Wir erkennen dankbar Michael Jahn und Yuting Guo für die Bereitstellung bzw. das Verfahren und die Datasets in Reinkultur und der Belebtschlamm-Gemeinschaft. Wir danken weiter Katrin Mörters für die Biogas-Community-Proben zu analysieren. Diese Arbeit wurde von der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, Projekt Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) im Auftrag des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL), des zentralen Innovationsprogramms für KMU (ZIM) des Bundesministeriums finanziert. für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), die Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, Projekt-On-Demand-Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei Und Kläranlage 33960/01-32), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (FZK 03XP0041G) und die Helmholtz-Gemeinschaft programmorientierte Förderung (POF III R31 Thema 3 Bioenergie).

<ol>
	<li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems.">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).</li><li>Fathepure, B. 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F., H&#252;bschmann, T., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function.">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li><li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding.">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science &amp; Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li><li>Lefort, T., Gasol, J. 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J., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level.">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).</li><li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+for+counting+natural+planktonic+bacteria+and+understanding+the+structure+of+planktonic+bacterial+communities.">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li><li>Gasol, J. M., Mor&#225;n, X. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Determination+of+Microbial+Abundances+and+Its+Use+to+Obtain+Indices+of+Community+Structure+and+Relative+Activity.">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li><li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+biodiversity+of+microbial+communities+by+flow+cytometry.">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li><li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation.">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li><li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting.">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li><li>Koch, C., Harnisch, F., Schr&#246;der, U., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+fingerprints:+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics.">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).</li><li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Roman&#237;, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+model+to+resolve+cytometric+microbial+community+patterns+in+flowing+waters:+Deconvolving+Cytometric+Microbial+Subgroups.">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li><li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -. M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization:+Flow+Cytometric+Fingerprinting.">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li><li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water.">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microbiota+flow+cytometry+reveals+dynamic+colitis-associated+changes+in+fecal+bacterial+composition:+Technical+comment.">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine erfolgreiche Analyse der mikrobiellen Populationen und Gemeinschaften erfordert gut abgestimmte Cytometers, eine geeignete Wahl der zellenparameter und einen zuverlässigen Workflow von Probenahme und Fixierung auf die Messung und Datenauswertung. Die ausgewählte zellenparameter müssen mit den verfügbaren Erregung Wellenlängen Gemahl. Wir nutzen und empfehlen DAPI, die sehr empfindlich bei niedrigen Konzentrationen ist; aber muss mit einem UV-Laser, angeregt werden, die in der Regel nicht im standard Cytometer Aufbauten besteht. Andere Farbstoffe, wie z. B. SYBR Green I, auch ganze Bevölkerungen Fleck oder Gemeinschaften aber liefern in der Regel schlechter als Auflösungen. Wir empfehlen nicht, mit Fisch-Verfahren oder Lebensfähigkeit Tests in mikrobieller Gemeinschaften. Diese Ansätze sind nicht zu quantifizieren, zu überprüfen und zu steuern, weil ihre Auswirkungen auf die einzelnen Arten in der Gemeinschaft ist ungewiss. Sie können nicht zuverlässig getestet werden, solange ein Großteil der typischen Gemeinschaften als eine Reinkultur noch nicht verfügbar ist.
Wichtige Schritte im Protokoll gehören Probenahme und Fixierung Verfahren sowie Zellsortierung. Die Probenahme kann kompliziert werden, durch die Tendenz bestimmter Reinkulturen und mikrobieller Gemeinschaften zu aggregieren, Flocken oder Partikel von der Probenmatrix einhalten. Es ist wichtig, diese Aggregate zu zerstreuen und die Zellen in einer Probe zu trennen, bevor man sie zur durchflusszytometrischen Analyse um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren. Die vorgestellten Vorbereitung Protokolle wurden optimiert, um einzelne Zelle Analyse zu ermöglichen. Eine endgültige 50 µm Filtrierung erfolgt vor der Messung entfernen alle verbleibenden Aggregate und verhindern, dass die 70 µm Düse von der Zelle Sorter und die Strömung Küvette des Analysators verstopfen. Zelle Flocken aus Kläranlagen sind besonders reichlich, robust und entscheidend für die Funktion des Systems. Wir untersuchten die planktonischen und Schlamm Basis mikrobielle Gemeinschaften in verschiedenen Tanks mit einer Full-Scale Kläranlage, das etablierte Protokoll zu testen. Der Schlamm bilden Zelle, die Aggregate deutlich abgeführt wurden und die Zusammensetzung der Gemeinschaft blieb stabil. Darüber hinaus stellte planktonischen und Schlamm-basierten Gemeinschaften bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen ihnen in allen drei gesampelten Tanks (Abbildung 8, ergänzende Datei 1-S10). Diese Ergebnisse wurden durch vergleichende 16 s rDNA Amplikons Sequenzierung von einem frisch, ein Formaldehyd behandelten-überprüft ein Formaldehyd und Ethanol fixiert-, und eine sortierte Probe10. Dennoch kann außerordentlich anspruchsvoll Umweltproben, wie starke Biofilme oder Bakterien wachsen in eng vernetzten Ketten abführen möglich. Bodenproben können besonders problematisch sein, da die allgegenwärtigen Partikel im Histogramm angezeigt und können die Zellen durch schieren Fülle verdecken. In solchen Fällen müssen traditionelle sequenziermethoden angewendet werden.
Die Fixierung Stabilität jeder neuen Sample-Set sollte getestet werden, bevor Sie das Experiment damit Ergebnis gültige entwerfen. Gute Fixierung Stabilität ermöglicht auch die gepoolten Färbung und Messung von mehreren Referenzpunkten Zeit an einem einzigen Tag. Es ermöglicht außerdem Replikation Messungen und Retrospektive Zellsortierung von entscheidenden Zeitpunkten nach den Abschluss und die endgültige Auswertung des Versuchs. Die Fixierung Stabilität der Reinkultur wurde über 28 Tage (Abbildung 9) überprüft. Für vor-Ort-Untersuchungen einschließlich der Probentransport sollte die Fixierung Stabilität über einen längeren Zeitraum (in diesem Fall 60 Tage für die Gemeinschaft Belebtschlamm 195 Tage für die Biogas-Community, ergänzende Datei 1-S9) getestet werden.
Die Färbung ist in der Regel nicht problematisch, aber mit einem biologischen Standard Anwendung von der bioinformatische Bewertungsinstrumente darf gesteuert werden muss. Wir nutzten die mock-Stamm E. Coli BL21 (DE3), nach dem ASC-Protokoll fixiert und wurde für den Einsatz in jeder Färbung Charge gehortet.
Abgesehen von DAPI, SYBR Green wurde ich erfolgreich angewendet um mikrobielle Gemeinschaften für mehrere Jahre14,23,24,25,26zu beheben. SYBR Green ich lösen Gemeinschaften in hohen und niedrigen Nukleinsäure Teilmengen (HNA und LNA) mit lebenden Zellen in ein Online-Modus. DAPI, ist genauer in seiner Bindung an DNA und ermöglicht die Unterscheidung von mehr als 50 Untergemeinschaften in einem Muster-Set jedoch erfordert einen Fixierung Schritt vor der Färbung.
Zellsortierung ist ein herausragendes Merkmal dieses Ansatzes und kann angewendet werden, wenn bestimmte Untergemeinschaften von Interesse sind. Es muss betont werden, dass weder PFA-(durchgeführt für nur 30 min) noch Ethanol Behandlung oder DAPI-Färbung10 wirkt sich negativ auf die nachfolgenden 16 s Amplikons Sequenzierung hatte. Potenzial beeinflusst die Fixierung und Färbung Verfahren auf Untergemeinschaft Metagenom Analysen noch geprüft werden müssen.
Eine Menge von Informationen über die Community-Funktionen und Trend Dynamik erhalten Sie unabhängig von der Sortierung Ansatz bei der Bioinformatik-Werkzeuge mit, die Community-Funktionen auf einer virtuellen Ebene der Zelle für Zelle lösen und verbinden Sie diese Funktionen mit abiotischen Parameter.
Kürzlich eine Reihe von neuen Bioinformatik Bewertung, alles nützliche Werkzeuge für beide die SYBR Green ich und DAPI-Ansätze, wurden entwickelt, um durchflusszytometrischen Gemeinschaft Mustern zu lösen. Dies sind FlowFP27, die Pakete in dieser Studie (FlowCHIC20, FlowCyBar28) verwendet, ein Dekonvolution Modell mit frischem Wasser Gemeinschaften29 etabliert und ein Werkzeug benutzt, um die Stämme nach ihrer physiologischen diskriminieren Eigenschaften-30. Darüber hinaus kann durchflusszytometrischen Vielfalt bestimmt25 und sogar Stabilitätseigenschaften mikrobieller Gemeinschaften können jetzt mit einem online-Tool10verfolgt werden.
So haben fließen durchflusszytometrischen Analyse einen großen Vorteil, wenn es darum geht, schnelle Auswertung von mikrobiellen Gemeinschaften und möglichen abiotischen Parameter Korrelationen. Allerdings gibt es immer noch Beschränkungen in Bezug auf die Methode. Es kann nicht wirklich online mit dem FlowCyBar-Werkzeug aufgrund der erfahrenen basierend Tor Einstellvorgang angewendet werden. Darüber hinaus würde die Entwicklung nach Maß, bedienungsfreundlich fließen Cytometers stark die Verbreitung des Analyseansatzes Fluss durchflusszytometrischen Microbiome voranzutreiben. Erste Schritte in diese Richtung sind durchgeführte28.
Zukünftige Anwendungen der mikrobiellen Durchflusszytometrie können in der mikrobiellen Ökologie vorgestellt werden, wie es ermöglicht Hochfrequenz Überwachung im Bereich der bakteriellen Generationszeiten und es nachgewiesen wurde, dass ökologische Paradigmen durchflusszytometrischen Daten5 anwendbar sind ,10. Die Methode ist sehr nützlich für Routine-Screenings von Naturlandschaften wie die obligatorische Trinkwasser-Steuerelemente in der Schweiz31. Es kann auch ein wertvolles Instrument für medizinische Anwendungen wie menschliche15 oder tierischen32 Microbiome Screening. Darüber hinaus können neueste Entwicklungen in der Bioinformatik mikrobielle Durchflusszytometrie ein integraler Sensor in die Prozesssteuerung von verwalteten mikrobieller Systeme zu ermöglichen. Mikrobielle Gemeinschaft zytometrie bietet auch ein Screening-Instrument für Zellsortierung, wodurch höhere Auflösung genomische Untersuchungen von bestimmten Community Teilmengen.

Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle in vielen Aspekten der menschlichen Leben. Sie sind die biotischen Haupttreiber des Planeten Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel Zyklen1und fungieren als erniedrigende2,3 , sowie die Synthese4 Biokatalysatoren in verschiedenen Branchen, wie z. B. Abwasserbehandlung 5 oder Biotechnologie6. Sie bilden auch die menschlichen Mikrobiom, die menschliche Gesundheit und Stoffwechsel7,8direkt beeinflusst. Daher sind die Informationen auf Struktur, Funktion und dynamisches Verhalten von Mikroorganismen, in Beantwortung ihrer unmittelbaren Umgebung notwendig, wenn unser Ziel ist es zu verstehen und diese Systeme zu manipulieren. Nächste Generation sequencing (NGS) ist die bewährte Technologie zur Lösung von Microbiome Struktur und Funktion9. Die Analyse und Bewertung der NGS-Daten können nicht nachgeben quantitativen Informationen und ist immer noch teuer, zeitaufwendig und keineswegs bereit, vor-Ort-Ergebnisse in Leistung Gängen. Einige Bakterien zeigen Generationszeiten unter 1 h und ständig wechselnden Gemeinschaftsstrukturen in bestimmten Umgebungen10Ursache. Im Anschluss an solche Dynamik würde durch Sequenzierung Ansätze das Finanz- und Belegschaft der meisten wissenschaftlichen Labors überschreiten.
Im Gegensatz dazu kann Durchflusszytometrie Gemeinschaft ähnlich NGS Daten, Fingerabdrücken unter Beibehaltung einer höheren Zeit, Arbeit und Kosten-Effizienz. Hier präsentieren wir Ihnen fließen durchflusszytometrischen Techniken mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik auf der Linie auf der Ebene der einzelnen Zelle zu verfolgen. Im Gegensatz zu NGS Durchflusszytometrie liefert keine phylogenetische Zugehörigkeit oder Informationen auf funktionelle Gene, sondern liefert quantitative Zellzahlen. Mit Durchflusszytometrie, können mikrobielle Gemeinschaften in Untergemeinschaften mit unterschiedliche Lichtstreuung und Fluoreszenzeigenschaften (forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) liefern Hinweise der Zellengröße und Granularität, beziehungsweise) gelöst werden. Der vorgestellte Ansatz nutzt überwiegend Zelle Größe - und DNA belaufen sich Informationen, die auf bestimmte Zelltypen und physiologischen (Wachstum) Staaten verbunden sind. Der DNA-Gehalt wird quantifiziert mit UV-erregbare 4', 6-Diamidino-2'-Phenylindole (DAPI) Farbstoff, der bindet an A-T reichen Regionen der DNA und kann sogar chromosomalen unterschiedlichem lösen. Durch die Kombination von DAPI Fluoreszenz und FSC können mehr als 50 Untergemeinschaften unterschieden und für die Umstellung Zeit11Häufigkeiten überwacht werden. Die Untergemeinschaft Fülle Variationen können mit Veränderungen in der Mikro-Umwelt Umgebung, wie z. B. pH-Wert und Produkt-Titer12, mit globalen Parameter, wie z. B. das Wetter13,14, oder im Falle von Darm oder Speichel korreliert werden mikrobiome mit bestimmten medizinischen Behandlungen15. Diese Korrelationen zeigen wichtige Untergemeinschaften verantwortlich für bestimmte Funktionen in den metabolischen Netzwerkes der ganzen Gemeinde. Die wichtigsten Untergemeinschaften können dann werden speziell gefördert oder unterdrückt durch die Veränderung der Mikro-Umfeld oder sortiert für anschließende Sequenzierung15 oder Proteomic Untersuchung16.
Allerdings ist mikrobiellen Gemeinschaft Durchflusszytometrie nicht noch weit aufgrund der eher niedrigen Anzahl Fluss durchflusszytometrischen Geräte ordnungsgemäß auflösen von mikrobiellen Populationen oder Gemeinschaften gegründet. Darüber hinaus kann der Mangel an Erfahrung, Gemeinschaft Analyse Rohrleitungen und effektive Datenauswertung eine Eintrittsbarriere für Forscher Microbiome Analyse Herausforderungen darstellen. Wir haben umfangreiche Workflows zur Lösung dieser Probleme festgestellt. Um ihre allgemeine Anwendbarkeit zu veranschaulichen, präsentieren wir ihnen auf drei beispielhafte Sample-Sets (ergänzende Datei 1-S1), nämlich ich) eine Reinkultur (PC) für biotechnologische Anwendungen in definierten klar Medium (Pseudomonas Putida KT 2440 auf angebaut (Glukose), Ii) eine komplexe Lab-Gemeinschaft in klare Medium (Belebtschlamm Gemeinschaft (ASC) im synthetischen Abwasser) und Iii) eine komplexe Community von Naturlandschaften in einer dichten Matrix (Biogas-Community (BC) in Maissilage).
Mehrere Faktoren beeinflussen die Protokoll-Wahl für jeden der diese Sample-Sets. Tieffrieren verzichtet auf den Einsatz von giftigen Chemikalien, sondern beschränkt sich meist auf Lab-Umgebungen durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff für Schock Zuckerguss. Die Formaldehyd-Stabilisierung und anschließende Ethanol Fixierung ermöglicht Bulk Sampling ohne die Notwendigkeit einer aliquoten Vorbereitung und erweist sich über lange Zeiträume stabil sein. Jedoch möglicherweise Protein-reiche Proben wie menschlichem Speichel15 problematisch, da Protein Flocken, denaturiert durch Formaldehyd, ungünstigen Signal-Rausch-Verhältnis führen können. Die probentrocknung dauert die meiste Zeit (ca. 1 h insgesamt) der Verfahren in diesem Vergleich, aber auf der Baustelle ohne giftige Chemikalien durchgeführt werden kann. Es liefert stabile Pellets in Rohren, die ohne Kühlung oder zusätzliche Gefahr Vorsichtsmaßnahmen problemlos versendet werden können. Darüber hinaus wurden viele alternative Fixierung Methoden vorgeschlagenen11. Wir empfehlen dringend, um die Auflösung und Fixierung Stabilität verschiedener Protokolle zu testen, bei der Einführung eines neuen Muster-Set.
Wir zwei verschiedene fließen Cytometers verwendet, um die Sätze zu analysieren: (i) eine sehr aufwendige und teure, Forschung zentriert Zelle Sorter und (Ii) eine Anwendung konzentriert Top Bank Analyzer, die für vor-Ort-Anwendung5besser geeignet erscheint. Der BC wurde mit der Bank Top Analyzer gemessen, während der PC und der ASC mit dem Cell Sorter gemessen wurden. Die Analyse der drei beispielhafte Probe setzt benötigte unterschiedliche Verfahren zur optimierten Reproduzierbarkeit, Probe Stabilität und Workflow-Komfort. Das folgende Protokoll wird in den Abschnitten für die drei verschiedenen Systeme angeben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:985px;" width="985">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Milli-Q system Synthesis A10</td>
			<td style="width:335px;">Merck, Darmstadt, (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioPak Ultrafiltration Cartridge</td>
			<td style="width:335px;">Merck, Darmstadt, (GER)</td>
			<td>CDUF BI0 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MoFlo Legacy cell sorter</td>
			<td style="width:335px;">Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Innova 90C</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Innova 70C&#160;</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>488 nm, 400 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genesis MX488-500 STM OPS</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>488 nm, 400 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xcyte CY-355-150</td>
			<td style="width:335px;">Lumentum, Milpitas, California, USA</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>355 nm, 150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Photomultiplier tubes R928 and R3896</td>
			<td style="width:335px;">Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Summit 4.3 software</td>
			<td style="width:335px;">Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#181;m&#160; FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;">F8815</td>
			<td>350/440 blue fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m YG FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;">F-8827</td>
			<td>505/515 yellow-green fluorescent beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">0.5 &#956;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td>
			<td style="width:335px;">PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td>
			<td>18339</td>
			<td>360/407</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#956;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td>
			<td style="width:335px;">PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td>
			<td>17458</td>
			<td>360/407 blue fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 &#181;mYG FluoSpheres</td>
			<td style="width:335px;">Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td>
			<td>F-13081</td>
			<td>505/515 yellow-green fluorescent beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td style="width:149px;">CAS no. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td style="width:149px;">CAS no. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyflow Space&#160;</td>
			<td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Laser Genesis CX,</td>
			<td style="width:335px;">Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>355 nm, 150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">H6779-32 series PMTs</td>
			<td style="width:335px;">Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FloMax software</td>
			<td style="width:335px;">Sysmex Partec GmbH, G&#246;rlitz, (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">all optical filters</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td>
			<td>CAS no. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">KCl</td>
			<td style="width:335px;">Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td>
			<td align="right">6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo 10.0.8r1</td>
			<td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Build number: 42398</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">R-software v.3.4.3</td>
			<td>R Core Team</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">flowCHIC</td>
			<td colspan="2"><a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">flowCyBar</td>
			<td colspan="2"><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing microbiome dynamics &#8211; flow cytometry based workflows from pure cultures to natural communities

Die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik ist von entscheidender Bedeutung zu verstehen und zu kontrollieren, natürliche Ökosysteme und technische Anwendungen, Gefahren durch Mikroorganismen. Nächste Generation sequenziermethoden werden weithin genutzt, um mikrobiome zu lösen, aber sie sind in der Regel Ressourcen- und zeitintensiv und vor allem qualitative Informationen zu liefern. Microbiome durchflusszytometrischen Analyse leidet nicht die Nachteile und können relative Untergemeinschaft Häufigkeiten und absoluten Zelle Zahlen auf Linie. Obwohl es keine direkte phylogenetische Information liefert, kann es die auswertetiefe und Auflösung der Sequenzierung Ansätze verbessern. Im Gegensatz zu medizinischen Anwendungen in Forschung und Routine-Einstellungen ist Durchflusszytometrie für Microbiome Analyse noch nicht weit verbreitet. Fehlende Angaben zu Probe-Vorbereitung und Daten-Analyse-Pipelines kann eine Eintrittsbarriere für die Forscher Herausforderungen Microbiome Analyse, die oft Lehrbuch Flow-zytometrie-Anwendungen erstellen. Hier präsentieren wir drei umfangreiche Workflows für Reinkulturen, komplexen Gemeinschaften in Mittel- und komplexen Gemeinschaften in herausfordernden Matrizen bzw. klar. Wir beschreiben einzelne Verfahren, Probenahme und Fixierung und Färbung Protokolle für das jeweilige Sample-Sets optimiert. Wir erarbeiten der durchflusszytometrischen Analyse mit einem komplexen Forschung zentriert und eine Anwendung fokussierte Bank Top-Gerät, beschreiben die Zelle Sortieren Verfahren und Daten-Analyse-Pakete empfehlen. Wir zudem wichtige experimentelle Kontrollen vorschlagen und gelten die dargestellten Abläufe für die jeweiligen Sample-Sets.

Folgende repräsentative Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit von Wiederholungen und veranschaulichen die verschiedenen Data-Visualisierung und Analyse-Techniken auf jedem der drei Sample-Sets. Sie zeigen die Ergebnisse der möglichen Datenpipelines Bewertung für standard Forschung Fragen zu den jeweiligen Satz geeignet. Die vorgestellten Techniken sind jedoch nicht ausschließlich auf das Sample-Set, die sie mit vorgestellt werden. Die Flow Cytometry Rohdaten wurde öffentlich mit FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 zur Verfügung gestellt. Bisher liegen hochgeladenen ASC unter ID FR-FCM-ZYD7.
Biologische und technische repliziert wurden genommen, vorbereitet und nach veröffentlichten Protokolle11analysiert. Biologischer Replikate aus dem PC und ASC wurden aus drei parallelen Kolben. Biologischer Replikate des v. Chr. wurden drei weitere Kostproben an einem Standort in einer pilot-Scale-Anlage gelegt. Drei Aliquote einer Probe wurden fixiert, gefärbt und analysiert, um die technische Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Methoden Reproduzierbarkeit wurde nach bereits veröffentlichten Verfahren11bewertet. Eine Tor-Vorlage für alle Proben einer Sample-Set (ergänzende Datei 1-S6) wurde verwendet für die Berechnung der Standardabweichung (%) pro Tor.
Für den PC war die maximale Standardabweichung der relativen Fülle 3,44 %, während die durchschnittliche Standardabweichung 2,13 % (Abbildung 1). Für die ASC und der BC wurden die maximale Standardabweichungen von der relativen Häufigkeiten 1,27 bis 0,88 %, während die Durchschnitte der Standardabweichungen 2.13 bis 0,21 % (ergänzende Datei 1-S8) waren.
Ein Standardverfahren bei der Untersuchung von einer reinen Stamm-Kultur ist die Vorbereitung einer Wachstumskurve, Lag-Phase, Generationszeiten und Zelldichte unter bestimmten Bedingungen zu analysieren. Wir kombinieren dieses Verfahren mit dem Fluss durchflusszytometrischen Analyse Workflow, ein tieferes Verständnis des Systems (Abbildung 2) zu erreichen. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke zeigen die Zellzyklus Staaten der Kultur an verschiedenen Punkten der Batch-Kultur. Kopiervorlage master Tor (ergänzende Datei 1-S6) wurde gegründet, um den Anteil der Zellen mit einem (c1n), quantifizieren zwei (c2n) und mehrere Chromosomen (cXn, Abb. 2 b). Der überwiegende Teil der beimpften Zellen hatte nur ein Chromosom (93,7 % um 0 Uhr). Dies änderte sich drastisch während des exponentiellen Wachstums, wo fast alle Zellen enthalten mehr als eine (99,6 %, 4 h) und über die Hälfte der Bevölkerung (53,1 %) sogar mehr als zwei Chromosomen enthielten. Dies zeigt p. Putidas Fähigkeit, seine Chromosomen schneller als ihre Generationszeit zu replizieren.
Durchflusszytometrischen Analyse erweist sich als sehr nützlich für die Überwachung der Entwicklung der mikrobiellen Lebensgemeinschaften. Es kann Gemeinschaft Dynamik sehr viel näher als die mehr Ressource intensiv molekularbiologische Methoden5,10folgen. Wir haben diese Dynamik in einem Film und eine Übersicht der Belebtschlamm Gemeinschaft Verschiebungen im Laufe der Zeit gewonnen. Jede Sekunde Frame zeigt ein FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstück einen Auswahlpunkt (ergänzende Datei 2). Eine sehr ausgeprägte Verschiebung zwischen 0 und 4 Tag folgte die Errichtung einer Kern-Community nach Tag 7. Zusätzliche Untergemeinschaften kam am 21. Tag. Wir haben master Tor Vorlage (ergänzende Datei 1-S6), die die Bewertung der mikrobiellen Dynamik auf einer Untergemeinschaft Ebene aktiviert. Die dominierende Untergemeinschaften in verschiedenen Phasen des Experiments waren eindeutig mit dem CyBar-Tool (Abbildung 3). In Kombination mit der Häufigkeitsverteilung der relativen Untergemeinschaft Häufigkeiten half Tore wählen interessante (signifikante Änderung in Hülle und Fülle zu einem wichtigen Zeitpunkt ausgelöst) und tragfähige (über 5 % relative Häufigkeit) für die Sortierung und weitere Analyse22.
Industriellen Maßstab Bioreaktor Anwendungen können mögliche räumliche Heterogenitäten bedingt Unruhe konfrontiert werden. Ändern der Betriebsparameter, wie Veränderungen in der Qualität der nicht-synthetische Substrate sind auch häufig ausgesetzt. Der BC steht für ein solches System und wurde von verschiedenen Orten in einem dynamisch gesteuerte Stecker Fluss Reaktor gesampelt. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Diagramme (Abbildung 4) von der vorbildlichen Referenzpunkten zeigen nur wenig räumliche, sondern ausgeprägte zeitliche Heterogenität. Der BC wurde mit beiden untersucht, schnell automatisiert CHIC und die tiefer gehende master Tor Vorlage basierenden CyBar Ansatz.
Naturgemäß automatisierte, schnelle und neutrale macht den CHIC in einer industriellen Umgebung besonders interessant für vor-Ort-Kontrolle der Bioprozesse. Es vergleicht rohen .fcs Daten aller verfügbaren Proben. Zwei dieser Vergleiche sind in Abbildung 5dargestellt. Die Ergebniswerte der Unähnlichkeit bestätigen die bisherigen Beobachtungen über räumliche und zeitliche Heterogenität. Die NMD Parzellen erzeugt Form schick Werkzeuge Unähnlichkeit Matrix (Abbildung 6) weiter konkretisiert dieses Ergebnis und visualisiert es entsprechend.
Darüber hinaus haben wir die relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften des v. Chr. mit einem master Tor-Vorlage (ergänzende Datei 1-S6) berechnet. Eine Korrelationsanalyse von 48 Proben aus einem ein-Jahres-Frist wurde durchgeführt, um funktionale Beziehungen in der mikrobiellen Gemeinschaft verstehen. Dies kann helfen, um Tore von Interesse für weitere Untersuchungen (4 Zellsortierung) zu identifizieren. Starke positive oder negative Korrelationen mit abiotischen Parametern wie Produkt Titer können helfen, zu verstehen und Ökosysteme und biotechnologische Prozesse zu optimieren. Die organischen raumbelastung enthalten in diesem Zusammenhang (Abbildung 7) ist ein Beispiel für ein abiotischer Parameter. G4, G5 und G10 weisen starke positive Korrelationen und könnte möglicherweise fermentative Arten enthalten, während die negative Korrelation im G8 in Richtung methanogenen Archaeen andeuten könnten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Abbildung 1: Reproduzierbarkeit der durchflusszytometrischen Analyse der Reinkultur. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Kontrolle Perlen (A, B) und bar Grundstücke 3 Untergemeinschaft Häufigkeiten [%] mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung (C, D). Die relativen Häufigkeiten wurden mit der Tor-Vorlage gezeigt in ergänzende Datei 1-S6 bestimmt. Drei biologische Wiederholungen A, B und C die Wachstumskurve um 4 Uhr wurden und drei technische Wiederholungen P1, P2, P3 bereiteten aus Probe A und dreimal, jeweils gemessen: M1, M2, M3, und sind mit ihren jeweiligen Standardabweichungen angegeben. 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Abbildung 2: Zellzyklus Analyse der in Reinkultur, die während einer Wachstumskurve experimentieren über 12 Std. (A). FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke von der Bi-stündlichen Kostproben, die eine Veränderung der DNA-Gehalt in der exponentiellen Wachstumsphase aufweisen. Diese Messreihe enthalten nicht Perlen (siehe ergänzende Datei 1-S3). (B). optische Dichte basierenden Wachstumskurve mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung und relative Häufigkeiten in den Untergemeinschaften im Laufe der Zeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Abbildung 3: Entwicklung der Belebtschlamm Gemeinschaftsstruktur über 24 Tage. (A) die FlowCyBar mit Überlagerung von Häufigkeitsverteilungen in Boxplots für den einzelnen Toren, die Ähnlichkeit der Trends arrangiert werden, visualisiert, die entsprechende Farb-Taste (B) und eine Ähnlichkeit-Analyse in einem NMD Plot Wit R < 0,001 () ( C). die zugrunde liegenden Grundstücke sind in der Filmsequenz in ergänzende Datei 2 dargestellt. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage, in ergänzende Datei 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Abbildung 4: räumliche und zeitliche Heterogenität der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur in industriellem Maßstab plug Flow biogasreaktor. (A) der Vergleich der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur der vier Probenahme Häfen I-IV am Tag 223. (B) der Vergleich der Zeit abhängigen Gemeinschaft Struktur Variationen von Tag 0, Tag 384 im Hafen II. Der Lärm hat verspätet abgeschnitten worden, um die Visualisierung zu verbessern. 250.000 Ereignisse wurden in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6) gemessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Abbildung 5: Bildvergleich durchflusszytometrischen Histogramm – schick. Das Prinzip des CHIC-Algorithmus wird durch den Vergleich zweier Proben repräsentieren die räumliche und zeitliche Heterogenität jeweils illustriert. (i) schicke Bilder entstehen aus .fcs Dateien nach Auswahl zwei Parameter (FSC vs. DAPI Fluoreszenz) angezeigt. Die Graustufen (0 – 255) kodiert die Anzahl der Ereignisse in einem Pixel. (Ii) CHIC Teilmengen werden nach Angabe des Bereichs, in Zellen generiert (hier: 200 < x 4000 200 < < y < 2200). (Iii) XOR Kombination Bild entsteht durch den Vergleich Pixel zwischen den Untergruppen. Kein Unterschied ist gleich 0 und wird als schwarz angezeigt. Maximale Differenz entspricht 200 und wird als weiß angezeigt. Der entsprechende XOR-Wert berechnet, indem die Graustufen-Werte alle Pixel im Bild XOR. (iv) Überlagerungsbild Kombination entsteht, wenn die Graustufen-Werte der Pixel der Teilmengen. Der entsprechende Overlay-Wert wird berechnet durch zählen der Pixel ein Overlay-Bild, die nicht gleich NULL und deshalb enthalten Informationen. (V) Unähnlichkeit Werte sind XOR und Overlay Werte dividiert. Diese sind die Basis für die NMD-Darstellung in Abbildung 6. Die Unähnlichkeit Werte und NMD Handlung zeigen eine vernachlässigbare räumliche- und eine ausgeprägte zeitliche Gemeinschaft Heterogenität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Abbildung 6: CHIC basierte Ähnlichkeit Analyse der Biogas Gemeinschaft Proben. Die 0-Day-Probe wurde aus dieser Handlung aufgrund seiner extrem unterschiedlichen Gemeinschaftsstruktur verzerren die Analyse (ergänzende Datei 1-S11) ausgeschlossen. Die NMD Handlung bestätigt die Annahme über räumliche niedrig- und höhere zeitliche Heterogenität mit dem CHIC-Tool gemacht und erklärt in Abbildung 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Abbildung 7: Korrelationsanalyse auf der Biogas-Community. Die Matrix wurde mit Spearmans Rangfolge Koeffizient berechnet und basiert auf der relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften, die mit dem master Tor Template in ergänzende Datei 1-S6 ermittelt wurden. Sie wurden korreliert mit der organischen raumbelastung (OLR) für 48 Proben aus einem Zeitraum von einem Jahr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Abbildung 8: Ähnlichkeit Analyse von planktonischen (P) und Schlamm basiert (S) Gemeinschaften im Abwasser. Von der primären Klär (PCL), aktiviert Schlamm Becken (AS) und Digester Tank (DT) eine komplette Kläranlage (Punkt plottet in ergänzende Datei 1-S10) wurden Proben genommen. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage in ergänzende Datei 1-S6 gezeigt. Diese Untergemeinschaft Häufigkeiten wurden auch mit dem FlowCyBar-Werkzeug erstellen Sie ein CyBar (ergänzende Datei 1-S10) und NMD analysiert Plot (R < 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Abbildung 9: Fixierung Stabilität der Reinkultur. Proben aus dem Wachstum Kurve Experiment genommen um 0 Uhr wurden nach der Fixierung in 15 % Glycerin über 28 Tage bei-80 ° C gelagert. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Perlen gezeigt werden. Messreihe beinhaltet keine Perlen (ergänzende Datei 1-S3). 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

JoVE Journal

Environment

11.8K Aufrufe.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ. Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Serie: Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Helminth Collection and Identification from Wildlife

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), &#34;thorny-headed worms&#34; (acanthocephalans), &#34;flukes&#34; (trematodes), and &#34;tapeworms&#34; (cestodes). The optimum method for collecting helminths is to examine a host that has been dead less than 4-6 hr since most helminths will still be alive. A thorough necropsy should be conducted and all major organs examined. Organs are washed over a 106 &#956;m sieve under running water and contents examined under a stereo microscope. All helminths are counted and a representative number are fixed (either in 70% ethanol, 10% buffered formalin, or alcohol-formalin-acetic acid). For species identification, helminths are either cleared in lactophenol (nematodes and small acanthocephalans) or stained (trematodes, cestodes, and large acanthocephalans) using Harris&#39; hematoxylin or Semichon&#39;s carmine. Helminths are keyed to species by examining different structures (e.g. male spicules in nematodes or the rostellum in cestodes). The protocols outlined here can be applied to any vertebrate animal. They require some expertise on recognizing the different organs and being able to differentiate helminths from other tissue debris or gut contents. Collection, preservation, and staining are straightforward techniques that require minimal equipment and reagents. Taxonomic identification, especially to species, can be very time consuming and might require the submission of specimens to an expert or DNA analysis.

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths.&#160; The four major types of helminths are &#8220;roundworms&#8221; (nematodes), &#8220;thorny-headed worms&#8221; (acanthocephalans), &#8220;flukes&#8221; (trematodes), and &#8220;tapeworms&#8221; (cestodes).&#160; Here we describe how helminths are collected from a vertebrate animal and how they are preserved and taxonomically identified.&#160;

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

Forschung

Umwelt

A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to environmental changes and to finally reconstruct such changes. This is done by analyzing growth variations back in time and correlating various plant-specific parameters to (for example) temperature records. Integrating wood anatomical parameters in these analyses would strengthen reconstructions, even down to intra-annual resolution. We therefore present a protocol on how to sample, prepare, and analyze wooden specimen for common macroscopic analyses, but also for subsequent microscopic analyses. Furthermore we introduce a potential solution for analyzing digital images generated from common small and large specimens to support time-series analyses. The protocol presents the basic steps as they currently can be used. Beyond this, there is an ongoing need for the improvement of existing techniques, and development of new techniques, to record and quantify past and ongoing environmental processes. Traditional wood anatomical research needs to be expanded to include ecological information to this field of research. This would support dendro-scientists who intend to analyze new parameters and develop new methodologies to understand the short and long term effects of specific environmental factors on the anatomy of woody plants.

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Technischer Sicht in Modern Jahrringforschung - Wie Dendroökologische und Holz anatomische Herausforderungen zu meistern

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

A Video Surveillance System to Monitor Breeding Colonies of Common Terns (Sterna Hirundo)

Many waterbird populations have faced declines over the last century, including the common tern (Sterna hirundo), a waterbird species with a widespread breeding distribution, that has been recently listed as endangered in some habitats of its range. Waterbird monitoring programs exist to track populations through time; however, some of the more intensive approaches require entering colonies and can be disruptive to nesting populations. This paper describes a protocol that utilizes a minimally invasive surveillance system to continuously monitor common tern nesting behavior in typical ground-nesting colonies. The video monitoring system utilizes wireless cameras focused on individual nests as well as over the colony as a whole, and allows for observation without entering the colony. The video system is powered with several 12 V car batteries that are continuously recharged using solar panels. Footage is recorded using a digital video recorder (DVR) connected to a hard drive, which can be replaced when full. The DVR may be placed outside of the colony to reduce disturbance. In this study, 3,624 h of footage recorded over 63 days in weather conditions ranging from 12.8 &#176;C to 35.0 &#176;C produced 3,006 h (83%) of usable behavioral data. The types of data retrieved from the recorded video can vary; we used it to detect external disturbances and measure nesting behavior during incubation. Although the protocol detailed here was designed for ground-nesting waterbirds, the principal system could easily be modified to accommodate alternative scenarios, such as colonial arboreal nesting species, making it widely applicable to a variety of research needs.

A Video Surveillance System to Monitor Breeding Colonies of Common Terns Sterna Hirundo

This paper describes a protocol that uses a remote video monitoring surveillance system to continuously monitor breeding colonies of ground-nesting waterbirds. The system includes five cameras monitoring individual nests and one camera monitoring the colony as a whole, and is powered by car batteries that are recharged via solar panels.

Ein Video-Überwachungssystem zur Überwachung Brutkolonien der Flussseeschwalben (Sterna Hirundo)

Many waterbird populations have faced declines over the last century, including the common tern (Sterna hirundo), a waterbird species with a widespread ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on fish populations. Adverse effects monitoring, utilizing biomarkers from the organismal to the molecular level, can be used to assess the cumulative effects on fishes and other organisms. Fish health has been used worldwide as an indicator of aquatic ecosystem health. The necropsy-based fish health assessment provides data on visible abnormalities and lesions, parasites, condition and organosomatic indices. These can be compared by site, season and sex, as well as temporally, to document change over time. Severity ratings can be assigned to various observations to calculate a fish health index for more quantitative assessment. A drawback of the necropsy-based assessment is that it is based on visual observations and condition factors, which are not as sensitive as tissue and subcellular biomarkers for sublethal effects. Additionally, it is rarely possible to identify causes or risk factors associated with observed abnormalities. So, for instance a raised lesion or "tumor" on the fins, lips or body surface may be a neoplasm. However, it could also be a response to a parasite, chronic inflammation or hyperplasia of normal cells in response to an irritant. Conversely, neoplasms, certain parasites, other infectious agents and many tissue changes are not visible and so may be underestimated. However, during the necropsy-based assessment, blood (plasma), tissues for histopathology (microscopic pathology), genomics and other molecular analyses, and otoliths for aging can be collected. These downstream analyses, together with geospatial analyses, habitat assessments, water quality and contaminant analyses can all be important in comprehensive ecosystem evaluations.

The health of wild fishes can be used as an indicator of aquatic ecosystem health. Necropsy-based fish health assessments provide documentation of visible lesions or abnormalities, data used to calculate condition indices as well as the opportunity to collect tissues for microscopic evaluation, gene expression and other more in-depth analyses.

Autopsie-basierte Wildfisch Gesundheitsprüfung

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Eine optimierte Rhizobox-Protokoll zum Wurzelwachstum und Reaktionsfähigkeit auf lokalisierte Nährstoffe zu visualisieren

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Single-Durchsatz ergänzende hochauflösende Analysetechniken für die Charakterisierung von komplexen natürlichen organischen Substanz Mischungen

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Leaf Area Index Estimation mit drei unterschiedlichen Methoden in reinen Laubständen

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Ein Leitfaden zur Konzentrations-Frequenz-Antwort-Analyse von Brennstoffzellen

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...