우리 닥터 하 산 Yardimci 감사 하 고 종류의 프랜시스 크릭 연구소의 Dr.Sevim Yardimci 도움이 단일 분자 실험에의 컬럼비아 대학, 박사 에릭 C. 그린의 연구소에서 박사 다니엘 Duzdevich 박사 유지 북경 대학교의 태양과의 Chunlai 첸 박사 칭화 대학 유용한 토론에 대 한입니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 31371264, 31401059, CAS 혁신 팀과 뉴턴 고급 친교 (NA140085)에서 왕 사회에 의해 지원 되었다.

1. λ-ARS317 DNA 기판의 준비
<ol><li>DNA 기판 건설 및 포장<ol>
<li>소화 Xho을 사용 하 여 네이티브 λ DNA 나 효소; ARS317 신진의 genomic DNA에서 20를 포함 하는 뇌관을 사용 하 여 효 모 543 bp DNA 조각 베어링 증폭 bp 동종 시퀀스의 업스트림 및 다운스트림 Xho나 람다 DNA에서 효소 사이트. 추가 100 ng Xho의 λ DNA와 10 소화 DNA의 ng 동종 재결합 반응 시스템, 10 µ L를 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
		<li>재결합 λ DNA 패키지, 재결합 제품으로 람다 포장 추출의 25 µ L을 추가 하 고 90 분 30 ° C에서 반응을 품 어. 그런 다음 람다 포장 추출 반응 관에의 한 추가 25 µ L를 추가 합니다. 계속 품 어 90 분 30 ° C에서 반응.</li>
		<li>반응 시스템에 살 균 희석 버퍼 (10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 m m MgCl2)의 500 µ L을 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합. 클로 프롬의 25 µ L을 추가 하 고, 부드럽게 혼합, 4 ° c.에 저장</li>
		<li>포장 된 살 균 소의 100 µ L 및 100 µ L 세균 LE392MP의 추가 (0.8-에서 교양 1.0 파운드 매체 10 mm MgSO4추가 사용 하 여) 새로운 튜브로. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 mL oftop agar (파운드 매체 + 0.7% agar 10mm MgSO4, 48 ° C에 냉각)으로 살 균 소 박테리아 혼합물의 200 µ L를 추가 합니다. 즉시 튜브를 거꾸로 여러 번 설정 하 여 혼합 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 파운드 접시에 부 어.</li>
		<li>37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 그리고 λ-ARS317 패 PCR를 사용 하 고 시퀀싱 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 lysates11,18 에서 DNA 기질 정화<ol>
<li>살 균 ddH2O 10 m MgCl2 와 10 nM CaCl2의 200 µ L로 한 패를 선택 합니다. 200 µ L의 박테리아 LE392MP (파운드 매체에서 교양된 하룻밤)와 함께 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>NZCYM의 100 mL에 박테리아 살 균 소 혼합물을 추가 (10 g/L 뉴질랜드-아민, 5 g/L 효 모 추출 물, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino의, 그리고 2 g/L MgSO4·7H2O) 37 ° c.에 7 h에 대 한 문화와 매체 문화에 클로 프롬의 250 µ L을 추가 하 고 다른 10 분 동안 흔들어.</li>
		<li>200 mL 플라스 크에 문화를 전송 합니다. NaCl (1 M 최종 농도)의 5.8 g를 추가 하 고, 해산 저 어 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>셀 파편 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 200 mL 플라스 크에는 상쾌한을 수집 하 고 10% 말뚝8000 (m/V) 추가. 자석 교 반 장치에 의해 해산 하 고 30 분 이상 얼음에 품 어 저 어.</li>
		<li>살 균 소 침전에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>살 균 소 희석 버퍼의 2 mL에 침전을 resuspend. 15 mL 튜브로 전송 하 고 RNase (최종 농도 20 µ g/mL)의 10 µ L 및 DNase (최종 농도 5 µ g/mL)의 40 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.3의 2 개 mL를 추가 M Tris HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25 %SDS, 15 µ L 성분 K (최종 농도 10 µ g/mL). 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.</li>
		<li>사전 냉각된 칼륨 아세테이트 (3 M, pH 4.8)의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.</li>
		<li>불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
		<li>에 상쾌한 소 프로 파 놀의 0.7 x 볼륨을 추가 합니다. 거꾸로 여러 번 튜브를 설정 하 여 혼합 하 고 실내 온도 (RT)에 2 분 동안 품 어.</li>
		<li>DNA를 침전 하는 RT에 10 분 동안 8000 x g에서 원심. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>일단 70% 에탄올 10 분에 대 한 8000 x g에서 원심 분리 하 여 제거는 상쾌한 DNA를 씻어.</li>
		<li>부드럽게, 500 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m EDTA, pH 8.0)를 사용 하 여 DNA elute 그리고 1.5 mL 튜브에 DNA를 전송.</li>
		<li>두 번 페 놀을 사용 하 여 DNA를 추출: 10 분에 대 한 8000 g에서 원심 분리 하 여 클로 프롬.</li>
		<li>0.7 x 볼륨 소 프로 파 놀과 침전. 거꾸로 튜브, 부드럽게 내려와 10 분 동안 8000 x g에서 원심 회전 하 여 혼합.</li>
		<li>한 번 70% 에탄올으로 씻어, 테의 200 µ L에서 resuspend. DNA 농도 측정 하 고 12.5 µ g aliquots에-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides phosphorylate를 (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-비오 틴-3') 출신의 왼쪽된 끝에 보완 λ DNA, oligonucleotides ddH2O, 1 µ L의 리가 버퍼, x 10의 7.5 µ L, T4 PNK의 0.5 µ L의 1 µ L (100 µ M)를 추가. 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317 phosphorylate, λ-ARS317의 12.5 µ g, 3 µ L 리가 버퍼 x 10의 추가, T4 PNK ddH2O 30 µ L의 총 볼륨의 1 µ L 3 h 37 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides anneal, phosphorylated oligonucleotides의 0.5 µ L, ddH2O, phosphorylated λ-ARS317 관에 10 × 리가 버퍼의 25 µ L의 195 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 65 ° C 블록 히터, 고 하자 블록에 33 ° C 아래에 샘플 쿨 5 분 턴에서 품 어.</li>
	<li>Λ-ARS317와 oligonucleotides 선, T4 DNA 리가의 1 µ L와 ATP (200 m m)의 0.63 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 거꾸로 설정 하 여 혼합 하 고 하룻밤 실 온에 2 시간 또는 4 ° C에서 품 어. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 헤어 지는 DNA를 방지 하려면 모든 혼합 단계 할 수 하 여 부드럽게 튜브 거꾸로, 펫을 사용 하 여 혼합 하는 대신.</li>
</ol>3. Coverslip 청소 및 기능화
<ol><li>청소 하는 Coverslip<ol>
<li>4 착 색 항아리 (5 coverslips/병)에 장소 20 coverslips 에탄올, 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴.</li>
		<li>1 M 수산화 칼륨 (KOH), 30 분 동안 sonicate 고 초순 H2O 3 시간 coverslips를 헹 굴. 에탄올 및 코 쥡니다 한 번 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 동안, 아세톤과 sonicate 고 다음 초순 H2O 철저 하 게 린스 (3 번 이상). 참고: 아세톤 제거 해야 합니다 철저 하 게 rinsing 초순 H2O, 여 때 실수로 고생 솔루션 (아세톤) 등 유기 용 매 혼합 폭발이 발생할 수 있기 때문에14.</li>
		<li>피 라 솔루션에는 coverslips를 배치 (H2의 3:1 혼합 등4 과 30% H2O2)와 1 시간 동안 95 ° C에 품 어. 참고: 피 솔루션은 높은 활력과 침식, 그래서 신중 하 게 사용. 준비할 때 피 솔루션, 500 mL 유리 비 커에 H2O2 의 50 mL를 먼저 추가 하 고 그래서 H2의 150 mL를 추가 합니다4 비 커에 천천히.</li>
		<li>5 번 초순 H2O coverslips를 헹 구 십시오. 다음 각 coverslip 초순 H2O 3 비 커 가득 초순 H2O를 사용 하 여 철저 하 게 세척 하 고 건조 coverslip는 coverslip의 가장자리에서 종이 사용 하 여. 얼룩 항아리에는 coverslip를 놓고 30 분 동안 coverslip 110 ° C 오븐에서 철저 하 게 건조 합니다.<ol>
<li>메탄올을 가진 coverslip 린스 고 얼룩 단지 110 ° C 오븐을 다시는 coverslip 철저 하 게 건조 합니다. 참고:는 coverslip 철저 하 게 건조 매우 중요 하다, 물19존재는 일단 항 가능한 표면 구조를 많이 있을 것 이다 때문에.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip 기능화<ol>
<li>실 란 솔루션의 70 mL을 추가 (93% 메탄올, 아세트산, % 및 2 %5 항) 각 항아리에 뚜껑을 나사와 하룻밤 실 온에서 항아리를 두고.</li>
		<li>워시와 3.1.5, 건조 오븐에서 그들을 배치 하는 대신 철저 하 게 질소 가스를 사용 하 여 coverslips를 제외 하 고 단계에 설명 된 대로 coverslips를 건조.</li>
		<li>0.1 m M 신선한 만든 NaHCO3 (pH 8.2) 1 mL에 150mg mPEG (methoxy-폴 리 에틸렌 글리콜)의 biotin-말뚝 (biotin-폴 리 에틸렌 글리콜)의 6 mg를 철저 하 게 분해. 17 다음 원심 분리기, 불용 성 못을 제거 하는 1 분 동안 000 x g. 참고: 갓 만든된 NaHCO3 은 준비; pH를 조정할 필요가 있다.</li>
		<li>상자에 silanized coverslips를 놓고 두 개의 작은 coverslips silanized coverslips의 두 끝 위에 넣어. 100 µ L silanized coverslip의 중앙에 못 솔루션의 플라스틱 그리고 다른 silanized coverslip 상단에 배치.</li>
		<li>습기가 유지 상자에 일부 초순 h 조2O를 추가 하 고 어둠 속에서 적어도 3 h 말뚝 솔루션 coverslips를 품 어. 야간 보육도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Coverslip 쌍을 분리 하 고 기능성된 표면 얼굴 유지, 린스 초순 h 조2O를 사용 하 여 광범위 하 게, coverslips 질소 가스와 함께 그들을 건조.</li>
		<li>표시 마커 펜, 기능성된 측면 얼굴, 상자에 넣어에 저장 하는 상자 진공 desiccator 1 개월 유지를 사용 하 여 모서리 중 하나에 coverslips의 기능성된 측면.</li>
		<li>긴 시간 동안에 coverslips를 저장 하 한 coverslip 모자에 1 개의 구멍을 뚫고 50 mL 튜브에 다음 비닐 봉지에 튜브를 넣어 놓고 진공 실러를 사용 하 여 가방을 봉인 합니다. 이 방법에서는, coverslips는 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 3 개월.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 흐름 셀 조립
<ol><li>양면 테이프 (30 m m × 12 m m)는 주먹을 사용 하 여 조각의 센터에서 15 m m × 2 m m 채널을 절단.</li>
	<li>양면 테이프의 종이 쪽을 벗기십시오 고 두 개의 구멍을 유리 슬라이드에 붙여 넣습니다. 기포 제거를 누릅니다. 우리의 경험을 바탕으로, 그것은 쉽게 양면 테이프의 플라스틱 측면 보다 종이 쪽을 벗 하 여 기포를 제거 하.</li>
	<li>4 기능성된 coverslip (60 m m × 24 m m)를 잘라 조각 (30 × 12 mm) 다이아몬드로 만들어진 유리를 사용 하 여 학자, 하 고 질소 가스를 사용 하 여 파편을 제거. 기능성 유지 해야 측면 얼굴.</li>
	<li>이중 면 테이프의 플라스틱 면을 벗기십시오 고 기능성된 coverslip에 슬라이드를 붙여 넣습니다. 기포는 coverslip와 테이프를 제거 하려면을 살짝 누릅니다. 철저 하 게 공기 방울을 제거 버퍼 했다 그것으로 펌핑 하는 동안 누출에서 흐름 세포를 보호할 수 있습니다.</li>
	<li>입구와 출구 배관에 삽입 작은, 큰 구멍, 각각. 에폭시를 사용 하 여 튜브를 수정 합니다.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL)의 20 µ L 주사기를 사용 하 여 수동으로 흐름 세포로 펌프 하 고 10 분 동안 RT에서 품 어. 블로킹 버퍼10 streptavidin, 대체 흐름 세포로 펌프 그리고 실내 온도에서 보관.</li>
</ol>5. 단일 분자 시각화
<ol><li>532 nm 레이저와 640 nm 레이저를 사용 하 여 동시 여기 빨간색과 형광 현미경 테스트 슬라이드 # 1에서 a 5와 빨강의 초점 맞춤 얻을. 듀얼 파장 광학 (참조 테이블의 재료)를 분할 이미지를 생산.</li>
	<li>흐름 세포를 현미경에 놓고 10 mL 스프링 자동된 주입/철수 프로그래밍 가능 펌프에 설치 된 더 이상 배관 연결 콘센트 배관 연결. 참고: 주사기를 흐름 셀의 입구 배관에서 버퍼를 인출 하는 방법 아래에 언급 하는 흐름 셀으로 버퍼를 펌핑.</li>
	<li>공기를 신속 하 게 제거 하 여 흐름 셀에 버퍼 차단이 되었는지 확인 흐름 셀에 500 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프. 그리고 흐름 세포에 200 µ L/min에서 블로킹 버퍼를 펌프 콘센트 튜브 입구 배관 및 흐름 셀에서 기포를 완전히 제거를 플립. 참고: 모든 버퍼 흐름 셀으로 펌핑 해야 될 degassed 진공 desiccator에 사용 하기 전에 적어도 15 분 동안.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 80 µ L로 biotinylated λ-ARS317 DNA의 0.5 µ L을 추가 하 고 2 분 25 µ L/min 흐름 셀에 펌프. 다음 50 µ L/분의 속도로 차단 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 λ-ARS317 DNA 플러시.</li>
	<li>흐름 세포에 블로킹 버퍼를 제거 하 50 µ L/min의 속도로 버퍼10 바인딩 200 µ L 펌프.</li>
	<li>0.2 µ L streptavidin 입히는 Qdot705 (1 µ M)의 추가 및 biotinylated 오크의 0.2 µ L (1.2 µ M) 튜브로 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 버퍼 튜브에 바인딩 20 µ L을 추가 하 고 얼음에 놓습니다. 오크 Qdot705 의 최종 농도 약 10 nM.</li>
	<li>2 µ L 오크 Qdot705 의 추가 (10 nM), DTT (100 m m), 바인딩 버퍼의 96 µ L로 ATP (200 m m)의 1 µ L의 1 µ L. 오크 Qdot705 의 최종 농도 0.2 nM.</li>
	<li>흐름 셀에 10 µ L/min의 속도로 0.2 nM 오크 Qdot705 의 20 µ L를 펌프. 100 µ L/min의 속도로 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 과도 한 오크 Qdot705 의 밖으로 플러시. 다음 100 µ L/min의 속도로 DNA 기판 얼룩 흐름 셀으로 30 nM SYTOX 오렌지 펌프 바인딩 버퍼.</li>
	<li>오크 Qdot705 신호를 자극 하 고 SYTOX 오렌지 스테인드 DNA 신호 각각 405 nm 레이저와 532 nm 레이저를 사용 하 여. 쿼드-밴드 대역 통과 필터 (FF01-446/510/581/703-25)를 사용 하 여 100 µ L/min 흐름으로 신호를 동시에 관찰 하 고 프레임 당 100 ms와 EM CCD로 이미지를 기록 합니다. 다양 한 분야에서 20 이미지 스택을 수집 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>캘리포니아 대학교 샌 프란 시스 코 박사 론 베일의 연구소에 의해 개발 된 이미지 플러그인 (OI_cut_RGBmerge)를 기반으로 하는 새로운 플러그인, 스스로 의해 수정 되는 피지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 자르기.<ol>
<li>이미지 (512 × 512 픽셀)의 스택 이미지 (256 × 256 픽셀)의 2 개 더미로 자르기. 하나는 532 nm 레이저 흥미로운 결과, 그리고 다른 한 405 nm 레이저 흥미로운 결과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지-이미지-스택-Z 프로젝트 (평균 강도)를 사용 하 여 61 순차적인 이미지를 처리 합니다.</li>
	<li>측정 길이 (LDNA) DNA와 dna의 DNA에 오크 Qdot705 (L오크) 바인딩 사이트에서 거리의 끝을 수동으로 곁.</li>
	<li>L오크/LDNA 의 결과 계산을 사용 하 여 excel r, 부트스트랩 메서드를 사용 하 여 데이터를 분석 그리고 히스토그램을 생성, 가우스 배급에 맞게.</li>
</ol>

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<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 선물이 Qdot 표시 된 단백질 및 흐름 셀에서 TIRFM는을 사용 하 여 site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 관찰 하는 프로토콜. 필요한 단계는 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름-세포 준비, 및 단일 분자 이미징 사이트 수정 포함 됩니다. 주목 해야 한다 두 가지 요점을 확인 하 고 있습니다. 첫째, λ DNA와 관련 된 단계, 예를 들어, 어떤 가능한 손상 감소를 부드럽게 ...

단백질 및 DNA 사이 상호 작용, DNA 복제, DNA 수리, 전사 등 많은 복잡 한 생물 학적 과정에 필수적입니다. 기존의 접근 이러한 프로세스의 속성에 빛을 발산가, 비록 많은 키 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 최근, 급속 하 게 발전 한 분자 기술로 메커니즘의 일부 해결된1,2,3되었습니다.
주로 단백질 DNA 상호 작용을 실시간으로 시각화에 단일 분자 형광 현미경 검사 법의 응용 프로그램의 형광 탐지 및 형광 프로브 개발에 따라 달라 집니다. 단일 분자 연구를 위해 그것은 형광 탐지 시스템은 주로 상업적으로 사용할 수 있기 때문에 적합 한 형광 프로브 관심사의 단백질을 분류 하는 것이 중요.
형광 단백질 분자 생물학에 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 낮은 형광 밝기 및 photobleaching에 대 한 안정성 많은 단일 분자 분석에 응용 프로그램을 제한합니다. 양자 점 (Qdots)는 작은 발광 나노 입자4. 그들의 독특한 광 속성으로 인해 Qdots은 10-20 배 더 밝다 고 몇 천 배 더 많은 안정 보다 널리 사용 되는 유기 염료5. 또한, Qdots 있다 큰 Stokes shift (여기 및 방출 봉우리의 위치 사이의 차이)5. 따라서, Qdots 동안 양적 분석에서 이용 될 수 없습니다 오랜 관찰 (시간 분) 및 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지의 수집에 대 한 사용할 수 있습니다.
날짜 하려면, site-specifically Qdots와 대상 단백질을 분류 하는 방법은 두 가지: Qdot 활용 된 주 또는 보조 항 체6,,78;의 원조로 또는 대상 단백질 Qdots와 직접, biotin와 streptavidin9,10,11,,1213사이 강한 상호 작용을 기반으로 라벨. Qdots Streptavidin 입히는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 연구에서 site-specifically biotinylated 단백질을 높은 효율으로 신진 효 모에 BirA Avi 태그 단백질의 공동 overexpression에 의해 정화 되었다 vivo에서10. 다음 하 고 단일 분자 분석 실험14,15,,1617최적화, 단일 분자 수준의 사용에 Qdot 표시 된 단백질 및 DNA 사이 상호 작용 관찰 TIRFM10.
여기, 우리가 선택한 신진 관심사의 우리의 단백질으로 원래 인식 복잡 한 (오크)을 구체적으로 인식 하 고 자율적으로 복제 시퀀스 (ARS)에 바인딩할 수, 효 모. 다음 프로토콜 TIRFM를 사용 하 여 Qdot 표시 된 오크 ARS와의 상호 작용을 시각화 하는 단계별 절차를 제공 합니다. Site-specifically 수정된 DNA 기판, DNA biotinylation, coverslip 청소 및 기능화, 흐름 셀 어셈블리 및 단일 분자 이미징의 준비는 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Store 25 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XhoI&lt;/em&gt; enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Quick-fusion cloning kit</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda&lt;br/&gt; Packaging Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bacterial strain LE392MP&lt;br/&gt; is included in this package.</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10013092</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Any brand is acceptable.</td></tr><tr><td>NZ-amine</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirring apparatus</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tube</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>sulfuric acid</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Hydrogen peroxide</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG&lt;br/&gt; (methoxy-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG&lt;br/&gt; (biotin-polyethylene glycol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum sealer</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Diamond-tipped glass scribe</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Inlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td></tr><tr><td>Outlet tubing</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>five minutes epoxy</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Infusion/withdrawal&lt;br/&gt; programmable pump</td><td>Harvard apparatus</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging&lt;br/&gt; splitting optics</td><td>Hamamatsu photonics K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illumination system</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;times;TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Quad-edge laser dichroic&lt;br/&gt; beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/&lt;br/&gt; 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Quad-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/&lt;br/&gt; 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot&lt;sub&gt;705 &lt;/sub&gt;Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store at 4 &amp;ordm;C, do not freeze.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, adjust pH to 7.0, and store 10 &amp;mu;L aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare 1 M solution using ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and store 10 &amp;mu;l aliquots at -20 &amp;ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

형광 현미경 검사 법 단일 분자 수준에서 복잡 한 생물 학적 과정의 메커니즘을 해 부에 큰 기여를 했다. 단일 분자 DNA 단백질 상호 작용을 공부에 대 한 분석에서 고려에 대 한 두 가지 중요 한 요소는: 쉽게 관찰 하 고 적합 한 형광 프로브는 단백질을 라벨에 대 한 충분 한 길이와 DNA 기질. 48.5 kb λ DNA DNA 기판에 대 한 좋은 후보입니다. 양자 점 (Qdots), 형광 프로브 클래스로 장기간 관찰 (시간 분)와 높은 품질 이미지 수집 수 있습니다. 이 논문에서는, site-specifically 수정된 λ DNA를 준비 하 고 라벨 streptavidin 입히는 Qdots와 대상 단백질을 포함 하는 단일 분자 수준에서 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜 선물이. 개념 증명에 대 한 우리 오크 (복잡 한 원산지 인정) 신진 효 모에 관심사의 단백질으로 선택한 TIRFM 사용 하는 ARS (자동으로 복제 시퀀스)와 상호 작용을 시각화 합니다. 다른 형광 프로브에 비해, Qdots photobleaching에 대 한 그것의 높은 안정성 때문에 단일 분자 연구에 분명 한 이점이 있다 하지만이 속성 양적 분석에 응용 프로그램 제한에 주목 한다.

Qdot 표시 된 오크는 ARS의 상호작용을 시각화 하려면 우리가 먼저 λ-ARS317 DNA 기판 건설. ARS317를 포함 하는 DNA 조각 통합 되었다 Xho에 내가 사이트 (33.5 kb) 네이티브 λ DNA의 동종 재결합 (그림 1A). 재결합 제품 추출 물을 사용 하 여 패키지 된 고 포장된 살 균 소 입자 파운드 플레이트 (그림 1B)에 경작 되었다. 긍정적인 살 균 ...

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.5K 조회수.  Chinese Academy of Sciences. 여기, 선물이 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) site-specifically 수정된 λ DNA 기판 및 양자 점 단백질 분류를 사용 하 여 DNA 단백질 상호 작용을 공부 하는 프로토콜.

비디오: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

연구

생화학

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

면역학 및 감염병학

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

생물학

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

단백질 상호 작용의 Live Cell Single-Molecule Imaging-Based 정량화

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

저자 스포트라이트: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

요약

더 많은 비디오 탐색

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정