Biz minnetle Michael Jahn ve Yuting Guo yordam ve datasets saf kültür ve aktif çamur topluluk, sırasıyla sağlamak için kabul. Biz daha fazla Katrin Mörters Biyogaz toplum örnekleri analiz etmek için teşekkür ederim. Bu eser Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, proje Biyogaz-parmak izi Nr. 22008313) tarafından Alman Federal Bakanlığı adına gıda ve Tarım (BMEL), merkezi yenilik programı için KOBİ'lerin (ZIM) federal bakanlık için finanse edildi ekonomik işler ve enerji (BMWi) (INAR ABO'lar, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, proje isteğe bağlı cep von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve Araştırma (BMBF) (FZK 03XP0041G) ve Program odaklı Helmholtz Derneği'nin finansman (POF III R31 konu 3 Biyoenerji).

<ol>
	<li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems.">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).</li><li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments.">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).</li><li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Synthetic+and+Natural+Plastic+by+Microorganisms.">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied &amp; Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li><li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables.">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li><li>G&#252;nther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities:+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities.">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li><li>Lambrecht, J., Cichocki, N., H&#252;bschmann, T., Koch, C., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification,+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence.">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).</li><li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strains,+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project.">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry.">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li><li>Koch, C., G&#252;nther, S., Desta, A. F., H&#252;bschmann, T., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function.">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li><li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding.">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li><li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-time+scale+coupling+of+picoplankton+community+structure+and+single-cell+heterotrophic+activity+in+winter+in+coastal+NW+Mediterranean+Sea+waters.">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li><li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment.">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462 (2016).</li><li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota.">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li><li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics.">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li><li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR.">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li><li>Koch, C., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics.">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li><li>Jahn, M., Vorpahl, C., H&#252;bschmann, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR.">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).</li><li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities.">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li><li>G&#252;nther, S., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning:+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning.">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li><li>Guo, Y., Baumgart, S., St&#228;rk, H. -. J., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level.">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).</li><li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+for+counting+natural+planktonic+bacteria+and+understanding+the+structure+of+planktonic+bacterial+communities.">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li><li>Gasol, J. M., Mor&#225;n, X. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Determination+of+Microbial+Abundances+and+Its+Use+to+Obtain+Indices+of+Community+Structure+and+Relative+Activity.">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li><li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+biodiversity+of+microbial+communities+by+flow+cytometry.">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li><li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation.">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li><li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting.">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li><li>Koch, C., Harnisch, F., Schr&#246;der, U., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprints:+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics.">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).</li><li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Roman&#237;, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+model+to+resolve+cytometric+microbial+community+patterns+in+flowing+waters:+Deconvolving+Cytometric+Microbial+Subgroups.">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li><li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -. M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization:+Flow+Cytometric+Fingerprinting.">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li><li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water.">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microbiota+flow+cytometry+reveals+dynamic+colitis-associated+changes+in+fecal+bacterial+composition:+Technical+comment.">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrobiyal nüfus ve toplulukların başarılı bir analizini iyi ayarlanmış cytometers, hücre parametreleri uygun bir seçim ve örnekleme ve fiksasyon ölçüm ve veri değerlendirme doğru güvenilir bir iş akışı gerektirir. Seçili hücre parametreler kullanılabilir uyarma dalgaboyu ile eşi gerekir. Biz kullanmak ve çok düşük konsantrasyonlarda hassas DAPI öneririz; Ama bir UV-hangi genellikle standart sitometresi set-up oluşur değil lazer, heyecanlı gerekiyor. Diğer boya, SYBR gibi yeşil ben, aynı zamanda leke bütün nüfus veya topluluklar ama genellikle düşük kaliteli çözümler sunmak. Balık yordamlar veya canlılık testleri mikrobiyal topluluklarda kullanma önerilmez. Bu yaklaşımlar ölçmek, doğrulamak ve toplumda bireysel türler üzerindeki etkileri belirsiz olduğundan denetlemek imkansız. Tipik topluluklar önemli bir kısmı hala saf bir kültür olarak kullanılabilir olduğu sürece onlar güvenilir, sınanamıyor.
Kritik adımlar protokolündeki hücre sıralama yanı sıra, örnekleme ve fiksasyon yordamlar içerir. Örnekleme eğilimi bazı saf kültürler ve flocs için toplamak veya örnek matris parçacıklar için uygun mikrobiyal topluluklar tarafından karmaşık. Bu toplamları dağılımı ve güvenilir sonuçlar güvence altına almak için akış sitometrik çözümlemesi için giriş önce ayrı bir hücreler için gereklidir. Sunulan hazırlık protokolleri tek hücre Analizi etkinleştirmek için optimize. Son 50 µm filtrasyon daha önce herhangi bir kalıntı toplamları kaldırmak ve hücre sıralayıcısı 70 µm meme ve akış küvet Çözümleyicisinin tıkanma dan engellemek için ölçüm gerçekleştirilir. Hücre flocs gelen Atıksu arıtma tesisleri özellikle bol, sağlam ve sisteminin işlevi için çok önemli. Biz planktonik araştırdık ve çamur oluşturulmuş protokol test etmek için bir tam ölçekli Atıksu arıtma tesisi farklı tankları mikrobiyal topluluklarda dayalı. Toplamları açıkça harcanmış hücre şekillendirme çamur ve topluluk kompozisyon sabit kalmıştır. Ayrıca, planktonik ve çamur tabanlı toplulukların aralarındaki tüm üç örneklenen tank (Şekil 8, ek dosya 1-S10) olağanüstü benzerlik sergiledi. Bu sonuçlar bir formaldehit ve etanol fiksasyonlu karşılaştırmalı 16S rDNA amplicon sıralama, bir taze-, bir formaldehit tedavi-, tarafından doğrulanmadı-ve sıralanmış örnek10. Yine de, olağanüstü güçlü biyofilmler veya sıkıca bağlı zincirler içinde büyüyen bakteriler gibi çevre örnekleri zorlu dağıtmak mümkün olabilir. Her yerde parçacıklar histogram içinde görünür ve hücreleri tarafından dik bereket karanlık gibi toprak örnekleri özellikle sorunlu olabilir. Bu gibi durumlarda, geleneksel sıralama yöntemleri uygulanması gereken.
Her yeni örnek kümesi fiksasyon istikrar sonucu geçerliliği garanti için deney tasarlamadan önce test edilmelidir. İyi fiksasyon istikrar da havuza alınan boyama ve birden çok örnek zaman puan ölçümü tek bir günde sağlar. Ayrıca çoğaltma ölçümleri ve geriye dönük olarak hücre belirleyici zaman noktaları sonuç ve denemenin son değerlendirme sonra sıralama sağlar. Saf kültür fiksasyon kararlılığını 28 gün içinde (Şekil 9) doğrulandı. Örnek taşıma dahil olmak üzere yerinde deneyler için fiksasyon istikrar (Bu durumda, aktif çamur topluluk için 60 gün Biyogaz toplum, ek dosya 1-S9 için 195 gün) daha uzun süre üzerinde test edilmelidir.
Boyama genellikle sorunlu değil ama bioinformatic değerlendirme araçları izin vermek için biyolojik bir standart ile kontrol gerekmektedir. Biz sahte zorlanma E. coli BL21 kullanılan (DE3), hangi ASC protokole göre saplantısı ve boyama her toplu olarak kullanılmak üzere depolanmış.
DAPI, SYBR yeşil dışında ben başarılı bir şekilde birkaç yıl14,23,24,25,26mikrobiyal topluluklar gidermek için uygulanmıştır. SYBR yüksek ve düşük nükleik asit alt kümeleri (HNA ve LNA) topluluklar çözmek yeşil bir online modus canlı hücrelerde kullanma. DAPI, DNA için onun bağlamada daha belirlidir ve 50'den fazla subcommunities bir örnek küme ayrım sağlar ancak boyama önce bir fiksasyon adım gerektirir.
Hücre sıralama bu yaklaşımın dikkat çekici bir özelliği ve bazı subcommunities daha fazla ilgi varsa uygulanabilir. Bu ne PFA-(sadece 30 dk yapılır) ne de etanol tedavi veya10 boyama DAPI sonraki 16S amplicon sıralama üzerinde olumsuz bir etkisi olduğunu vurguladı gerekiyor. Potansiyel fiksasyonu etkiler ve subcommunity metagenome ilgili yordamlar boyama analizleri hala test edilmesi gerekir.
Topluluk işlevlerine ve eğilim dinamikleri hakkında bilgi bir sürü bağımsız sıralama yaklaşım toplumun özellikleri sanal bir hücre hücre düzeyinde çözümlemek ve bu özellikleri ile abiyotik bağlanmak Biyoinformatik araçlarını içeren ne zaman elde edilebilir parametreleri.
Son zamanlarda, bir dizi yeni Biyoinformatik değerlendirme aracı, her iki SYBR için tüm yararlı yeşil ben ve DAPI yaklaşımlar, sitometrik topluluk desenleri gidermek için geliştirilmiştir. Bunlar FlowFP27, paketleri bu çalışmada (flowCHIC20, flowCyBar28), tatlı su topluluklar29 ile kurulan bir deconvolution model ve suşların kendi fizyolojik göre ayrımcılık için kullanılan bir araç kullanılan özellikleri30. Ayrıca, sitometrik çeşitlilik kararlı25 olabilir ve mikrobiyal topluluklar hatta istikrar özelliklerini şimdi bir çevrimiçi araç10ile takip edilebilir.
Böylece, akış sitometrik analizleri mikrobiyal topluluklar ve olası abiyotik parametre korelasyon hızlı değerlendirilmesi konusunda büyük bir avantaj var. Ancak, hala yöntemine sınırlamalar vardır. Gerçekten online flowCyBar aracıyla nedeniyle deneyimli tabanlı kapı ayarı yordam uygulanamaz. Ayrıca, özel yapım, kullanımı kolay akışı cytometers gelişimi büyük ölçüde akış sitometrik microbiome analiz yaklaşımı yayılması ilerlemek. Bu yönde ilk adım üstlenmiş28vardır.
Mikrobiyal akış sitometresi gelecekteki uygulamalar mikrobiyal ekoloji, bakteri üretimi kez aralığında yüksek frekans izleme sağlar ve ekolojik paradigmalar sitometrik veri5 tabidir gösterilmiştir gibi öngörülen ,10. İsviçre31yılında zorunlu içme suyu denetimleri gibi doğal ortamlarının rutin izlemek için çok yararlı bir yöntemdir. Bu da insan15 veya hayvan32 microbiome tarama gibi tıbbi uygulamalar için değerli bir araç olabilir. Buna ek olarak, biyoinformatik son gelişmeleri işlem denetimleri, yönetilen mikrobiyal sistemlerinin ayrılmaz bir sensör olmak mikrobiyal akış sitometresi sağlayabilir. Mikrobiyal topluluk sitometresi da belirli topluluk alt kümeleri genomik araştırmalar daha yüksek çözünürlük sağlayan hücre sıralama, bir tarama aracı sağlar.

Mikroorganizmaların insan birçok yönden canlı hayati bir rol oynamaktadır. Onlar gezegen karbon, azot, fosfor ve kükürt döngüsü1ve2,3 aşağılayıcı yanı sıra4 Biyokatalizörler Atıksu arıtma tesisleri gibi çeşitli sektörlerde sentezleme olarak hareket ana biyotik sürücüleri vardır 5 ya da biyoteknoloji6. Onlar bile insan sağlığı ve metabolizma7,8doğrudan etkileyen insan microbiome oluşturmaktadır. Bu nedenle, yapı, fonksiyon ve yakın çevreleri, yanıt olarak mikroorganizmaların dinamik davranış hakkında bilgi, amacımız tam olarak anlamak ve bu sistemlerin manipüle etmek gereklidir. Yeni nesil (NGS) sıralama microbiome yapısı ve fonksiyonu9çözmek için kurulan teknoloji değildir. Ancak, analiz ve değerlendirme NGS veri Niceliksel bilgileri verim değil ve hala pahalı, zaman alıcı ve hiçbir şekilde performans koridorları içinde yerinde sonuçlar sağlamak hazır. Bazı bakteri üretimi kez 1 h ve sürekli değişen toplum yapıları bazı ortamlar10neden aşağıdaki görüntüler. Böyle dynamics sıralama yaklaşımları kullanarak en bilimsel labs mali ve iş gücü kapasitesi aşabilir.
Buna ek olarak, akış sitometresi daha yüksek bir zaman, işgücü ve maliyet verimliliği koruyarak topluluk parmak NGS veri için benzer sağlar. Burada, akış sitometrik teknikleri mikrobiyal topluluk dinamikleri,-line tek hücre düzeyde uygulayabilmek için mevcut. NGS, aksine akış sitometresi filogenetik ilişki veya bilgi fonksiyonel genler sağlamaz ancak nicel hücre sayıları sunar. Akış Sitometresi kullanılarak, mikrobiyal toplulukları içine subcommunities farklı ışık saçılım ve floresan özellikleri (hücre boyutu ve parçalı yapı, sırasıyla ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) sağlamak) ile çözülebilir. Sunulan yaklaşım ağırlıklı olarak hücre boyutu - kullanır ve DNA belirli hücre tipleri ve fizyolojik (büyüme) Birleşik ilişkili ilgili bilgileri tutar. DNA içeriği UV telaşlı 4', A-T zengin DNA bölgelerine bağlanır ve hatta farklı kromozom düzeyleri çözümlemek için 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) boya kullanarak sayılabilir. DAPI floresans ve FSC birleştirerek 50'den fazla subcommunities seçkin ve zenginliği saat11üzerinde değiştirmek için izlenir. Subcommunity bereket varyasyonları pH ve ürün titreleri gibi12, genel parametrelerini, hava13,14gibi veya bağırsak ya da tükürük ile mikro çevre çevresinde değişikliklerle ilişkili olabilir bazı tıbbi tedaviler15ile microbiomes. Bu korelasyonlar anahtar subcommunities sorumlu tüm toplumun metabolik ağdaki belirli işlevleri için ortaya koyuyor. Anahtar subcommunities daha sonra özellikle terfi veya çevredeki mikro-ortamları değiştirerek bastırılır veya sonraki sıralama15 veya proteomik soruşturma için16sıralanmış.
Ancak, mikrobiyal toplum akış sitometresi henüz yaygın olarak oldukça düşük sayıda akış sitometrik aygıtları mikrobiyal nüfus veya topluluklar düzgün çözme yeteneğine sahip olması nedeniyle kurulmuş değildir. Ayrıca, deneyim, topluluk analiz boru hatları ve etkili veri değerlendirme eksikliği microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için bir giriş bariyeri oluşturabilecek. Biz bu sorunları çözmek için kapsamlı iş akışları kurduk. Onların genel uygulanabilirliği göstermek için biz onları üç örnek örnek setlerinde (ek dosya 1-S1), yani ben sunacak) tanımlanmış net Orta (Pseudomonas putida KT 2440 üzerinde yetiştirilen biyoteknolojik uygulamaları için saf Kültür (PC) glikoz), II) net Orta (aktif çamur topluluğa (ASC) sentetik Atıksu) ve III karmaşık laboratuvar toplumda) yoğun matris (Biyogaz topluluğa (M.Ö.) Mısır Silaj) doğal ortamlarda karmaşık bir topluluktan.
Çeşitli faktörler her bu örnek kümeleri için protokol seçimi etkiler. Derin dondurucu zehirli kimyasalların kullanımı forgoes ama çoğunlukla kullanılması dolayısıyla laboratuvar ortamlarına şok buzlanma için sıvı azot sınırlıdır. Formaldehit istikrar ve sonraki etanol fiksasyon toplu örnekleme aliquot hazırlık için gerek kalmadan sağlar ve uzun sürelerle kararlı olduğu ispatlanmıştır. Ancak, protein flocs, denaturized formaldehit tarafından olumsuz sinyal-gürültü oranı neden olabilir çünkü insan tükürük15 gibi protein açısından zengin örnekleri sorunlu olabilir. Örnek kurutma yordamlar en zaman (yaklaşık toplam 1 h) Bu karşılaştırmada alacak ama sitesinde toksik kimyasallar olmadan yapılabilir. Soğutma veya ek tehlike önlemler kolayca gönderilebilir tüpler istikrarlı granül verimleri. Buna ek olarak, alternatif fiksasyon yöntemleri bol önerilen11olmuştur. Güçlü yeni örnek kümesi sokarken farklı protokolleri çözünürlük ve fiksasyon kararlılığını test etmek için tavsiye ederiz.
Biz iki farklı akış cytometers kümeleri olarak çözümlemeye: i) bir son derece karmaşık ve pahalı, araştırma hücre sıralayıcısı ve yerinde uygulama5için daha uygun görünen II) bir uygulama odaklı tezgah üst analizörü merkezli. PC ve ASC hücre sıralayıcısı ile ölçüldü iken M.Ö tezgah üst analyzer ile ölçüldü. Üç örnek örnek analizi en iyi duruma getirilmiş tekrarlanabilirlik, örnek istikrar ve iş akışı kolaylık sağlamak için gerekli farklı yordamlar ayarlar. Aşağıdaki protokol için üç farklı sistem bölümleri belirtir.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q system Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&amp;nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier tubes R928 and R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m&amp;nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 blue fluorescent</td></tr><tr><td>2 &amp;mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 blue fluorescent</td></tr><tr><td>1 &amp;micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&amp;nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&amp;ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Build number: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing microbiome dynamics &#8211; flow cytometry based workflows from pure cultures to natural communities

Saf kültürler incelenmesi ve mikrobiyal topluluk dinamiklerini izleme doğal ekosistemler ve teknik uygulamaları mikroorganizmalar tarafından tahrik anlama ve denetleme için çok önemlidir. Yeni nesil sıralama yöntemleri yaygın olarak microbiomes gidermek için kullanılmaktadır, ancak genellikle kaynak ve zaman yoğun ve çoğunlukla nitel bilgi sunmak. Akış sitometrik microbiome analiz bu dezavantajları zarar vermez ve göreli subcommunity zenginliği ve mutlak sağlayabilir hücre, satır numaraları. Her ne kadar doğrudan filogenetik bilgi teslim etmez, analiz derinliği ve çözünürlük yaklaşımlar sıralama, geliştirebilirsiniz. Araştırma ve rutin ayarları tıbbi uygulamalar keskin aksine, akış sitometresi microbiome analiz için hala yaygın olarak kullanılır. Örnek hazırlama ve veri analiz boru hatları üzerinde eksik bilgileri bir giriş engeli sık ders kitabı akış sitometresi uygulamaları olurdu microbiome analiz sorunlarla karşı karşıya araştırmacılar için oluşturabilir. Burada, biz üç kapsamlı iş akışları saf kültürler için mevcut, karmaşık topluluklarda zorlu matrisler, orta ve karmaşık topluluklarda sırasıyla temizleyin. Biz bireysel örnekleme ve fiksasyon yordamlar açıklar ve ilgili örnek kümeleri için protokolleri boyama en iyi duruma getirilmiş. Biz merkezli karmaşık bir araştırma ile sitometrik Analizi ve bir uygulama odaklı tezgah üst aygıt ayrıntılı yordam sıralama hücre tanımlamak ve veri analiz paketleri öneririz. Ayrıca önemli deneysel kontrolleri teklif ve sunulan iş akışları ilgili örnek kümeleri için geçerlidir.

Aşağıdaki temsilcisi sonuçlar çoğaltır gerekliliğini vurgulamak ve farklı veri görselleştirme ve analiz teknikleri her biri bu üç örnek Grup örnekler. Olası veri değerlendirme boru hatları sonuçlarını ilgili kümesi hakkında standart araştırma soruları yanıtlayan için uygun gösteriyorlar. Ancak, sunulan teknikleri ile sunulan örnek ayarlamak için özel değildir. Akış Sitometresi ham veri FlowRepository kimliği FR-FCM-ZY46 ile herkesin hazır hale getirilmiştir. Daha önce yüklenen ASC veri kimliği FR-FCM-ZYD7 altında kullanılabilir.
Biyolojik ve teknik çoğaltır alınan, kurumlara ve yayımlanmış protokolleri11göre analiz. PC ve ASC biyolojik çoğaltır üç paralel şişeler alınmıştır. Biyolojik çoğaltır, MÖ bir pilot ölçek bitki bir yerde üç sonraki örnekleme olarak alınmıştır. Üç aliquots bir örnek sabit, lekeli ve teknik tekrarlanabilirlik emin olmak için analiz. Yöntemleri tekrarlanabilirlik daha önce yayımlanmış yordamlar11göre değerlendirildi. Bir kapı şablonu bir örnek kümesi (ek dosya 1-S6) tüm örnekleri için kapı başına standart sapma (%) hesaplamak için kullanıldı.
Ortalama standart sapma %2.13 (Şekil 1) iken PC için göreli bereket maksimum standart sapması %3.44, oldu. Ortalamalar, standart sapmalar ve %2.13 %0,21 (ek dosya 1-S8) ASC ve BC için göreli zenginliği maksimum standart sapmalar %1,27 ve %0,88, bulunmuştur.
Standart bir prosedür, saf suşu kültür, soruşturma zaman lag faz, üretimi süreleri ve hücre yoğunluğu belirli koşullar altında analiz etmek için bir büyüme eğrisi hazırlıktır. Bu yordamı ile akış sitometrik analiz iş akışı sistemi (Şekil 2) daha derin bir anlayış elde etmek için birlikte. FSC vs DAPI floresans araziler toplu iş kültürünün farklı noktalarda kültür hücre döngüsü durumları ortaya koyuyor. Ana kapısı şablonu (ek dosya 1-S6) bir (c1n), hücre oranı ölçmek için kurulan iki (c2n) ve birden fazla kromozom (cXn, Şekil 2B). Baskın oran aşısını hücre tek bir kromozom (0 h % 93,7) vardı. Bu büyük ölçüde nerede neredeyse tüm hücreleri birden fazla (%99.6, 4 h) ve üzerinde (%53.1) nüfusun yarısının bile fazla iki kromozom bulunan üstel büyüme sırasında değişti. Bunu P. putidas, kromozomlar, oluşturma süresi daha hızlı çoğaltmak yeteneği göstermektedir.
Akış sitometrik çözümlemesi mikrobiyal toplumların evrimi izlemek için çok yararlı olmuştur. Topluluk dinamikleri çok daha yakın daha fazla kaynak yoğun moleküler Yöntemler5,10' dan takip edebilirsiniz. Biz bu dinamiklerin bir filmde vurgulanır ve aktif çamur topluluk vardiya zaman içinde genel bir bakış elde etti. Her bir saniyelik kare FSC vs DAPI floresans arsa bir örnek noktasının (ek dosya 2) gösterir. Gün 0 ve 4 gün arasındaki çok farklı bir kayma bir çekirdek topluluk kurum tarafından 7 gün sonra takip etti. Ek subcommunities gün 21 saat geldi. Mikrobiyal dynamics subcommunity düzeyde değerlendirilmesi etkin bir ana kapısı şablonu (ek dosya 1-S6) kurduk. Deneme, farklı evrelerinde baskın subcommunities açıkça CyBar alet (Şekil 3) kullanarak tespit edilmiştir. Göreli subcommunity zenginliği ilginç (bir anahtar saat ara tetiklenen bereket önemli değişiklik) çoğu gates seçmek için yardımcı oldu ve uygun frekans dağılımı ile birleştirerek (üzeri % 5 göreli bereket) sıralama ve daha fazla analiz22.
Endüstriyel ölçekte biyoreaktör uygulamaları potansiyel kayma heterogeneities ajitasyon sınırlamaları nedeniyle yüz olabilir. Onlar da sık sık değişiklikler sentetik olmayan yüzeylerde kalitesini gibi operasyonel parametreleri değişen maruz kalır. BC böyle bir sistem temsil eder ve bir dinamik olarak tahrik tak akış reaktör farklı yerlerde örneklemeyi. FSC vs DAPI floresans araziler (Şekil 4) örnek örnek noktaları sadece küçük kayma ama belirgin zamansal heterojenlik gösterir. M.Ö her iki kullanarak daha fazla soruşturma, hızlı otomatik şık ve daha derinlemesine ana kapısı şablon CyBar yaklaşım dayanmaktadır.
Otomatik, hızlı ve tarafsız doğası, yapar şık bioprocesses yerinde kontrolü için özellikle ilginç endüstriyel bir ortamda. Bu ham .fcs veri tüm kullanılabilir örnekleri karşılaştırır. Bu karşılaştırmalar iki Şekil 5' te görüntülenir. Sonuç dagilimini değerleri kayma ve temporal heterojenite ile ilgili önceki gözlemler onaylayın. NMDS araziler oluşturulan form şık araçları dagilimini matris (Şekil 6) daha fazla bu sonuç doğruluyor ve buna göre görüntüler.
Buna ek olarak, biz, bir ana kapısı (ek dosya 1-S6) şablonuyla MÖ 23 subcommunities göreli zenginliği hesaplanır. Bir yıllık süre 48 örnekleri bir korelasyon analizi mikrobiyal toplumda işlevsel ilişkiler anlamak için yapılmıştır. Bu kapıları (4 hücre sıralama) daha fazla araştırma yapılması için ilgi tanımlamak için yardımcı olabilir. Güçlü pozitif veya negatif korelasyon abiyotik parametrelerle titreleri anlamak ve ekosistemler ve biyoteknolojik işlemleri en iyi duruma getirmek için yardımcı olabilir ürün gibi. Bu korelasyon (Şekil 7) dahil organik yükleme hızı abiyotik bir parametre örneğidir. G5, G4 ve G10 güçlü pozitif korelasyon sergi ve G8 negatif korelasyon methanogenic Arkeler doğru İpucu süre muhtemelen fermantatif türler içerebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Şekil 1: saf kültür sitometrik analizin tekrarlanabilirlik. FSC vs DAPI floresans denetim boncuk (A, B) ile ve 3 subcommunity zenginliği [%] ve araziler bar ± bir standart sapma (C, D) temsil eden hata çubukları ile çizer. Göreli zenginliği ek dosya 1-S6 içinde gösterilen kapı şablonu ile belirlenmiştir. A, B ve C 4 s büyüme eğrisinin alınmıştır üç biyolojik çoğaltır ve üç teknik çoğaltır P1, P2, P3 örnek A'dan hazırlanmıştır ve ölçülen üç kez, sırasıyla: M1, M2, M3 ve ilgili standart sapmalarının ile verilir. 50.000 olaylar hücre kapısı kaydedildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Şekil 2: hücre döngüsü analizi bir büyüme eğrisi sırasında alınan saf kültür deneme üzerinde 12 h. (A). FSC vs DAPI floresans DNA içeriği bir kayması üstel büyüme aşamasında sergi bi-saat dağıtımları, çizer. Bu ölçüm dizi boncuk (bkz. ek dosya 1-S3) içermez. (B). ± bir standart sapma ve göreli zenginliği subcommunities zaman içinde temsil eden hata çubukları ile optik yoğunluk dayalı büyüme eğrisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Şekil 3: aktif çamur toplum yapısı 24 gün içinde evrimi. (A) sıklık dağılımları eğilimleri benzerlik tarafından düzenlenir bireysel giriş kapıları için öğretici boxplots görselleştirildiği overlaying ile flowCyBar, buna karşılık gelen renk anahtar (B) ve bir NMDS Arsa zekâ R benzerlik analizde < 0,001 () C). temel araziler ek dosya 2 film sırayla gösterilirler. Göreli zenginliği içinde ek dosya 1 - S6 kapısı şablonu kullanılarak belirlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Şekil 4: kayma ve temporal heterojen bir endüstriyel ölçekte mikrobiyal toplum yapısının akış Biyogaz reaktör takın. (A) dört mikrobiyal toplum yapısını karşılaştırılması örnekleme bağlantı noktaları ı-IV günde 223. (B) gün 384 Port için gün 0 saat bağımlı toplum yapısı varyasyonları karşılaştırılması II. Gürültü gecikmiş görselleştirme geliştirmek için kesildi. 250.000 olaylar hücre Kapısı (ek dosya 1-S6) ölçüldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Şekil 5: sitometrik çubuk grafik görüntü karşılaştırma — şık. ŞIK algoritması prensibi ile kayma ve temporal heterojenite, sırasıyla temsil eden iki örnek karşılaştırarak örneklenir. (i) şık görüntüleri .fcs dosyalarından (FSC vs DAPI floresan) görüntülemek için iki parametre seçtikten sonra oluşturulur. Gri tonlama (0-255) olay sayısı için bir piksel kodları. (ii) şık alt kümeleri hücreleri içeren alan belirttikten sonra oluşturulur (burada: 200 < < 4000, 200 x < < 2200 y). (iii) XOR kombinasyonu görüntü piksel alt kümeleri arasında karşılaştırma tarafından oluşturulur. Hiçbir fark 0'a eşit ve siyah olarak görüntülenir. En fazla farkı 200 eşittir ve beyaz gösterilir. Karşılık gelen XOR değerini XOR görüntüde gri ölçek değerleri tüm piksellerin ekleyerek hesaplanır. (iv) bindirme birlikte görüntüsünü alt kümeleri piksel gri tonlama değerleri ekleyerek oluşturulur. Karşılık gelen bindirme değerini sıfıra eşit olmayan ve bu nedenle bilgi içeren bir Bindirme görüntüsünün piksel sayılarak hesaplanır. (v) dagilimini değerler XOR ve bindirme değerleri bölünmesi ile hesaplanır. Bu Şekil 6NMDS mezarlığına temeli vardır. Hem dagilimini değerleri ve NMDS Arsa Haritayı ihmal edilebilir bir kayma- ve belirgin zamansal topluluk heterojenite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Şekil 6: CHIC dayalı benzerliği analiz Biyogaz toplum örnekleri. 0-gün örnek bu komplo son derece farklı toplum yapısını analiz (ek dosya 1-S11) deforme etme nedeniyle bırakıldı. NMDS Arsa düşük kayma hakkında varsayım doğruladı- ve daha yüksek zamansal heterojenite şık Aracı kullanılarak yapılan ve Şekil 5' te açıkladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Şekil 7: korelasyon analizi Biyogaz topluluk. Matrix Spearman'ın sıralama sipariş katsayısı kullanılarak hesaplanır ve ek dosya 1-S6 ana kapısı şablonla belirlenmiştir 23 subcommunities göreli zenginliği temel alır. Bir yıllık süre 48 örnekleri için organik yükleme hızı (OLR) ile ilişkili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Şekil 8: planktonik (P) ve çamur benzerlik analizi dayalı Atıksu topluluklarda (S). Örnekleri birincil temizleyici (PCL), aktif çamur Havzası (AS) ve digester tank (DT) bir tam ölçekli Atıksu arıtma tesisi (ek dosya 1-S10 nokta araziler) alınmıştır. Göreli zenginliği ek dosya 1-S6 içinde gösterilen kapı şablonu kullanılarak belirlenmiştir. Bu subcommunity zenginliği de bir CyBar (ek dosya 1-S10) ve NMDS oluşturmak için flowCyBar aracı ile analiz edildi Arsa (R < 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Şekil 9: saf kültür kararlılığını fiksasyon. 0 h alınan büyüme eğrisi deney örnekleri 28 gün içinde-80 ° C'de % 15 gliserol fiksasyonu sonra bekletildi. FSC vs DAPI floresans boncuk gösterilir denetimle çizer. Ölçüm serisi boncuk (ek dosya 1-S3) içermez. 50.000 olaylar hücre Kapısı (ek dosya 1-S6) kaydedildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
1 ek dosyası: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Microbiome Dynamics â€“ Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities at JoVE.com

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

JoVE Journal

Environment

11.9K Görüntüleme.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ. Akış sitometrik çözümlemesi saf kültürler araştıran ve mikrobiyal topluluk dinamikleri izleme için değerli kanıtlamıştır. Biz üç kapsamlı iş akışları, örnekleme veri analizi için saf kültürler ve net Orta de olduğu gibi zorlu matrisler, karmaşık toplulukları için gelen sırasıyla mevcut.

Video: Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Çevre

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Biyomühendislik

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Tıp

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

<meta charset="utf8"></head><body>Akut İzole Edilmiş Erişkin Mikroglia ve Beyin Makrofajlarının Fagositik Özelliklerini İn Vitro Karakterize Etmek İçin Flow Sitometri Yaklaşımı

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Akut İzole Edilmiş Erişkin Mikroglia ve Beyin Makrofajlarının Fagositik Özelliklerini İn Vitro Karakterize Etmek İçin Flow Sitometri Yaklaşımı

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Karakteristik Microbiome Dynamics-akış sitometresi doğal topluluklar için iş akışları saf kültürler dayalı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Akut İzole Edilmiş Erişkin Mikroglia ve Beyin Makrofajlarının Fagositik Özelliklerini İn Vitro Karakterize Etmek İçin Flow Sitometri Yaklaşımı

Akut İzole Edilmiş Erişkin Mikroglia ve Beyin Makrofajlarının Fagositik Özelliklerini İn Vitro Karakterize Etmek İçin Flow Sitometri Yaklaşımı