Si ringraziano il Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci dell'Istituto Francis Crick per tipo aiutare negli esperimenti singola molecola, Dr. Daniel Duzdevich dal laboratorio del Dr. Eric C. Greene della Columbia University, Dr. Yujie Sun della Peking University e Dr. Chunlai Chen di Tsinghua University per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation della Cina 31371264, 31401059, CAS Team di innovazione interdisciplinare e la Newton Advanced Fellowship (NA140085) dalla Royal Society.

1. preparazione del substrato di DNA λ-ARS317
<ol><li>Imballaggio e la costruzione di DNA substrato<ol>
<li>Digerire DNA nativo λ usando Xhoio enzima; amplificare un 543 cuscinetto del frammento del DNA bp ARS317 dal DNA genomico di germogliamento lievito usando i primer contenenti 20 bp omologa sequenze di upstream e downstream di Xhoio sito enzima DNA di lambda. Aggiungere 100 ng di Xhoho digerito il DNA λ e 10 ng di DNA frammento a 10 µ l di sistema di reazione di ricombinazione omologa e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Per assemblare il DNA di λ di ricombinazione, aggiungere 25 µ l di lambda imballaggio estratti nel prodotto ricombinazione e incubi la reazione a 30 ° C per 90 min. Quindi, aggiungere un ulteriore 25 µ l di lambda imballaggio estratti nella provetta di reazione. Continuare a incubare la reazione a 30 ° C per 90 min.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di diluizione sterile (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl2) nel sistema di reazione e mescolare delicatamente ruotando il tubo capovolto più volte. Aggiungere 25 µ l di cloroformio, mescolare delicatamente e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l del fago confezionato e 100 µ l di batteri LE392MP (coltivate a 0.8 - 1.0 usando LB medium aggiunta con 10mm MgSO4) in una nuova provetta. Incubare a 37 ° C per 15 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di miscela dei fagi-batterio in 4 mL di agar Ditop (LB medium + 0,7% agar + 10mm MgSO4, raffreddata a 48 ° C). Mescolare immediatamente ruotando il tubo capovolto più volte e versarla su un piatto pre-riscaldata (37 ° C) LB.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte e la placca di λ-ARS317 mediante PCR e sequenziamento a schermo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione di DNA substrato da lisati liquido11,18<ol>
<li>Raccogliere una placca in 200 µ l di ddH sterile2O con 10 mM MgCl2 e 10 nM CaCl2. Mescolare con 200 µ l di batteri LE392MP (coltivata pernottamento in mezzo LB) e incubare a 37 ° C per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere la miscela dei fagi-batterio in 100 mL di NZCYM (10 g/L NZ-ammina, 5g/L lievito estratto, 5g/L NaCl, 1 g/L Casamino idrolizzato e MgSO4·7H2O 2 g/L) media e cultura per 7 h a 37 ° C. Aggiungere 250 µ l di cloroformio nella cultura ed agitare per altri 10 min.</li>
		<li>Diffondere la cultura in una beuta da 200 mL. Aggiungere 5,8 g di NaCl (concentrazione finale di 1 M), mescolare per sciogliere a mano e incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante in una beuta da 200 mL e aggiungere 10% PEG8000 (m/V). Mescolare per sciogliere col mescolatore magnetico e incubare in ghiaccio per 30 minuti o più.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C per far precipitare il batteriofago. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il precipitato in 2 mL di tampone di diluizione dei fagi. Trasferirlo in una provetta da 15 mL e aggiungere 10 µ l di RNAsi (concentrazione finale è 20 µ g/mL) e 40 µ l di dnasi (concentrazione finale è 5 µ g/mL). Incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, proteinasi di 15 µ l K (concentrazione finale è di 10 µ g/mL). Incubare a 65 ° C per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di acetato di potassio pre-raffreddata (3M, pH 4.8) e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min.</li>
		<li>Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile.</li>
		<li>Aggiungere 0,7 x volume di isopropanolo nel surnatante. Mescolare ruotando il tubo capovolto più volte e incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a RT per precipitare il DNA. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare il DNA una volta con 70% etanolo mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min. eliminare il surnatante.</li>
		<li>Eluire il DNA utilizzando delicatamente il tampone di 500 µ l TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e trasferire il DNA in provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Estrarre il DNA due volte con il fenolo: cloroformio mediante centrifugazione a 8.000 g per 10 min.</li>
		<li>Precipitare con 0,7 x volume di isopropanolo. Mescolare girando il tubo testa in giù delicatamente e centrifugare a 8.000 x g per 10 min.</li>
		<li>Lavare una volta con etanolo al 70%, risospendere in 200 µ l di TE. Misurare la concentrazione di DNA e conservare a-20 ° C in 12,5 µ g aliquote.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA biotinilazione
<ol><li>Fosforilare oligonucleotidi biotinilati (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementari all'estremità sinistra del nativo di λ DNA, aggiungere 1 µ l (100 µM) di oligonucleotidi, 7,5 µ l di ddH2O, 1 µ l di tampone di ligasi 10x e 0,5 µ l di T4 PNK. Incubare la reazione a 37 ° C per 3 h.</li>
	<li>Per fosforilare λ-ARS317, aggiungere 12,5 µ g di λ-ARS317, 3 µ l di tampone di ligasi 10x, 1 µ l di T4 PNK e ddH2O al volume totale di 30 µ l. incubi la reazione a 37 ° C per 3 h.</li>
	<li>Per temprare oligonucleotidi con λ-ARS317, aggiungere 0,5 µ l di oligonucleotidi fosforilati, 195 µ l di ddH2O, 25 µ l di tampone di ligasi × 10 nel tubo fosforilato λ-ARS317. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a 65 ° C per 5 min turno spento il riscaldatore blocco e lasciare raffreddare il campione a inferiore a 33 ° C nel blocco.</li>
	<li>Per lega i oligonucleotides con λ-ARS317, aggiungere 1 µ l di T4 DNA ligasi e 0,63 µ l del trifosfato di adenosina (200 mM). Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte. Conservare a 4 ° C per 1 mese. Nota: Per evitare di rompere il DNA, tutte le fasi di miscelazione devono essere eseguite capovolgendo delicatamente il tubo, invece di mescolare utilizzando pipette.</li>
</ol>3. vetrino coprioggetto pulizia e funzionalizzazione
<ol><li>Vetrino coprioggetti pulizia<ol>
<li>Posto 20 vetrini coprioggetti in 4 vaschette per colorazione (5 vetrini coprioggetti/vasetto), Sonicare per 30 minuti in etanolo e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte.</li>
		<li>Sonicare per 30 minuti con 1 M di idrossido di potassio (KOH) e sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 3 volte. Ripetere l'etanolo e KOH sonicazione una volta.</li>
		<li>Sonicare con acetone per 30 minuti e poi sciacquare abbondantemente con ultrapura H2O (almeno 3 volte). Nota: Acetone deve essere rimosso completamente risciacquando con ultrapura H2O, perché può causare un'esplosione quando solvente organico (ad esempio acetone) mescolato con la soluzione piranha erroneamente14.</li>
		<li>Inserire i vetrini coprioggetto soluzione piranha (miscela 3:1 di H2SO4 e 30% H2O2) e incubare a 95 ° C per 1 h. Nota: La soluzione Piranha è altamente energico e corrosiva, quindi usare con cautela. Quando si prepara la soluzione piranha, aggiungere 50 mL di H2O2 prima in un becher di vetro 500 mL e quindi aggiungere 150 mL di H2così4 lentamente nel bicchiere graduato.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini coprioggetti con ultrapura H2O 5 volte. Quindi lavare ogni vetrino coprioggetti con ultrapura H2O accuratamente con 3 bicchieri riempiti con ultrapura H2O ed asciugare il vetrino coprioggetto utilizzando carta dal bordo del coverslip. Inserire la vaschetta di colorazione del vetrino coprioggetto e asciugare il vetrino coprioggetto accuratamente in forno a 110 ° C per 30 minuti.<ol>
<li>Sciacquare il vetrino coprioggetto con metanolo e mettere la vaschetta di colorazione in forno 110 ° C per asciugare il vetrino coprioggetti. Nota: Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetto è molto importante, perché APTES avrà un sacco di possibili strutture superficiali, una volta che si è in presenza di acqua19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vetrino coprioggetti funzionalizzazione<ol>
<li>Aggiungere 70 mL di soluzione di silano (93% metanolo, 5% acetico e 2% APTES) in ogni vaso, avvitare il tappo e lasciare il vaso a temperatura ambiente durante la notte.</li>
		<li>Lavare e asciugare i vetrini coprioggetti, come descritto al punto 3.1.5, tranne per il fatto asciugare i vetrini coprioggetti accuratamente con gas azoto invece di metterli in forno.</li>
		<li>Sciogliere 150 mg di mPEG (metossi-polietilene glicole) e 6 mg di biotina-PEG (biotina-polietilenglicole) in 1 mL di 0.1 M fresca fatta NaHCO3 (pH 8.2) accuratamente. Poi Centrifugare a 17, 000 x g per 1 min a togliere pioli insolubile. Nota: Appena fatte NaHCO3 è pronto; non c'è nessuna necessità di regolare il suo pH.</li>
		<li>Posizionare i vetrini coprioggetti silanizzata nelle caselle e mettere due vetrini coprioggetti piccoli sulla parte superiore due estremità delle lamelle silanizzato. Pipettare 100 µ l di soluzione di PEG sul centro del coprivetrino silanizzata e inserire un altro vetrino coprioggetti silanizzata in alto a sinistra.</li>
		<li>Aggiungere alcuni ultrapura H2O nella finestra per mantenerlo umido e incubare i vetrini coprioggetti con soluzione PEG per almeno 3 ore al buio. Un'incubazione overnight può lavorare bene.</li>
		<li>Separare le coppie di coprioggetto e continuate il volto di superficie funzionalizzato, sciacquare i coprioggetti usando ultrapura H2O ampiamente e asciugarle con gas azoto.</li>
		<li>Contrassegnare il lato funzionalizzato di lamelle su uno degli angoli utilizzando un pennarello, tenere il lato funzionalizzato affrontare, metterli in scatole e archiviazione le caselle in un essiccatore sotto vuoto per 1 mese.</li>
		<li>Per memorizzare i coprioggetti per un tempo più lungo, porre un coprivetrino in una provetta da 50 mL forata con un buco sul suo tappo, poi mettere il tubo in un sacchetto di plastica e sigillare il sacchetto usando una macchina per il sottovuoto. In questo modo, lamelle possono essere immagazzinate a-20 ° C circa 3 mesi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. flusso Cell Assembly
<ol><li>Tagliare un canale 15 × 2 mm al centro di un pezzo di nastro biadesivo (30 mm × 12 mm) utilizzando un perforatore.</li>
	<li>Staccare il lato della carta del nastro biadesivo e incollarlo sul vetrino con due fori. Premere per rimuovere le bolle d'aria. Basandoci sulla nostra esperienza, è più facile rimuovere le bolle d'aria di pelatura fuori il lato della carta rispetto al lato di plastica del nastro biadesivo.</li>
	<li>Tagliare un vetrino coprioggetti funzionalizzato (60 mm × 24 mm) in quattro pezzi (30 mm × 12 mm) utilizzando un punta di diamante di vetro scribe e rimuovere i detriti utilizzando gas azoto. Ricordarsi di tenere il funzionalizzati lato faccia in su.</li>
	<li>Staccare la plastica laterale del nastro biadesivo e incollare la diapositiva il coprivetrino funzionalizzato. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria tra il nastro e il vetrino coprioggetti. Rimozione di bolle d'aria accuratamente può proteggere la cella di flusso da perdite mentre buffer sono stati pompati in esso.</li>
	<li>Inserire aspirazione e tubo di uscita nei fori piccoli e grandi, rispettivamente. Fissare il tubo con resina epossidica.</li>
	<li>Pompa 20 µ l di streptavidina (0,2 mg/mL) nella cella di flusso utilizzando una siringa manualmente e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Quindi pompa blocco buffer10 nella cella di flusso per sostituire streptavidina e tenerlo a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. singola molecola Visualization
<ol><li>Ottenere l'allineamento focale del rosso e da' con A5 sulla prova di microscopio di fluorescenza #1 eccitazione simultanea utilizzando un laser a 532 nm e laser 640 nm. Produrre immagini di doppia lunghezza d'onda con la scissione ottica (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Posizionare la cella di flusso sul microscopio e collegare il tubo di uscita per un più lungo collegamento tubazione con una molla di 10ml installata su una pompa di infusione/ritiro automatici programmabili. Nota: Pompaggio buffer nella cella di flusso indicato di seguito significa ritirare buffer dal tubo di ingresso della cella di flusso alla siringa.</li>
	<li>Pompa tampone bloccante a 500 µ l/min nella cella di flusso per rimuovere rapidamente l'aria e garantire che il buffer nella cella di flusso è sbloccato. Pompare il tampone bloccante a 200 µ l/min nella cella di flusso, quindi capovolgere il tubo di uscita per rimuovere le bolle d'aria dal tubo di aspirazione e la cella di flusso accuratamente. Nota: Tutti i buffer pompati nella cella di flusso dovrebbero essere degassificati in un essiccatore sotto vuoto per almeno 15 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 µ l di DNA λ-ARS317 biotinilati in 80 µ l di tampone bloccante e pompa in cella di flusso a 25 µ l/min per 2 min. Quindi sciacquare λ-ARS317 DNA utilizzando 200 µ l di tampone bloccante ad un tasso di 50 µ l/min.</li>
	<li>200 µ l di binding buffer10 ad un tasso di 50 µ l/min per rimuovere il tampone bloccante nella cella di flusso della pompa.</li>
	<li>Aggiungere 0,2 µ l di rivestite con streptavidina Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l di biotinylated ORC (1,2 µM) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 20 µ l di binding buffer nel tubo, quindi posizionarlo sul ghiaccio. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di circa 10 nM.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l di DTT (100 mM), 1 µ l di ATP (200 mM) in 96 µ l di tampone di associazione. La concentrazione finale di ORC-Qdot705 è di 0,2 nM.</li>
	<li>Nella cella di flusso della pompa 20 µ l di 0,2 nM ORC-Qdot705 al tasso di 10 µ l/min. Scovare di eccessiva ORC-Qdot705 utilizzando 200 µ l di tampone di associazione al ritmo di 100 µ l/min. Quindi pompa buffer obbligatorio con 30 nM SYTOX arancio nella cella di flusso a macchiare substrati DNA ad un tasso di 100 µ l/min.</li>
	<li>Eccitare il segnale di705 ORC-Qdot e SYTOX arancio macchiato segnale di DNA utilizzando un laser di 405 nm e 532 nm laser, rispettivamente. Osservare i segnali simultaneamente con 100 µ l/min flusso utilizzando un filtro passabanda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e registrare le immagini di EM-CCD con 100 ms per ogni frame. Raccogliere 20 serie di immagini provenienti da diversi campi.</li>
</ol>6. analisi dei dati
<ol><li>Ritaglia le immagini usando il software di Fiji con un nuovo plugin, che viene modificato da noi stessi basate sul plugin Image (OI_cut_RGBmerge) sviluppato da laboratorio di Dr. Ron Vale presso University of California, San Francisco.<ol>
<li>Ritagliare una pila di immagini (512 × 512 pixel) in due pile di immagini (256 × 256 pixel). Uno è un 532 nm laser risultato entusiasmante, e l'altro è un 405 nanometro laser risultato entusiasmante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Processo di 61 immagini sequenziali utilizzando Fiji-immagine-pile-Z project (intensità media).</li>
	<li>Misura la lunghezza del DNA (LDNA) e la distanza dal sito di ORC-Qdot705 (LORC) associazione il DNA al DNA legato fine manualmente.</li>
	<li>Calcolare il risultato della LORC/lDNA utilizzando excel, analizzare i dati utilizzando il metodo bootstrap di R, quindi creare l'istogramma e distribuzioni gaussiane in forma.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+modification+of+&#955;-DNA+substrates+for+single-molecule+studies.">Efficient modification of &#955;-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo per osservare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate utilizzando il TIRFM in una cella di flusso. I passi necessari sono site-specific modificazione del substrato di DNA, DNA biotinylation, pulizia vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, preparazione di cella di flusso e imaging singola molecola. Ci sono due punti chiave che dovrebbero essere notati. Innanzitutto, tutti i passaggi con λ DNA devono essere manipolati delicatamente per ridurre even...

Interazioni tra DNA e proteine sono essenziali per molti processi biologici complessi, come ad esempio la replicazione del DNA, riparazione del DNA e trascrizione. Anche se gli approcci convenzionali hanno fatto luce sulle proprietà di questi processi, molti meccanismi chiave sono ancora poco chiare. Recentemente, con le tecniche di singola molecola in rapido sviluppo, alcuni dei meccanismi sono stati indirizzati1,2,3.
L'applicazione di microscopia di fluorescenza di singola molecola sulla visualizzazione interazioni proteina-DNA in tempo reale principalmente dipende dallo sviluppo di rilevazione della fluorescenza e sonde fluorescenti. Per uno studio di singola molecola, è importante etichettare la proteina di interesse con una sonda fluorescente adatta poiché sistemi di rilevazione di fluorescenza per la maggior parte sono commercialmente disponibili.
Le proteine fluorescenti sono comunemente usate in biologia molecolare. Tuttavia, la bassa luminosità fluorescente e la stabilità contro photobleaching limitarne l'applicazione in molti saggi di singola molecola. Punti quantici (QDot) sono piccoli emettitori di luce nanoparticelle4. A causa di loro proprietà ottiche uniche, QDot sono 10 - 20 volte più luminoso e diverse migliaia di volte più stabile di ampiamente usato organici coloranti5. Inoltre, QDot hanno un grande Stokes shift (la differenza tra la posizione dei picchi di eccitazione e di emissione)5. Così, QDot può essere utilizzato per l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini con alti rapporti segnale-rumore, mentre essi non possono essere utilizzati in analisi quantitative.
Ad oggi, ci sono due approcci per etichettare una proteina bersaglio con QDot site-specifically: etichettatura con l'ausilio di anticorpi primari o secondari coniugati Qdot6,7,8; o etichettatura la proteina bersaglio con QDot direttamente, che si basa sull'interazione forte tra biotina e streptavidina9,10,11,12,13. Rivestite con streptavidina QDot sono disponibili in commercio. Nel nostro recente studio, site-specifically proteine biotinilate in lievito ad alta efficienza sono stati purificati dal co-sovraespressione di BirA e proteine etichettate Avi in vivo10. Segue e ottimizzando le analisi di singola molecola14,15,16,17, abbiamo osservato le interazioni tra DNA e proteine identificate Qdot a utilizzando il livello di singola molecola TIRFM10.
Qui, abbiamo scelto la gemmazione lievito origine riconoscimento complesso (ORC), che possa in particolare riconoscono e si legano alla sequenza autonomamente replica (ARS), come la proteina di interesse. Il seguente protocollo presenta una procedura dettagliata di visualizzare l'interazione di Qdot-labeled ORC con ARS utilizzando TIRFM. La preparazione del substrato DNA site-specifically modificato, la biotinilazione di DNA, la pulizia del vetrino coprioggetto e funzionalizzazione, l'Assemblea di cella di flusso e l'imaging di singola molecola sono descritti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

La microscopia di fluorescenza ha fatto grandi contributi nella dissezione dei meccanismi di complessi processi biologici a livello di singola molecola. Nelle analisi di singola molecola per lo studio delle interazioni DNA-proteina, ci sono due fattori importanti da considerare: il substrato di DNA con una lunghezza sufficiente per l'osservazione facile ed etichettatura una proteina con una sonda fluorescente adatta. 48,5 kb λ DNA è un buon candidato per il substrato del DNA. Punti quantici (QDot), come una classe di sonde fluorescenti, consentono l'osservazione da lungo tempo (minuti a ore) e acquisizione di immagini di alta qualità. In questa carta, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina a livello di singola molecola, che comprende preparando un λ site-specifically modificate del DNA e l'etichettatura di una proteina bersaglio con QDot rivestite con streptavidina. Per un proof of concept, scegliamo ORC (riconoscimento di origine complessa) nel lievito gemmante come una proteina di interesse e visualizzare la sua interazione con un ARS (sequenza autonomamente replica) utilizzando TIRFM. Rispetto ad altre sonde fluorescenti, QDot hanno evidenti vantaggi negli studi di singola molecola a causa della sua elevata stabilità contro photobleaching, ma va notato che questa proprietà limita la sua applicazione in analisi quantitative.

Per visualizzare l'interazione tra Qdot-labeled ORC e l'ARS, abbiamo costruito il substrato di DNA λ-ARS317. Un frammento di DNA che contiene ARS317 è stato integrato in XhoI sito (33,5 kb) del DNA nativo λ di ricombinazione omologa (Figura 1A). Il prodotto di ricombinazione è stato confezionato usando gli estratti e le particelle dei fagi confezionati sono state coltivate su piastre LB (Figura 1B). La placca positiv...

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Visualizzare l'interazione tra la proteina Qdot-labeled e DNA λ site-specifically modificate a livello di singola molecola

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K Views.  Chinese Academy of Sciences. Qui, presentiamo un protocollo per studiare le interazioni della DNA-proteina mediante microscopia a fluorescenza riflessione interna totale (TIRFM) usando un substrato di DNA λ site-specifically modificate e un Quantum-dot etichettato proteine.

Video: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Ricerca

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...