我々 は博士・ ハサン ・ Yardimci に感謝し、種類のフランシスの Crick 研究所の Dr.Sevim Yardimci は、単一分子の実験博士ダニエル Duzdevich、コロンビア大学の博士エリック ・ グリーンの研究室から北京大学の博士タマ太陽との Chunlai ドクター有用な議論の清華大学。本研究は、国家自然科学基金、中国の 31371264、31401059、CA 学際的革新チームと、ニュートン高度な交わり (NA140085) 英国王立協会からによって支えられました。

1. λ ARS317 DNA 基板の作製
<ol><li>DNA 基板構成と包装形態<ol>
<li>Xhoを使用してネイティブ λ DNA を消化私酵素;新進の genomic DNA から ARS317 酵母 20 を含むプライマーを用いて 543 bp DNA フラグメント ベアリングを増幅する相同 bp 系列の上流と下流にXho私ラムダ DNA 上の酵素のサイト。追加 100 ng Xhoの λ DNA と 10 を消化され ng の DNA のフラグメントの相同組換え反応システムの 10 μ L と 30 分の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>再結合 λ DNA をパッケージ化、遺伝子組み替え品にラムダ包装エキスを 25 μ l 添加し、90 分の 30 ° C で反応を孵化させなさい。反応管にラムダ包装抽出物の追加 25 μ L を追加します。90 分の 30 ° C で反応をインキュベートし続けます。</li>
		<li>滅菌希釈バッファー (10 mM トリス-HCl (pH 8.3)、100 mM の NaCl、10 mM MgCl2) 500 μ L を反応システムに追加、チューブを数回上下に回して軽く混ぜます。クロロホルムを 25 μ l 添加、穏やかに混合し、4 ° C で保存</li>
		<li>パッケージ化されたバクテリオファージの 100 μ L と細菌 LE392MP の 100 μ L を追加 (養殖 0.8 - 1.0 10 mm MgSO4追加 LB 培地を使用して) 新しいチューブに。37 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>(LB 培地 + 0.7% 寒天 + 10 mM MgSO4、48 ° C に冷却) 4 mL oftop 寒天培地に菌ファージ混合物の 200 μ L を追加します。すぐにチューブを数回上下に回してミックスし、予め温めておいた (37 ° C) LB プレート上にそれを注ぐ。</li>
		<li>37 ° C でプレートを一晩インキュベート、λ ARS317 プラーク PCR を使用して、シーケンス処理の画面です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体の lysates11,18から DNA 基質浄化<ol>
<li>200 μ L の滅菌 ddH210 mm MgCl2 O と 10 nM CaCl2に 1 つのプラークを選択します。細菌 LE392MP の 200 μ L (LB 培地で培養一晩) で混合し、37 ° C、15 分インキュベートします。</li>
		<li>NZCYM の 100 mL に菌ファージ混合物を追加 (10 g/L 5 g/L、NZ アミン酵母エキス、5 グラム/L の NaCl、1 g/L カザミノ加水分解、2 g/L MgSO4·7H2O) 中、37 ° C で 7 h の文化文化にクロロホルムの 250 μ L を追加し、別の 10 分間振る。</li>
		<li>200 mL のフラスコに文化を転送します。NaCl (1 M 最終濃度) の 5.8 グラムを加えて、手で溶解する攪拌氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞の残骸を削除する 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機します。200 mL のフラスコに上澄みを収集し、10% PEG8000 (m/V) を追加します。磁気攪拌装置で溶解し、氷上で 30 分間以上インキュベートにかき混ぜます。</li>
		<li>バクテリオファージの沈殿物に 4 ° C で 10 分間の 12,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。</li>
		<li>2 mL のバクテリオファージ希釈バッファーで沈殿物を再懸濁します。15 mL チューブに転送し、10 μ L (終濃度が 20 μ G/ml) RNase の (最終濃度は 5 μ G/ml) DNase の 40 μ L を追加します。37 ° c 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>0.3 2 mL を加える M トリス-HCl (pH 9.0) 100 mM EDTA + 1.25 %sds、15 μ L プロティナーゼ K (最終濃度は 10 μ G/ml)。65 ° C で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>(3 M, pH 4.8)、予冷カリウム酢酸 2 mL を加えて 10 分間氷の上管を孵化させなさい。</li>
		<li>不溶性物質を削除する 4 ° C で 10 分間 8,000 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>培養上清をイソプロパノール 0.7 x 量を追加します。チューブを数回上下に回して混ぜるし、室温 (RT) で 2 分間インキュベートします。</li>
		<li>DNA を沈殿させる常温 10 分 8,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。</li>
		<li>70% エタノールで 8,000 x g で 10 分間の遠心分離では、上澄みを除去したら DNA を洗浄します。</li>
		<li>優しく、500 μ L TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を用いた DNA を溶出し、1.5 mL チューブに DNA を転送します。</li>
		<li>2 回/フェノールを用いる DNA を抽出: 8,000 g 10 分間遠心分離によってクロロホルム。</li>
		<li>0.7 x ボリューム イソプロパノールで沈殿させます。回して逆さま管優しく、ダウンし、8,000 × g 10 分間遠心分離機を混ぜます。</li>
		<li>70% エタノールで 1 回洗浄、TE の 200 μ L で再懸濁します。DNA 濃度を測定し、12.5 μ 因数で-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ ARS317 DNA ビオチン化
<ol><li>ビオチン標識オリゴヌクレオチドをリン酸化する (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ビオチン-3') ネイティブの左の終わりに補足 λ DNA のオリゴヌクレオチドを ddH2O、1 μ L のリガーゼ バッファー x 10 の 7.5 μ L、T4 PNK 0.5 μ の 1 μ L (100 μ M) を追加。3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 をリン酸化、λ ARS317 の 12.5 μ g、リガーゼ バッファー x 10 の 3 μ L を追加し、1 μ L の T4 PNK と ddH2O 30 μ L の総ボリュームには 3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドをアニールするには、リン酸化オリゴヌクレオチドの 0.5 μ L、ddH2O、リン酸化 λ ARS317 チューブ 10 × リガーゼ バッファーを 25 μ l 添加の 195 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、65 ° C 5 分ターン、ブロック ヒーターとブロックの 33 ° C 以下にサンプル クールなオフで孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドを縛ること T4 DNA リガーゼの 1 μ L と ATP (200 mM) の 0.63 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、一晩 2 時間または 4 ° C の室温で孵化させなさい。1 月に 4 ° C で保存します。 注: DNA を破損しないよう、すべての混合手順は優しくピペットを使用して混合ではなく、上下チューブを回すことによって行う必要があります。</li>
</ol>3. Coverslip のクリーニングと機能化
<ol><li>Coverslip クリーニング<ol>
<li>場所 20 coverslips 4 染色瓶 (5 coverslips/jar) には、エタノールに 30 分間超音波、純水 H2O 3 回と coverslips をすすいでください。</li>
		<li>1 M 水酸化カリウム (KOH) と 30 分間超音波、純水の H2O 3 回と coverslips をすすいでください。一度島の超音波処理とエタノールを繰り返します。</li>
		<li>30 分間、アセトンで超音波や超純水 H2O で徹底的に洗い流し (3 回以上)。 注: アセトン必要があります徹底的に洗浄によって除去する純水 H2O、有機溶剤 (アセトン) などが誤ってピラニア ソリューションと混合すると爆発を起こすかもしれないので14。</li>
		<li>ピラニア ソリューション、coverslips に配置 (H2の 3:1 の混合物など4と 30% H2O2) と 95 ° C 1 時間で孵化させなさい。 注: ピラニア ソリューションは非常にエネルギッシュで糜爛ので、注意してください。ピラニアのソリューションを準備しているとき 500 mL ガラス製ビーカーに最初 H2O2の 50 mL を追加し、だから H2の 150 mL を追加4ビーカーにゆっくりと。</li>
		<li>超純水 H2O coverslips 5 回をすすいでください。超純水 H2O 満ちている超純水 H2O 3 ビーカーを使用して徹底的に各 coverslip を洗浄し、乾燥 coverslip、カバーガラスの端から紙を使用します。染色瓶に、coverslip を置き、30 分間 110 ° C のオーブンで徹底的に coverslip を乾燥します。<ol>
<li>メタノール coverslip のリンスし、coverslip を徹底的に乾燥して 110 ° C のオーブンに染色の jar ファイルを配置します。 注: は、APTES は一度水19存在が可能な表面構造の多くを持っているので非常に重要です、coverslip を徹底的に乾燥します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip の機能化<ol>
<li>シラン溶液 70 mL を追加 (93% メタノールの酢酸、%、2% の 5 APTES) 各瓶にスクリュー キャップと一晩室温で jar を残します。</li>
		<li>3.1.5、乾燥オーブンでそれらを配置する代わりに窒素ガスを使用して徹底的に coverslips 以外の手順で説明するように、coverslips を乾燥を洗って。</li>
		<li>徹底的に 1 mL の 0.1 M フレッシュ製 NaHCO3 (pH 8.2) に 150 mg の mPEG (メトキシ - ポリエチレング リコール)、ビオチン ・ ペッグ (ビオチン - ポリエチレング リコール) の 6 mg を溶解します。17 歳の時、遠心分離機、不溶性のペグを削除する 1 分 000 x g。 注: たて NaHCO3準備ができています。その pH を調整する必要はありません。</li>
		<li>ボックスに、シラン処理 coverslips を置き、シラン処理 coverslips の両端の上部にある 2 つの小さな coverslips を置きます。シラン処理 coverslip の中心に PEG 溶液 100 μ L をピペット、上に別のシラン処理 coverslip を配置します。</li>
		<li>湿気、それを保つためにボックスにいくつか超純水 H2O を追加し、暗闇の中で、少なくとも 3 時間は止め釘の解決と coverslips を孵化させなさい。一晩インキュベートは同様に動作することができます。</li>
		<li>Coverslip のペアを区切るとを機能面を維持、リンス coverslips 超純水 H2O を頻繁に使用して窒素ガスで乾燥させる.</li>
		<li>マーカー ペン保持機能側フェイス アップ、ボックスにそれらを置くし、1 ヶ月間の真空デシケータでボックスを格納を使用してコーナーの 1 つに coverslips の官能の側をマークします。</li>
		<li>長い時間、coverslips を格納するには、そのキャップに 1 つの穴をドリル 50 mL のチューブに 1 つ coverslip の場所し、チューブをビニール袋に入れ、真空のシーラーを使用して袋をシールします。この方法で、coverslips 格納できます-20 ° C で約 3 カ月。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. フロー セル ・ アセンブリ
<ol><li>パンチャーを使用して両面テープ (30 mm × 12 mm) の部分の中央に 15 mm × 2 mm のチャンネルをカットします。</li>
	<li>紙側の両面テープをはがし、2 つの穴とスライド ガラスに貼り付けます。空気の泡を削除するキーを押します。我々 の経験に基づいて、用紙側両面テープのプラスチック面より剥離で空気の泡を削除する簡単です。</li>
	<li>官能 coverslip (60 mm × 24 mm) を切り 4 個 (30 mm × 12 mm) ダイヤモンドひっくり返されたガラスを使用して、スクライブし、窒素ガスを使用して残骸を取除きます。機能性を保つために覚えている側が立ち向かいます。</li>
	<li>両面テープのプラスチック面をはがし、官能の coverslip のスライドを貼り付けます。優しく、coverslip とテープの間の空気の泡を削除するキーを押します。徹底的に空気の泡を削除する一方、バッファーはそれに興奮した漏れからのフロー ・ セルを保護できます。</li>
	<li>それぞれ入口と出口の管を大小の穴に挿入します。エポキシを使用してチューブを修正します。</li>
	<li>手動で注射器を使用してフロー ・ セルにストレプトアビジン (0.2 mg/mL) の 20 μ L をポンプし、室温で 10 分間インキュベートします。フロー ・ セル、ストレプトアビジンを置き換えるためにポンプ ブロック バッファー10し部屋の温度でそれを維持します。</li>
</ol>5. 単一分子の可視化
<ol><li>532 nm レーザーと 640 nm のレーザーを使用した同時励起による蛍光顕微鏡テスト スライド #1 の A5 と遠赤の焦点の配置を取得します。(を参照してくださいテーブルの材料) の光学分割とデュアル波長画像を生成します。</li>
	<li>顕微鏡をフロー ・ セルを配置し、自動注入/撤退プログラム可能なポンプのインストール 10 mL 春と長いチューブ接続するそのアウトレット チューブを接続します。 注: は、フローセルのインレット チューブから注射器にバッファーを引き出す手段を下記のフロー ・ セルにバッファーをポンプします。</li>
	<li>500 μ L/分ですばやく空気を除去し、フローセル内のバッファーがブロックであることを確認するフロー ・ セルにブロック バッファーをポンプします。フロー ・ セルに 200 μ L/分でブロック バッファーをポンプし、徹底的にインレット チューブとフロー ・ セルから空気の泡を削除するアウトレット チューブを反転します。 メモ: フロー ・ セルに注入されるすべてのバッファーは真空デシケータで使用する前に、少なくとも 15 分間脱する必要があります。</li>
	<li>ブロック バッファーの 80 μ L にビオチン化 λ ARS317 DNA の 0.5 μ L を追加し、2 分の 25 μ L/分でフローセルにポンプします。50 μ L/分の速度で 200 μ L のブロック バッファーを用いた λ ARS317 DNA を洗い流し。</li>
	<li>ポンプのフロー ・ セルのブロック バッファーを削除する 50 μ L/分の速度でバッファー10をバインドを 200 μ l 添加します。</li>
	<li>ストレプトアビジン コーティングした Qdot705 (1 μ M) の 0.2 μ L を追加とビオチン化オークの 0.2 μ L (1.2 μ M)、チューブにし、5 分間室温でインキュベートします。チューブにバッファーをバインドの 20 μ L を追加し、氷の上に置きます。オークした Qdot705の最終濃度は約 10 nM。</li>
	<li>オークした Qdot705の 2 μ L を追加 (10 nM)、地デジ (100 mM) 1 μ L ATP (200 mM) の結合バッファーの 96 μ L に 1 μ L。オークした Qdot705の最終濃度が 0.2 nM。</li>
	<li>フロー ・ セルに 10 μ L/分の速度で 0.2 nM オークした Qdot705の 20 μ L をポンプします。過剰なオークした Qdot705を 100 μ L/分の速度で結合バッファーの 200 μ L を使用して洗い流します。30 nM SYTOX オレンジ色の結合バッファーを 100 μ L/分の速度で dna を染色するフロー ・ セルに、ポンプします。</li>
	<li>オークした Qdot705信号を興奮し、ステンド グラスの SYTOX オレンジ色 405 nm レーザーと 532 nm のレーザーをそれぞれ使用して DNA シグナル。クワッド バンド帯域通過フィルター (ff 01-446/510/581/703-25) を使用して 100 μ L/分の流量で、信号を同時に観測し、フレームあたりが 100 ms の EM CCD による画像を記録します。さまざまな分野から 20 の画像のスタックを収集します。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>カリフォルニア大学サンフランシスコ校博士ロン ベールのラボが開発したイメージのプラグイン (OI_cut_RGBmerge) に基づいた自分自身で変更する新しいプラグインにフィジーのソフトウェアを使用して画像をトリミング。<ol>
<li>画像 (256 × 256 ピクセル) の 2 つのスタックに画像 (512 × 512 ピクセル) のスタックをトリミングします。1 つは、532 nm レーザー刺激的な結果および他は、405 nm レーザー エキサイティングな結果。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィジー-イメージ-スタック-Z プロジェクト (平均強度) を用いた 61 映像を処理します。</li>
	<li>メジャー (LDNA) DNA と DNA のオークした Qdot705 (Lオーク) バインディングのサイトから DNA のまでの距離の長さは手動で終了を係留しました。</li>
	<li>Lオーク/LDNAの結果を計算するを使用して excel、r、ブートス トラップ法を用いたデータ分析、ヒストグラムを作成し、ガウス分布に適合。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase.">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria.">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li><li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots:+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors.">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots.">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62 (2014).</li><li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA.">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li><li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. 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著者が明らかに何もありません。

ここでは、した Qdot 標識タンパク質およびフロー セル内の観察を使用して site-specifically 変更された λ DNA 間の相互作用を観察するためのプロトコルを提案する.必要な手順には DNA 基板、ビオチン化 DNA、coverslip 洗浄し高機能化、フロー セル準備、および単一分子イメージング サイト固有の変更が含まれます。注意すべき 2 つの重要なポイントがあります。まず、すべての λ DNA と手順は、<em...

タンパク質と DNA の相互作用は、DNA 複製、DNA 修復および転写など、多くの複雑な生物学的プロセスに不可欠です。従来のアプローチは、これらのプロセスのプロパティに光を当てるが、多くの主なメカニズムはまだ明らかではありません。最近では、急速に成長の単一分子技術メカニズムのいくつかは対処1,2,3をされています。
主にリアルタイムで蛋白質 DNA 相互作用の視覚化の単一分子蛍光顕微鏡の応用は、蛍光検出蛍光プローブの開発に依存します。単一分子研究のため適切な蛍光プローブ蛍光検出システム、ほとんど商業的に利用可能なので興味の蛋白質にラベルすることが重要です。
蛍光タンパク質は、分子生物学の一般的使用されます。ただし、低蛍光輝度とフォトブリーチングに対する安定性は、多くの単一分子アッセイへの応用を制限します。量子ドット (Qdots) は、小さな発光ナノ粒子4。彼らのユニークな光学特性のため Qdots は 10-20 倍明るく、数千倍より安定したよりも広く使われている有機染料5。さらに、Qdots は大きなストークス シフト (励起と放射のピークの位置差)5にあります。したがって、彼らは定量的アッセイに利用することはできませんしながら Qdots を長年観察 (時間分) の高い信号対雑音比を持つ画像の取得使用できます。
日には、site-specifically Qdots と標的タンパク質をラベルに 2 つのアプローチがある: ラベリングした Qdot 共役のプライマリまたはセカンダリ抗体6,7,8; の助けを借りてやラベル、ターゲット蛋白質 Qdots と直接、ビオチンとストレプトアビジン9,10、11,12,13間の強い相互作用に基づいています。ストレプトアビジン コーティング Qdots 市販されています。最近の研究では、site-specifically 高効率で出芽酵母のビオチン化タンパク質により精製された・ ビラと avi ファイルのタグ付きタンパク質の過剰発現の co体内10。次一分子アッセイ14,15,16,17を最適化することで我々 は単一分子のレベルを使用した Qdot 標識タンパク質と DNA の相互作用を観察観察10。
ここで、我々 は出芽を選択興味の私達の蛋白質として原点認識複合体 (オーク) を具体的に認識して自律的に複製シーケンス (ARS) バインドできますの酵母。次のプロトコルは、観察を使用してアルスした Qdot というラベルの付いたオークの相互作用を視覚化するステップバイ ステップの手順を示します。Site-specifically 変更された DNA の基質、DNA ビオチン化、coverslip のクリーニングし機能化、フロー セル ・ アセンブリおよび単一分子イメージングの準備を説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3011</td>
			<td>Store 25 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-fusion cloning kit</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B22611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPlax Lambda 
			Packaging Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5110</td>
			<td>Bacterial strain LE392MP 
			is included in this package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10013092</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Beijing Chemical works</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any brand is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZ-amine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J853-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22090-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirring apparatus</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KMO2 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122151</td>
			<td>15 mL, sterile, bulk, 500pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R4875-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5319-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0706-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated primers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22266882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10009259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>80120891</td>
			<td>sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td>10011218</td>
			<td>30% Hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG 
			(methoxy-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-PEG 
			(biotin-polyethylene glycol)</td>
			<td>Lysan</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>IPC250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum sealer</td>
			<td>MAGIC SEAL</td>
			<td>WP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped glass scribe</td>
			<td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td>70036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing</td>
			<td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td>
			<td>BB31695-PE/4</td>
			<td>inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL620001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>LEAFTOP</td>
			<td>9005</td>
			<td>five minutes epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/withdrawal 
			programmable pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>70-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Sapphire-532-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS-640-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Imaging 
			splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics K.K.</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illumination system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX2-RFAEVA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#215;TIRF objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>APON60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-edge laser dichroic 
			beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di01-R405/488/ 
			532/635-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/ 
			581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF649-Di01-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET585/65m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET665lp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F36909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q10163MP</td>
			<td>Store at 4 &#186;C, do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0220-25G</td>
			<td>Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 &#956;L aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M109-5G</td>
			<td>Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 &#956;l aliquots at -20 &#186;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interaction between the qdot-labeled protein and site-specifically modified &#955; dna at the single molecule level

蛍光顕微鏡は、単一分子レベルでの複雑な生物学的過程のメカニズムを解剖に多大な貢献をしました。単一分子アッセイ DNA 蛋白質の相互作用を研究するため、検討のための 2 つの重要な要因がある: 十分な長さの簡単な観察と適切な蛍光プローブを用いたタンパク質を標識 DNA 基板。48.5 kb λ DNA は DNA の基質の良い候補です。量子ドット (Qdots)、蛍光プローブのクラスとして長年観察 (時間分) と高品質画像の取得を許可します。Site-specifically 変更された λ DNA を準備して、ラベリング、ストレプトアビジン コーティング Qdots と標的タンパク質など分子レベルで DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案します。コンセプトの証明、我々 興味の蛋白質として出芽酵母におけるオーク (原点認識複合体) を選択し、観察を使用して、アルス (自律的複製シーケンス) との相互作用を視覚化します。他の蛍光プローブと比較して、Qdots は退色、に対して高い安定性のための単一分子の研究で明白な利点を持っているが、定量的アッセイへの応用をこのプロパティに制限に注意してください。

初めてした Qdot というラベルの付いたオークと、アルスの相互作用を視覚化するには、λ ARS317 DNA 基板を構築します。ARS317 を含んでいる DNA のフラグメントは統合されたXhoに私は (図 1 a) の相同組み換えによるネイティブ λ DNA の (33.5 kb) をサイトします。遺伝子組み替え品はエキスを使用してパッケージ化され、パッケージ化されたバク?...

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Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

7.5K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

ビデオ: Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

単核レベルでのLINE-1レトロ転位の分析

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...