת. מולקולה בודדת מבחני ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א, ישנם שני גורמים חשובים עבור שיקול: המצע DNA עם אורך מספיק עבור תיוג חלבון גשש פלורסנט מתאימים ופיקוח קל. 48.5 kb λ DNA הוא מועמד טוב המצע הדנ א. נקודות קוונטיות (Qdots), כמחלקה של הגששים פלורסנט, מאפשרים התבוננות ותיק (דקות עד שעות) ו ייבוא תמונות באיכות גבוהה. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א ברמת מולקולה בודדת, הכוללת הכנת λ ששונה site-specifically DNA, תיוג חלבון המטרה עם מצופים streptavidin Qdots. עבור הוכחת הרעיון, נוכל לבחור אורק (זיהוי מקור מורכבים) בניצני שמרים כמו חלבון עניין והמחש ביחסיו עם ארס (רצף באופן עצמאי שכפול) באמצעות TIRFM. לעומת אחרים הגששים פלורסנט, Qdots יש יתרונות ברורים במחקרים מולקולה בודדת בשל עמידותו גבוהה נגד photobleaching, אך ראוי לציין כי מאפיין זה מגביל את היישום שלה במבחני כמותית.

כדי להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot אורק את ארס, ואנחנו נבנה לראשונה את המצע DNA λ-ARS317. קטע DNA המכיל ARS317 היה משולב לתוך Xhoאני אתר (33.5 kb) של ה-DNA λ מקורי על-ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 1 א'). המוצר רקומבינציה נארזה באמצעות תמציות ותרבותית החלקיקי...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified ÃŽÂ» DNA at the Single Molecule Level at JoVE.com

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K Views.  Chinese Academy of Sciences. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

Video: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...