אנו להכיר בהכרת תודה מייקל, פרי יוטינג גואו למתן את ההליך ואת datasets טהור התרבות והקהילה בוצה מופעל, בהתאמה. אנו מודים נוספים קתרין Mörters לניתוח הדגימות הקהילה ביוגז. עבודה זו מומן על ידי אי Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe נ' (FNR, פרוייקט ביוגז-טביעות אצבעות Nr. 22008313) מטעם המשרד הפדרלי הגרמני עבור מזון, חקלאות (BMEL), התכנית חדשנות מרכזי עבור חברות קטנות ובינוניות (צים) של המשרד הפדרלי בכלכלה ואנרגיה (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), דויטשה Bundesstiftung Umwelt (DBU, פרוייקט לפי דרישה הפקה פון Phosphatdünger שעון Reststoffen פון Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך, (BMBF) (FZK 03XP0041G), ומחקר של העמותה הלמהולץ מונחה תוכנית מימון (POF השלישי R31 נושא 3 Bioenergy).

<ol>
	<li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems.">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).</li><li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments.">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).</li><li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Synthetic+and+Natural+Plastic+by+Microorganisms.">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied &amp; Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li><li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables.">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li><li>G&#252;nther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities:+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities.">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li><li>Lambrecht, J., Cichocki, N., H&#252;bschmann, T., Koch, C., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification,+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence.">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).</li><li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains,+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project.">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry.">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li><li>Koch, C., G&#252;nther, S., Desta, A. F., H&#252;bschmann, T., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function.">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li><li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding.">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li><li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+scale+coupling+of+picoplankton+community+structure+and+single-cell+heterotrophic+activity+in+winter+in+coastal+NW+Mediterranean+Sea+waters.">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li><li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment.">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462 (2016).</li><li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota.">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li><li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics.">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li><li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR.">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li><li>Koch, C., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics.">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li><li>Jahn, M., Vorpahl, C., H&#252;bschmann, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR.">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).</li><li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities.">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li><li>G&#252;nther, S., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning:+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning.">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li><li>Guo, Y., Baumgart, S., St&#228;rk, H. -. J., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level.">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).</li><li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+for+counting+natural+planktonic+bacteria+and+understanding+the+structure+of+planktonic+bacterial+communities.">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li><li>Gasol, J. M., Mor&#225;n, X. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Determination+of+Microbial+Abundances+and+Its+Use+to+Obtain+Indices+of+Community+Structure+and+Relative+Activity.">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li><li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+biodiversity+of+microbial+communities+by+flow+cytometry.">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li><li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation.">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li><li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting.">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li><li>Koch, C., Harnisch, F., Schr&#246;der, U., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprints:+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics.">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).</li><li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Roman&#237;, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+model+to+resolve+cytometric+microbial+community+patterns+in+flowing+waters:+Deconvolving+Cytometric+Microbial+Subgroups.">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li><li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -. M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization:+Flow+Cytometric+Fingerprinting.">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li><li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water.">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microbiota+flow+cytometry+reveals+dynamic+colitis-associated+changes+in+fecal+bacterial+composition:+Technical+comment.">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתוח מוצלח של אוכלוסיות חיידקים וקהילות דורש cytometers היטב, הבחירה המתאימה של התא בפרמטרים של זרימת עבודה אמינים הדגימה, קיבוע לכיוון להערכה מדידה ונתונים. הפרמטרים התא שנבחר חייבים להתרועע עם אורכי הגל עירור זמינים. אנחנו משתמשים וממליצים דאפי, אשר הוא מאוד רגיש בריכוזים נמוכים; אבל צריך להיות נרגש UV-לייזר, אשר לא מורכבת בדרך כלל ב- set-ups cytometer רגיל. צבעים אחרים, כגון SYBR ירוק אני, גם אוכלוסיות כל כתם או קהילות אבל בדרך כלל לספק החלטות נחות. לא מומלץ להשתמש דגים הליכים או בדיקות הכדאיות בקהילות מיקרוביאלי. הגישות הללו הן בלתי אפשרי לכמת, ודא ולשלוט בגלל השפעתם על מינים בודדים בקהילה אינו ברור. הם לא אמינה להיבדק, כל עוד חלק ניכר של הקהילות טיפוסי הוא עדיין לא זמין כתרבות טהור.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים שגרות דגימה וקיבוע, כמו גם מיון תא. יכול להיות מסובך הדגימה הנטייה של מסוימים טהור תרבויות וקהילות מיקרוביאלי צבירה כדי flocs או לדבוק חלקיקים של המטריקס מדגם. זה חיוני כדי להפיג אלה אגרגטים ולהפריד את התאים במדגם לפני להם היכרות עם ניתוח תזרים cytometric כדי להבטיח תוצאות אמינות. הפרוטוקולים הכנה הציג אופטימציה כדי לאפשר ניתוח תא בודד. סינון סופי 50 מיקרומטר מבוצע לפני המדידה כדי להסיר את כל אגרגטים שיורית ולמנוע הזרבובית מיקרומטר 70 של סדרן התא, cuvette את הזרימה של מנתח וסותם. תא flocs של שפכים הן שופע במיוחד, עמיד וחיוני לתפקוד של המערכת. . חקרנו את יצורי ומבוססות בוצה קהילות מיקרוביאלי במיכלים שונים של צמח טיפול בשפכים בהיקף מלא, כדי לבדוק את פרוטוקול הוקמה. את כל הטינופת ויוצרים תא אגרגטים היו בבירור התפוגג, הרכב הקהילה נותר יציב. יתר על כן, קהילות פלנקטוניים מבוססי בוצה הפגינו דמיון ראוי לציון ביניהם כל שלושה טנקים שנדגמו (איור 8, הקבצים המשלימים 1-S10). תוצאות אלה אומתו על ידי מטוסי אף-16 השוואתי rDNA אמפליקון רצף של טרי-, פורמלדהיד שטופלו-, הפורמלדהיד והאתנול מקובע-, ו מדגם ממוינים10. בכל זאת, באופן יוצא דופן מאתגר דגימות סביבתיים, כגון biofilms חזק או חיידקים הגדלים רשתות מחוברות בחוזקה, יכול להיות אפשרי להתפוגג. דגימות. אדמה יכול להיות בעייתי במיוחד, כפי החלקיקים בכל מקום מופיעים ההיסטוגרמה, ניתן להסתיר את התאים על ידי השפע העצום. במקרים כאלה, שיטות מסורתיות רצף צריכים להיות מיושמים.
היציבות קיבוע של כל ערכה מדגם חדש צריך להיבדק לפני שתעצב את הניסוי כדי להבטיח תוצאה תוקפו. קיבוע טוב יציבות גם מאפשר את במאגר מכתים ומדידה של נקודות זמן דגימה מרובות ביום אחד. הוא מאפשר יתרה מזאת שכפול ומדידות, מיון תא רטרוספקטיבה של נקודות זמן מכריע לאחר סיכום והערכה הסופי של הניסוי. היציבות קיבוע של התרבות טהור אומתה במשך 28 ימים (איור 9). לניסויים באתר כולל הובלה מדגם, יציבות קיבוע צריך להיבדק על פני תקופות ארוכות יותר (במקרה זה, 60 ימים עבור הקהילה בוצה מופעל, 195 ימים עבור הקהילה ביוגז, הקבצים המשלימים 1-S9).
ההכתמה היא בדרך כלל לא בעייתית אבל צריך להיות נשלט עם תקן ביולוגי כדי לאפשר יישום של כלי הערכה של bioinformatic. השתמשנו המתח מדומה e. coli BL21 (DE3), אשר היה מקובעים לפי הפרוטוקול עולה, ואמצעי לשימוש אצוה מוכתמים.
מלבד דאפי, SYBR Green אני יושם בהצלחה כדי לפתור קהילות חיידקים במשך מספר שנים14,23,24,25,26. SYBR Green יכול לפתור קהילות לערכות חומצת גרעין - גבוה ונמוך (HNA ומגבר קדם) באמצעות תאים חיים ב מודוס באינטרנט. דאפי, אולם באופן שלה מחייב דנ א ספציפי יותר, מאפשר את ההבחנה subcommunities מעל 50 בערכת דוגמא אחת אלא דורש שלב קיבוע לפני צביעת.
מיון תא תכונה יוצאת דופן של גישה זו, יכול להיות מיושם אם subcommunities מסוימים אינם עניין נוסף. זה צריך להדגיש כי גם מחברים-(מתבצעות רק 30 דקות) ולא טיפול אתנול או דאפי מכתים10 היה השפעה שלילית על הרצף אמפליקון 16 עוקבות. פוטנציאל ההשפעות של הקיבעון, צביעת הליכים אודות subcommunity metagenome ניתוחים עדיין צריך להיבדק.
הרבה מידע על פונקציות הקהילה ואת הדינמיקה המגמה ניתן להשיג עצמאית מן הגישה מיון כאשר מעורבים ושפור לפתור תכונות קהילתיות ברמת התא על-ידי התא וירטואלי, להתחבר תכונות אלה עם והאביוטיים פרמטרים.
לאחרונה, מספר של ביואינפורמטיקה הערכה כלים חדשים, כל שימושי עבור שניהם SYBR ירוק, ואני את הגישות דאפי, פותחו כדי לפתור תבניות הקהילה cytometric. . אלו FlowFP27, החבילות השתמשו במחקר זה (flowCHIC20, flowCyBar28), מודל deconvolution הקים עם מים מתוקים קהילות29 , כלי המשמש להפלות זנים על פי שלהם פיזיולוגיים מאפייני30. בנוסף, גיוון cytometric יכול להיות נחוש25 , יציבות אפילו מאפיינים של קהילות חיידקים יכולים לבוא עכשיו עם כלי מקוון10.
לפיכך, הזרימה cytometric ניתוחים יש יתרון עצום כשמדובר ראפיד הערכה של קהילות מיקרוביאלי, מתאמים פרמטר והאביוטיים אפשרי. עם זאת, קיימות עדיין מגבלות לשיטה. זה אין אפשרות להחיל באמת באינטרנט באמצעות הכלי flowCyBar, בשל ההליך הגדרת שער בסיס מנוסים. יתר על כן, הפיתוח של זרימה מחוייט, קל לשימוש cytometers במידה רבה מראש ההתפשטות של הגישה ניתוח זרימת microbiome cytometric. צעדים ראשונים בכיוון זה הם להתבצע28.
יישומים עתידיים של cytometry זרימה חיידקים יכולים להיות שנחזה ב אקולוגיה מיקרוביאלית, זה מאפשר בתדירות גבוהה ניטור בטווח של דור חיידקי פעמים, הוכח כי פרדיגמות אקולוגית הינם ישימים לנתונים cytometric5 ,10. השיטה היא מאוד שימושי עבור הקרנות שגרתית של סביבות טבעיות כמו הפקדים חובה שתיית מים שוויץ31. זה גם יכול להיות כלי רב ערך עבור יישומים רפואיים כמו האדם15 או בעלי חיים32 microbiome ההקרנה. בנוסף, ההתפתחויות האחרונות בביואינפורמטיקה עשוי לאפשר cytometry זרימה מיקרוביאלי להיות בחיישני אינטגרלי בפקדים תהליך של מערכות מיקרוביאלי מנוהלים. הקהילה מיקרוביאלי cytometry מספק גם כלי סינון למיון התא, אשר מאפשר רזולוציה גבוהה יותר חקירות גנומית של קהילה ספציפי קבוצות משנה.

מיקרואורגניזמים ממלאים תפקיד חיוני בהיבטים רבים של אדם חי. הם המניעים העיקריים-ביוטי של כוכבי הלכת פחמן, חנקן, זרחן, גופרית מחזורים1, מעשה משפיל2,3 , וכן סינתזה biocatalysts4 בתעשיות שונות, כגון טיפול בשפכים 5 או ביוטכנולוגיה6. הם גם מהווים את microbiome האנושית, אשר ישירות המשפיעים על בריאות האדם ואת חילוף החומרים7,8. לכן, המידע על מבנה, תפקוד, התנהגות דינמית של מיקרואורגניזמים, בתגובה סביבתם הקרובה, היא הכרחית, אם אנו שואפים להבין ולטפל מערכות אלו באופן מלא. הדור הבא רצף (הגדרות) היא טכנולוגיה הוקמה ליישוב מבנה ותפקוד microbiome9. עם זאת, ניתוח והערכה של הגדרות נתונים לא יכולה להניב מידע כמותי, הוא עדיין יקר, זמן רב, בהחלט לא מוכנה לספק תוצאות באתר בתוך מסדרונות ביצועים. חיידקים מסוימים מציגים דור פעמים להלן 1 h ולגרום ללא הרף הקהילה מבנים מסוימים סביבות10. בעקבות דינמיקה כזאת, שימוש בגישות רצף עולה על הקיבולת פיננסי, כוח העבודה של מעבדות ביותר.
לעומת זאת, cytometry זרימה יכול לספק טביעות הקהילה דומים לנתוני המיתרים, תוך שמירה על יעילות גבוהה יותר של הזמן-, העבודה - ועלות. כאן, אנו מציגים את הזרימה cytometric טכניקות מצליח לעקוב הקהילה מיקרוביאלי דינמיקה ב- line על רמת תא בודד. בניגוד המיתרים, cytometry זרימה אינו מספק פילוגנטי השתייכות או מידע על גנים פונקציונלי, אך מספק מספרי הטלפון הנייד כמותית. באמצעות cytometry זרימה, ניתן לפתור קהילות חיידקים לתוך subcommunities עם פיזור אור שונות ומאפייני קרינה פלואורסצנטית (פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) לספק אינדיקציות של גודל תא, צפיפות, בהתאמה). הגישה הציג מנצל בעיקר גודל התא -, DNA כמות מידע קשור הקשורות סוגי תאים מסוימים, מצבים פיזיולוגיים (צמיחה). תוכן ה-DNA הוא לכמת באמצעות UV-טמפרמנט 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (דאפי) צבע, אשר נקשר לאזורים עשירים A-T של ה-DNA, ניתן לפתור אפילו רמות כרומוזומליות שונות. על-ידי שילוב קרינה פלואורסצנטית דאפי FSC subcommunities יותר מ-50 יכול להיות מכובד, פיקוח על שינוי abundances זמן11. הווריאציות שפע subcommunity ישויך עם שינויים בסביבה מיקרו-סביבתי, כגון pH והמוצר titers12, עם פרמטרים הכללית, כגון מזג אוויר13,14, או במקרה של הבטן או רוק microbiomes עם טיפולים רפואיים מסוימים15. מתאמים אלה חושפים אחראי לתפקודים מסוים ברשת מטבולית של הקהילה כל מפתח subcommunities. Subcommunities מפתח שניתן ואז במיוחד קידום או ודוכאה על-ידי שינוי המיקרו-בסביבה או מיינת לשם רצף עוקבות15 או פרוטיאומיה מבנית החקירה16.
עם זאת, הקהילה מיקרוביאלי cytometry זרימה לא עדיין נרחב נוסדה במספר נמוכות למדי זרימת cytometric התקנים היכולים לפתרון אוכלוסיות חיידקים או קהילות כראוי. יתר על כן, חוסר ניסיון, הקהילה צינורות ניתוח והערכה נתונים יעיל עלולה להוות מכשול כניסה לחוקרים מול אתגרים ניתוח microbiome. הקמנו זרימות עבודה מקיפה כדי להתמודד עם בעיות אלה. כדי להמחיש את תחולת כללי, נביא אותם על שלוש קבוצות דוגמה למופת (קובץ משלים 1-S1), כלומר אני) תרבות טהור (PC) ליישומים ביוטכנולוגי גדל מוגדרים ברורים בינוני (Pseudomonas putida KT 2440- גלוקוז), ii) קהילה מעבדה מורכבים ברור בינוני (בוצה מופעל בקהילה (ASC) בשפכים סינתטי) ו- iii) קהילה המורכבים של סביבות טבעיות במטריצה צפוף (ביוגז בקהילה (לפנה ס) תחמיץ תירס).
מספר גורמים להשפיע על בחירת פרוטוקול עבור כל אחד ערכות דוגמת אלה. הקפאה עמוקה forgoes את השימוש בכימיקלים רעילים אבל בעיקר מוגבל סביבות מעבדה עקב השימוש של חנקן נוזלי עבור ציפוי הלם. אתנול עוקבות וייצוב פורמלדהיד קיבוע מאפשר נפח דגימה ללא צורך הכנה aliquot, הוכיחה להיות יציב לאורך זמן.. עם זאת, דגימות עשירים בחלבון כמו רוק אנושי15 ייתכן בעייתי, כי חלבון flocs, denaturized מאת הפורמלדהיד, עלול לגרום שלילי אות רעש יחסי. ייבוש מדגם יקח הזמן הרב ביותר (כ 1 ח סה כ) של ההליכים בהשוואה זו, אך ניתן לבצע באתר ללא כימיקלים רעילים. זה מניב כדורי יציב צינורות, אשר ניתן לשלוח בקלות ללא קירור או נוספים הזהירות הזארד. בנוסף, היו המון שיטות קיבוע חלופי המוצע11. אנו ממליצים לבחון את יציבות קיבוע של רזולוציה של פרוטוקולים שונים כאשר מציגים סט מדגם חדש.
. היינו שני cytometers זרימה שונים כדי לנתח את ערכות: i) מחקר מאוד מתוחכמת ויקרה, ממורכז סדרן התא ו- ii) של היישום התמקד ספסל העליון מנתח אשר מופיע מתאים יותר עבור יישום באתר5. ה לפנה ס נמדדה עם מנתח העליון הספסל, בעוד המחשב ואת ASC נמדדו עם סדרן התא. הניתוח של המדגם למופת שלוש הגדרת ההליכים שונים הנדרשים עבור אופטימיזציה הפארמצבטית, דוגמת יציבות ונוחות זרימת העבודה. פרוטוקול הבאים יציינו את המקטעים עבור שלוש מערכות שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:985px;" width="985">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Milli-Q system Synthesis A10</td>
			<td style="width:335px;">Merck, Darmstadt, (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioPak Ultrafiltration Cartridge</td>
			<td style="width:335px;">Merck, Darmstadt, (GER)</td>
			<td>CDUF BI0 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Legacy cell sorter</td>
			<td style="width:335px;">Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Innova 90C</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Innova 70C&#160;</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>488 nm, 400 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genesis MX488-500 STM OPS</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>488 nm, 400 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xcyte CY-355-150</td>
			<td style="width:335px;">Lumentum, Milpitas, California, USA</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>355 nm, 150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Photomultiplier tubes R928 and R3896</td>
			<td style="width:335px;">Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Summit 4.3 software</td>
			<td style="width:335px;">Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#181;m&#160; FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;">F8815</td>
			<td>350/440 blue fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m YG FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;">F-8827</td>
			<td>505/515 yellow-green fluorescent beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">0.5 &#956;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td>
			<td style="width:335px;">PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td>
			<td>18339</td>
			<td>360/407</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#956;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td>
			<td style="width:335px;">PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td>
			<td>17458</td>
			<td>360/407 blue fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#181;mYG FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td>F-13081</td>
			<td>505/515 yellow-green fluorescent beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td style="width:149px;">CAS no. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td style="width:149px;">CAS no. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyflow Space&#160;</td>
			<td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Laser Genesis CX,</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>355 nm, 150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H6779-32 series PMTs</td>
			<td style="width:335px;">Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FloMax software</td>
			<td style="width:335px;">Sysmex Partec GmbH, G&#246;rlitz, (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">all optical filters</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td>CAS no. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">KCl</td>
			<td style="width:335px;">Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td>
			<td align="right">6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo 10.0.8r1</td>
			<td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Build number: 42398</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">R-software v.3.4.3</td>
			<td>R Core Team</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">flowCHIC</td>
			<td colspan="2"><a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">flowCyBar</td>
			<td colspan="2"><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing microbiome dynamics &#8211; flow cytometry based workflows from pure cultures to natural communities

החקירה של תרבויות טהור וניטור של הקהילה מיקרוביאלי dynamics חיוני להבין ולשלוט הטבעיות ויישומים טכניים מונע על ידי מיקרואורגניזמים. הדור הבא רצפי שיטות מנוצלים נרחב לפתרון microbiomes, אך הם בדרך כלל משאבים וזמן אינטנסיבית ולספק בעיקר מידע איכותי. ניתוח תזרים cytometric microbiome לא סובל את החסרונות האלה, מספקים abundances subcommunity יחסית ולא אבסולוטית תא מספרים ב- line. למרות שזה אינו להעביר מידע פילוגנטי ישירה, זה יכול לשפר את עומק ניתוח והרזולוציה של רצף גישות. בניגוד חריף ליישומים רפואיים מחקר והן הגדרות שגרתית, cytometry זרימה עדיין לא משמש עבור ניתוח microbiome. מידע חסר בצינורות ניתוח והכנה נתונים לדוגמה עלולים ליצור מחסום כניסה של החוקרים בפני אתגרים ניתוח microbiome זה יהיה לעיתים קרובות יישומים cytometry זרימה לפי הספר. כאן, אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה על תרבויות טהור, מורכבות הקהילות נקה הקהילות בינוני ומורכבות מאתגרת מטריצות, בהתאמה. אנו מתארים דגימה בודדת ושגרות קיבוע, אופטימיזציה מכתים פרוטוקולים עבור ערכות מדגם בהתאמה. עלינו להרחיב את ניתוח cytometric עם מחקר מורכבות ממורכז, התקן העליון של ספסל ממוקד יישומים, לתאר את התא מיון הליך, מציע חבילות ניתוח נתונים. יתר על כן מציע פקדי ניסיוני חשוב ואנו חלות זרימות עבודה הציג את ערכות מדגם בהתאמה.

התוצאות הבאות נציג מדגישים את הצורך משכפל, להדגים טכניקות הדמיה וניתוח נתונים שונים על כל אחד שלוש ערכות הדגימה. הם מראים את התוצאות של צינורות הערכת הנתונים האפשריים מתאים לענות על שאלות מחקר רגיל אודות ערכת בהתאמה. עם זאת, טכניקות שהוצגו אינם בלעדיים על קבוצת מדגם שבו הם מוצגים עם. הנתונים הגולמיים של cytometry זרימה היה זמין בפומבי עם FlowRepository מזהה FR-FCM-ZY46. בעבר ASC הנתונים שהועלה זמין תחת מזהה FR-FCM-ZYD7.
ביולוגי, טכני משכפל היו לקחו, מוכן, נותחו על פי פרוטוקולים שפורסמו11. משכפל ביולוגי מן המחשב עולה לקוחים שלוש מבחנות מקבילים. משכפל הביולוגי של ה לפנה ס נלקחו בתור שלושה הבאים samplings במיקום אחד במפעל טייס סולם. Aliquots 3 מדגם אחד היו קבועים, צבעונית וניתח כדי להבטיח הפארמצבטית טכני. שיטות הפארמצבטית הוערך על-פי הנהלים שפורסמו בעבר11. תבנית שער עבור כל דוגמאות של קבוצת הדגימה אחד (קובץ משלים 1-S6) שימש לחישוב סטיית התקן (%) לפי שער.
עבור ה-PC, סטיית התקן מרבי של שפע היחסי היה 3.44%, בעוד סטיית התקן הממוצע היה 2.13% (איור 1). את עולה, ה לפנה ס, סטיות תקן מרבי של abundances היחסית היו 1.27% ו- 0.88%, בעוד הממוצעים של סטיות תקן היו 2.13% ו- 0.21% (קובץ משלים 1-S8).
הליך סטנדרטי, כאשר חוקר תרבות זן טהור, הוא הכנת עקומת גדילה לנתח שלב ההשהיה, דור פעמים וצפיפות תא תחת תנאים מסוימים. שילבנו בין הליך זה עם זרימה cytometric ניתוח זרימת העבודה כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של המערכת (איור 2). FSC לעומת דאפי פלורסצנטיות חלקות חושפים הברית מחזור התא של התרבות בנקודות שונות של התרבות אצווה. שער בסיס תבנית (קובץ משלים 1-S6) הוקמה כדי לכמת את הפרופורציה של תאים עם אחד (c1n), שני (c2n) ואת מספר כרומוזומים (cXn, איור 2B). היחס הדומיננטית של תאים חוסנו היה כרומוזום אחד בלבד (93.7% ב- 0 h). זה השתנה באופן דרסטי במהלך צמיחה אקספוננציאלית, שבו כמעט כל התאים הכיל יותר מפעם אחת (99.6%, 4 שעות) ו מעל חצי מהאוכלוסייה (53.1%) מכילה אפילו יותר משני כרומוזומים. זה מדגים putida פs היכולת לשכפל כרומוזומים שלה מהר יותר מאשר הזמן הדור שלה.
ניתוח תזרים cytometric הוכיח שימושי מאוד למעקב אחר ההתפתחות של קהילות מיקרוביאלי. זה יכול לעקוב אחר קהילה dynamics יותר יותר משאבים בשיטות מולקולריות אינטנסיבית5,10קרוב. אנו מודגש הדינמיקות האלה בסרט, זכתה סקירה כללית של המשמרות הקהילה בוצה מופעל לאורך זמן. כל אחת מהמסגרות שניה אחת מציגה את חלקת פלורסצנטיות FSC לעומת דאפי נקודת דגימה (2 הקבצים המשלימים). משמרת מאוד ברורים בין ביום 0 וביום 4 בעקבות הקמת קהילה לאחר יום 7. Subcommunities נוספים עלה ביום 21. הקמנו תבנית שער הבסיס (קובץ משלים 1-S6) שאיפשרה את ההערכה של דינמיקה מיקרוביאלי ברמה subcommunity. Subcommunities דומיננטי בשלבים שונים של הניסוי זוהו בבירור באמצעות הכלי CyBar (איור 3). שילוב עם חלוקת תדר abundances subcommunity יחסית עזרתי כדי לבחור שערים כי הם מעניינים (שינוי משמעותי בשפע מופעלות בנקודת הזמן מפתח) בר -קיימא (מעל 5% יחסית שפע) לצורך מיון נוסף ניתוח22.
יישומים ביוריאקטור בקנה מידה תעשייתי יכולה להתמודד עם פוטנציאל heterogeneities המרחבי בשל מגבלות עצבנות. הם נחשפים לעתים קרובות גם שינוי פרמטרים מבצעיים, כמו מסעה באיכות סינתטיים שאינם סובסטרטים. ה לפנה ס מייצג מערכת כזו, בדקנו בין יישובים שונים כור זרימה הכנס מונע באופן דינמי. FSC לעומת דאפי קרינה פלואורסצנטית (איור 4) של הצבע לנקודות הדגימה למופת מראים רק קצת המרחבי, אך בולטת הטרוגניות טמפורלית. ה לפנה ס נחקר עוד יותר באמצעות שניהם, את שיק אוטומטי מהיר ובתבנית שער בסיס מעמיק יותר מבוסס גישה CyBar.
טבעו אוטומטי מהיר, לא משוחד, הופך את שיק מעניין במיוחד לשליטה באתר של bioprocesses בסביבה תעשייתית. זה משווה raw .fcs הנתונים של כל הדגימות זמינים. שתי השוואות אלה מוצגים באיור5. הערכים dissimilarity הנוצרים אשר התצפיות הקודמות בדבר יכולות הטרוגניות. את טופס חלקות שנוצר NMDS המטריקס dissimilarity כלים שיק (איור 6) נוסף ממחיש תוצאה זו, מדמיין אותו בהתאם.
בנוסף, אנו לחשב את abundances היחסית של 23 subcommunities של ה לפנה ס באמצעות תבנית שער הבסיס (הקבצים המשלימים S6-1). ניתוח המתאם של 48 דגימות תקופה שנה נערך להבין יחסים פונקציונליים בקהילה מיקרוביאלי. זה יכול לעזור לזהות את שערי הריבית עבור חקירה נוספת (מיון תא 4). מתאמים חיוביים או שליליים חזק עם פרמטרים והאביוטיים כמו מוצר titers יכול לעזור כדי להבין ולמטב את מערכות אקולוגיות ותהליכים הביו-טכנולוגיה. קצב הטעינה אורגנית כלול המתאם הזה (איור 7) מדגימה כזו פרמטר והאביוטיים. G5, G4 ו- G10 התערוכה מתאמים חיוביים חזק, עלולים להכיל ואולי מינים fermentative, ואילו קורלציה שלילית ב- G8 אולי רמז לכיוון methanogenic ארכאונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> איור 1: הפארמצבטית של ניתוח cytometric של התרבות טהור. קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות עם חרוזים שליטה (A, B) ובר חלקות abundances 3 subcommunity [%] עם קווי שגיאה המייצג ± סטיית תקן אחת (C, D). Abundances יחסית היו נחושים עם התבנית שער שמוצג הקבצים המשלימים 1-S6. שלושה משכפל ביולוגי A, B ו- C צולמו של עקומת גדילה-4 שעות שלושה טכני ושכפול של P1, P2, P3 מוכנים מדגם א ומדד שלוש פעמים, בהתאמה: M1, M2, M3, ניתנות עם סטיות תקן המתאימים שלהם. אירועים 50,000 נרשמו בשער התא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> איור 2: ניתוח מחזור התא של התרבות טהור שצולמו במהלך עקומת גדילה הניסוי מעל 12 ה (א). קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות של samplings bi-מדי שעה כי התערוכה משמרת של תוכן ה-DNA במהלך שלב הגידול המעריכי. סדרה זו המידה אינו כולל חרוזים (ראה קובץ משלים 1-S3). (B). עקומת צמיחה מבוססי צפיפות אופטית עם קווי שגיאה המייצגים ± סטיית תקן אחת abundances יחסית ב subcommunities לאורך זמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> איור 3: האבולוציה של המבנה הקהילתי בוצה מופעל במשך 24 ימים. (א) flowCyBar עם בשכבת-על הפצות תדירות דמיינו ב boxplots על השערים בודדים המסודרים לפי דמיון של המגמות, המתאימה צבע מפתח (B) וניתוח דמיון של שנינות העלילה NMDS R < 0.001 ( C). החלקות כבסיס מוצגים ברצף הסרטים 2 הקבצים המשלימים. Abundances יחסית היו נחושים באמצעות התבנית שער ב קובץ משלים 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> איור 4: הטרוגניות יכולות של מבנה הקהילה מיקרוביאלי בקנה מידה תעשייתי חבר זרימה ביוגז הכור. דגימה (א') ההשוואה של המבנה הקהילתי מיקרוביאלית של הארבע יציאות I-IV ביום 223. II (B) ההשוואה הקהילה תלוי זמן מבנה וריאציות מיום 0 ליום 384 בנמל. הרעש הופסק במיומנותו כדי לשפר את הפריט החזותי. אירועים 250,000 נמדדו בשער תא (הקבצים המשלימים S6-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> איור 5: השוואה תמונה היסטוגרמה Cytometric — שיק- העיקרון של האלגוריתם שיק הוא דוגמה על-ידי השוואת שני המדגמים המייצגים את יכולות הטרוגניות, בהתאמה. (i) תמונות שיק נוצרים מקבצים .fcs לאחר בחירת שני פרמטרים כדי להציג (FSC לעומת דאפי זריחה). סולם גוני אפור (0-255) קודים הרוזן אירוע פיקסל. (ii) שיק קבוצות משנה נוצרים לאחר ציון אזור המכיל תאים (כאן: 200 < x < 4000, 200 < < 2200 y). (iii) XOR שילוב התמונה נוצר על-ידי השוואת פיקסלים בין קבוצות משנה. אין הבדל שווה ל- 0 ומוצגת כשחור. ההפרש המרבי שווה 200 ומוצגת לבן. ערך XOR המתאים מחושבת על-ידי הוספת הערכים גווני אפור של כל הפיקסלים בתמונה XOR. (iv) שכבת-על שילוב התמונה נוצר על-ידי הוספת הערכים סולם גוני אפור של הפיקסלים של ערכות המשנה. ערך כיסוי המתאים מחושבת על ידי ספירת הפיקסלים של התמונה כיסוי לא להיות שווה לאפס, ולכן מכילים מידע. (v) dissimilarity ערכים מחושבים על-ידי חלוקת XOR וערכי שכבת-. אלה הם הבסיס העלילה NMDS איור6. הערכים dissimilarity והן את המופע מגרש NMDS זניח מרחבית- והטרוגניות בולטת קהילה טמפורלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> איור 6: שיק המבוסס על דמיון ניתוח של הדגימות הקהילה ביוגז. המדגם 0-יום לא נכללו זו עלילה בשל מבנהו שונה מאוד הקהילה לעוות את הניתוח (הקבצים המשלימים S11-1). העלילה NMDS מאשרת את ההנחה על מרחבי נמוך- והטרוגניות גבוהה יותר טמפורלית עשה שימוש בכלי שיק והסביר באיור5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> איור 7: ניתוח המתאם על הקהילה ביוגז. המטריקס מחושב באמצעות מקדם ספירמן נמצא מנת לדרג והיא מבוססת על abundances היחסית של subcommunities 23 שנקבעו עם התבנית שער הבסיס של קובץ משלים 1-S6. הם היו בקורלציה עם קצב הטעינה אורגני (OLR) עבור דגימות 48 מתוך תקופה של שנה אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> איור 8: ניתוח דמיון פלנקטוניים (P) ובוצות המבוסס על הקהילות (S) בשפכים. הדגימות נלקחו מן הראשית clarifier (PCL), הופעל בוצה באגן (AS) digester טנק (DT) של צמח טיפול בשפכים בהיקף מלא (נקודה מגרשים הקבצים המשלימים 1-S10). Abundances יחסית היו נחושים באמצעות התבנית שער שמוצג הקבצים המשלימים 1-S6. Abundances subcommunity אלה נותחו גם בעזרת הכלי flowCyBar מנת ליצור CyBar (קובץ משלים 1-S10) NMDS עלילה (R < 0.01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> איור 9: יציבות קיבוע של התרבות טהור. דגימות הניסוי עקומת גדילה שצולמו או אוחסנו במשך 28 ימים ב- 80 ° C לאחר קיבוע גליצרול 15%. קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות עם שליטה חרוזים מוצגים. סדרת מדידות אינו כולל חרוזים (קובץ משלים 1-S3). אירועים 50,000 נרשמו בשער תא (הקבצים המשלימים S6-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
קובץ משלים 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Microbiome Dynamics Ã¢â‚¬â€œ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities at JoVE.com

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

ניתוח תזרים cytometric הוכיח יקר עבור חוקרים תרבויות טהור וניטור dynamics הקהילה מיקרוביאלי. אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה, מן הדגימה כדי ניתוח נתונים, עבור טהור תרבויות וקהילות מורכבים כמו גם ברורה בינוני כמו מטריצות מאתגר, בהתאמה.

אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

11.8K Views.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ. ניתוח תזרים cytometric הוכיח יקר עבור חוקרים תרבויות טהור וניטור dynamics הקהילה מיקרוביאלי. אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה, מן הדגימה כדי ניתוח נתונים, עבור טהור תרבויות וקהילות מורכבים כמו גם ברורה בינוני כמו מטריצות מאתגר, בהתאמה.

Video: Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Helminth Collection and Identification from Wildlife

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), &#34;thorny-headed worms&#34; (acanthocephalans), &#34;flukes&#34; (trematodes), and &#34;tapeworms&#34; (cestodes). The optimum method for collecting helminths is to examine a host that has been dead less than 4-6 hr since most helminths will still be alive. A thorough necropsy should be conducted and all major organs examined. Organs are washed over a 106 &#956;m sieve under running water and contents examined under a stereo microscope. All helminths are counted and a representative number are fixed (either in 70% ethanol, 10% buffered formalin, or alcohol-formalin-acetic acid). For species identification, helminths are either cleared in lactophenol (nematodes and small acanthocephalans) or stained (trematodes, cestodes, and large acanthocephalans) using Harris&#39; hematoxylin or Semichon&#39;s carmine. Helminths are keyed to species by examining different structures (e.g. male spicules in nematodes or the rostellum in cestodes). The protocols outlined here can be applied to any vertebrate animal. They require some expertise on recognizing the different organs and being able to differentiate helminths from other tissue debris or gut contents. Collection, preservation, and staining are straightforward techniques that require minimal equipment and reagents. Taxonomic identification, especially to species, can be very time consuming and might require the submission of specimens to an expert or DNA analysis.

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths.&#160; The four major types of helminths are &#8220;roundworms&#8221; (nematodes), &#8220;thorny-headed worms&#8221; (acanthocephalans), &#8220;flukes&#8221; (trematodes), and &#8220;tapeworms&#8221; (cestodes).&#160; Here we describe how helminths are collected from a vertebrate animal and how they are preserved and taxonomically identified.&#160;

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to environmental changes and to finally reconstruct such changes. This is done by analyzing growth variations back in time and correlating various plant-specific parameters to (for example) temperature records. Integrating wood anatomical parameters in these analyses would strengthen reconstructions, even down to intra-annual resolution. We therefore present a protocol on how to sample, prepare, and analyze wooden specimen for common macroscopic analyses, but also for subsequent microscopic analyses. Furthermore we introduce a potential solution for analyzing digital images generated from common small and large specimens to support time-series analyses. The protocol presents the basic steps as they currently can be used. Beyond this, there is an ongoing need for the improvement of existing techniques, and development of new techniques, to record and quantify past and ongoing environmental processes. Traditional wood anatomical research needs to be expanded to include ecological information to this field of research. This would support dendro-scientists who intend to analyze new parameters and develop new methodologies to understand the short and long term effects of specific environmental factors on the anatomy of woody plants.

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

A Video Surveillance System to Monitor Breeding Colonies of Common Terns (Sterna Hirundo)

Many waterbird populations have faced declines over the last century, including the common tern (Sterna hirundo), a waterbird species with a widespread breeding distribution, that has been recently listed as endangered in some habitats of its range. Waterbird monitoring programs exist to track populations through time; however, some of the more intensive approaches require entering colonies and can be disruptive to nesting populations. This paper describes a protocol that utilizes a minimally invasive surveillance system to continuously monitor common tern nesting behavior in typical ground-nesting colonies. The video monitoring system utilizes wireless cameras focused on individual nests as well as over the colony as a whole, and allows for observation without entering the colony. The video system is powered with several 12 V car batteries that are continuously recharged using solar panels. Footage is recorded using a digital video recorder (DVR) connected to a hard drive, which can be replaced when full. The DVR may be placed outside of the colony to reduce disturbance. In this study, 3,624 h of footage recorded over 63 days in weather conditions ranging from 12.8 &#176;C to 35.0 &#176;C produced 3,006 h (83%) of usable behavioral data. The types of data retrieved from the recorded video can vary; we used it to detect external disturbances and measure nesting behavior during incubation. Although the protocol detailed here was designed for ground-nesting waterbirds, the principal system could easily be modified to accommodate alternative scenarios, such as colonial arboreal nesting species, making it widely applicable to a variety of research needs.

A Video Surveillance System to Monitor Breeding Colonies of Common Terns Sterna Hirundo

This paper describes a protocol that uses a remote video monitoring surveillance system to continuously monitor breeding colonies of ground-nesting waterbirds. The system includes five cameras monitoring individual nests and one camera monitoring the colony as a whole, and is powered by car batteries that are recharged via solar panels.

מערכת מעקב וידאו כדי לפקח גידול. המושבות של המנהיג נפוצות (Sterna Hirundo)

Many waterbird populations have faced declines over the last century, including the common tern (Sterna hirundo), a waterbird species with a widespread ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on fish populations. Adverse effects monitoring, utilizing biomarkers from the organismal to the molecular level, can be used to assess the cumulative effects on fishes and other organisms. Fish health has been used worldwide as an indicator of aquatic ecosystem health. The necropsy-based fish health assessment provides data on visible abnormalities and lesions, parasites, condition and organosomatic indices. These can be compared by site, season and sex, as well as temporally, to document change over time. Severity ratings can be assigned to various observations to calculate a fish health index for more quantitative assessment. A drawback of the necropsy-based assessment is that it is based on visual observations and condition factors, which are not as sensitive as tissue and subcellular biomarkers for sublethal effects. Additionally, it is rarely possible to identify causes or risk factors associated with observed abnormalities. So, for instance a raised lesion or "tumor" on the fins, lips or body surface may be a neoplasm. However, it could also be a response to a parasite, chronic inflammation or hyperplasia of normal cells in response to an irritant. Conversely, neoplasms, certain parasites, other infectious agents and many tissue changes are not visible and so may be underestimated. However, during the necropsy-based assessment, blood (plasma), tissues for histopathology (microscopic pathology), genomics and other molecular analyses, and otoliths for aging can be collected. These downstream analyses, together with geospatial analyses, habitat assessments, water quality and contaminant analyses can all be important in comprehensive ecosystem evaluations.

The health of wild fishes can be used as an indicator of aquatic ecosystem health. Necropsy-based fish health assessments provide documentation of visible lesions or abnormalities, data used to calculate condition indices as well as the opportunity to collect tissues for microscopic evaluation, gene expression and other more in-depth analyses.

הערכת הבריאות מבוסס necropsy דגים פראי

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

פרוטוקול Rhizobox ממוטבת כדי להמחיש צמיחה השורש והיענות לצרכי מזינים לשפות אחרות

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

שערוך אינדקס אזור העלה באמצעות שלוש שיטות נפרדות בדוכנים נשירים טהור

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

מדריך לריכוז התגובה בתדר מתחלפים של תאים דלק

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...