我々 は感謝してプロシージャと純粋培養と活性汚泥コミュニティのデータセットをそれぞれ提供するマイケル ・ ヤーンと Yuting 郭を認めます。我々 はさらに、バイオガスのコミュニティ サンプルの解析にカトリン ・ Mörters を感謝します。この作業によって賄われていた (FNR、プロジェクト バイオガス指紋 Nr。 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe バテレ ドイツの中央政府大臣に代わって食料・農業 (BMEL)、中央技術革新プログラム連邦省の中小企業 (ジンバブエ)経済情勢とエネルギー (BMWi) (INAR 夕べ、16KN043222)、ドイツ Bundesstiftung 環 (DBU、プロジェクト オンデマンドからだ・ フォン ・ Phosphatdünger オーストラリア Reststoffen フォン ブラウエライ und Kläranlage 33960/01-32)、教育のためドイツの中央政府大臣のと研究 (BMBF) (FZK 03XP0041G) とヘルムホルツ協会の資金プログラム指向 (POF III R31 トピック 3 バイオ エネルギー)。

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微生物の個体群と群集の解析に成功には、適切にチューニングされた cytometers、セルのパラメーターの適切な選択、サンプリング、測定、データの評価に向けた固定から信頼性の高いワークフローが必要です。選択したセルのパラメーターする必要があります利用可能な励起波長のコンソート。使用し、低濃度に非常に敏感である DAPI をお勧めしますしかし標準の cytometer セットアップで通常構成されていない紫外線レーザーによって励起する必要があります。他の染料は、サイバーなど緑の私、また、汚れ全体集団やコミュニティが一般的に劣っている解決策を提供します。微生物群集の魚プロシージャまたは生存率テストを使用してはお勧めしません。これらのアプローチは、定量化、およびコミュニティの個々 の種への影響は不明であるために、制御を確認することが可能ではありません。彼らに確実にテスト不能、典型的なコミュニティの相当な割合はまだ純粋な文化として利用できない限り。
セルの並べ替えと同様、サンプリングと固定の手順、プロトコルで重要な手順が含まれます。サンプリングすることができます特定の純粋培養とフロックに集計またはサンプル マトリックスの粒子に付着する微生物群集の傾向によって複雑になります。これらの凝集体を放散し、フローサイトメトリーによる解析結果の信頼性を保証するためにそれらを導入する前に、サンプル内のセルを区切るが欠かせません。発表準備のプロトコルが単一細胞解析を可能にする最適化されました。最終 50 μ m のろ過は、残留集計セルソーターの 70 μ m ノズルとアナライザーの流れキュベットの目詰まりを防止し測定の前に実行されます。廃水処理プラントからセル フロックは、特に豊富な堅牢であり、システムの機能に不可欠です。汚泥ベース確立されたプロトコルをテストする本格的な排水処理プラントの別のタンクで微生物と、浮遊性を調査しました。集計した消費明らかに細胞集塊形成汚泥と群集組成は安定していた。さらに、浮遊性と汚泥ベースのコミュニティはすべての 3 つのサンプル タンク (図 8、補助ファイル 1-S10) でそれらの間の顕著な類似性を展示しました。これらの結果はホルムアルデヒド、エタノール執着の新鮮な -、ホルムアルデヒド処理 - 比較 16S rDNA 増幅配列による検証した-、および並べ替えられたサンプル10。それにもかかわらず、非常に強力なバイオ フィルム細菌密接に接続されたチェーンの成長などの環境試料に挑戦できない可能性が放散します。土壌サンプルは、ユビキタスの粒子、ヒストグラムに表示によって豊富なセルが見えなくなるとは特に問題があります。このような場合、伝統的な配列方法は適用する必要があります。
すべての新しいサンプル セットの固定の安定性は、結果の妥当性を保証するための実験を設計する前にテスト必要があります。良い固定の安定性には、プールされた染色と 1 日に複数のサンプルの時間ポイントの測定もできます。さらに、レプリケーションの測定と回顧セルソート決定的なタイム ポイントのまとめと実験の最終的な評価の後をできます。純粋培養の固定の安定性は 28 日間で (図 9) を確認しました。敷地内の実験サンプル輸送を含む、固定安定性は (この例では、活性汚泥のコミュニティのため 60 日、バイオガスのコミュニティの補足ファイル 1 S9 の 195 日) で長い期間にわたってテストしてください。
染色は通常問題ではありませんが、バイオ情報評価ツールのアプリケーションを許可する生物学的標準で制御する必要があります。大腸菌BL21 のモックのひずみを使いました (DE3) ASC プロトコルによると執着は、すべて染色バッチで使用するための備蓄します。
DAPI、SYBR グリーンから離れて私がされて正常に適用数年14,23,24,25,26の微生物コミュニティを解決します。SYBR グリーン高および低核酸サブセット (HNA および LNA) にコミュニティを解決することができますオンラインのやり方で生きている細胞を用いたします。DAPI、DNA への結合の詳細し 1 つのサンプル セットに 50 以上のサブコミュニティの区別をできるようにしかし、染色する前に固定の手順が必要です。
セルの並べ替えこのアプローチの顕著な特徴は、特定のサブコミュニティがさらに関心のある場合に適用できます。それも PFA (30 分だけ実行されます) もエタノール処理または10を汚す DAPI が後続 16S 私アンプリコン シーケンスにマイナスの影響を持っていたことを強調する必要があります。固定の潜在的な影響し、ステイニングがサブコミュニティ メタゲノム解析はまだテストする必要があります。
多くのコミュニティ機能とトレンドのダイナミクスに関する情報ことができる並べ替え方法から独立したバイオインフォマティクスのツールは、仮想細胞による細胞レベルのコミュニティ機能を解決および非生物的でこれらの機能を接続を含む場合パラメーター。
最近、新しいバイオインフォマティクス評価ツール、両方のサイバーのためすべての有用な数は私と DAPI アプローチ グリーン、フローサイトメトリーによるコミュニティがパターンを解決するために開発されました。これらの FlowFP27、(flowCHIC20、flowCyBar28), 本研究では、パッケージを使用して新鮮な水社会29設立デコンボリューション モデルとによると自分の生理系統を区別するためのツール特徴30。また、フローサイトメトリーによる多様性が断固とした25をすることができます、オンライン ツール10微生物群集のも安定性が続く今ことができます。
したがって、フローサイトメトリー解析における微生物群集と非生物的パラメーター相関の迅速な評価になったら大きな利点があります。しかし、まだメソッドには制限があります。それは、経験に基づいてゲート設定プロシージャのための flowCyBar ツールを使ってオンライン本当に適用できません。さらに、カスタムメイドで使いやすい流れの cytometers の開発は流れフローサイトメトリー マイクロバイ分析アプローチによる増殖を大きく前進するでしょう。この方向の最初のステップは引き受けられた28です。
それにより細菌の世代時間の範囲内で高周波の監視と生態学的パラダイムがフローサイト メーター データ5 に適用されることが示されている、微生物生態学、微生物フローサイトメトリーの応用を想定することができます。 ,10。メソッドはスイス連邦共和国の31の必須飲料水コントロールのような自然環境の定期上映のため非常に便利です。それは人間15または動物32マイクロバイ スクリーニングのような医療用の貴重なツールにすることができます。さらに、バイオインフォマティクスの最新動向が微生物の管理下システムのプロセス コントロールに不可欠なセンサーをする微生物フローサイトメトリーを有効にします。微生物群集フローサイトメトリーは、高解像度の特定のコミュニティのサブセットのゲノムの調査を可能にする細胞の選別のスクリーニング ツールを提供します。

微生物は、生きている人間の多くの面で重要な役割を果たします。彼らは惑星の炭素、窒素、リン、硫黄サイクル12,3を分解と同様、廃水処理などの様々 な産業で4生体触媒の合成として法の主要な生物的ドライバー5やバイオ6。彼らは人間の健康および代謝7、8に直接的な影響は人間のマイクロバイを構成します。したがって、構造、関数および即時の環境への応答における微生物の挙動については、完全に理解し、これらのシステムを操作を目指すなら必要です。次世代シークエンシング (NGS) はマイクロバイ構造と機能9を解決する技術の確立です。ただし、解析と NGS データの評価定量的な情報を得られることはできません、まだ高価、時間のかかる、廊下のパフォーマンスでは敷地内の結果を提供すること準備ができているです。いくつかの細菌は、1 h と常に一定の環境の10のコミュニティ構造の変化の原因の下の生成時刻を表示します。次のようなダイナミクス シーケンスのアプローチを使用して最も科学的研究所の金融・労働力容量をオーバーしました。
対照的に、フローサイトメトリーは、時間、労働とコスト効率を維持しながら NGS データと同様にコミュニティ指紋を提供できます。流れフローサイトメトリー技術単一セルのレベルの微生物群集動態線に従うことを紹介します。異なり、NGS、フローサイトメトリーは機能遺伝子系統所属や情報を提供していません、定量的細胞数を提供します。フローサイトメトリーを用いた微生物群集が明瞭な光散乱と蛍光特性 ((FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) がわかるようにセル サイズと細かさでそれぞれ) サブコミュニティに解決できます。提示方法を主に利用してセル サイズ- および DNA 量の特定の細胞の種類と生理 (成長) の状態に関連付けられている関連する情報。DNA 量は、UV-興奮 4', 6-diamidino 2'-phenylindole (DAPI) DNA の AT リッチ領域にバインドし、異なる染色体レベルを解決することができますも染料を使用して定量化されます。DAPI の蛍光と FSC を組み合わせることによって 50 以上のサブコミュニティ区別および監視が可能時間11とともに組成を変えることを。サブコミュニティの豊富なバリエーションが pH と製品価12, グローバル パラメーター、天気13,14などまたは腸や唾液の場合など、マイクロ環境の環境の変化を関連付けることができます。特定の治療15内細菌叢解析。これらの相関関係には、キーのサブコミュニティがコミュニティ全体の代謝ネットワークの特定の機能を担当が明らかにします。キーのサブコミュニティが具体的に昇格または周囲の微小環境を変えることによって抑制したり後続のシーケンス15やプロテオームの調査のための16のためにソートします。
ただし、微生物群集フローサイトメトリー確立されていませんまだ広く流量フローサイトメトリー装置微生物集団あるいはコミュニティを正しく解決することができる数がかなり低いため。さらに、効果的なデータ評価、コミュニティ解析パイプラインの経験の欠如は、マイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入の障壁を提起するかもしれない。これらの問題に取り組むために包括的なワークフローを設けています。一般的な適用性を示すためには、それを 3 模範的なサンプル セット (補足ファイル 1 S1)、すなわち私に示します) バイオ テクノロジー用に定義された明確な媒体 (シュードモナスの putida KT 2440 上で成長して純粋培養 (PC)ブドウ糖)、ii) 明確な媒体 (合成廃水の活性汚泥コミュニティ (ASC)) と iii で複雑な実験コミュニティ) 密な行列 (トウモロコシのサイレージのコミュニティ (BC) バイオガス) の自然環境から複雑なコミュニティ。
それぞれのサンプル セットのプロトコルの選択に影響を与えるいくつかの要因。深い凍結は有毒な化学薬品の使用を好まれる場合がほとんどショック フロスティングのため液体窒素の使用のためのラボ環境に限定。ホルムアルデヒドの安定化とその後エタノール固定により、分注の準備を必要とせず一括サンプリングと長期間にわたって安定する証明されています。タンパク質フロック、ホルムアルデヒド、次は好ましくない信号雑音比を引き起こす可能性がありますので、人間の唾液15などのタンパク質が豊富なサンプルは、問題となるかもしれません。サンプルの乾燥、この比較での手順のほとんどの時間 (合計で約 1 時間) がかかりますが、有毒化学物質なしサイトで実行することができます。それは、チューブ、冷却またはその他の危険注意せず簡単に出荷することで安定したペレットを得られます。さらに、提案された11をされているたくさんの代替の固定方法。新しいサンプル セットを導入するとき、異なるプロトコルの解像度と固定の安定性をテストするを強くお勧めします。
セットを分析する 2 つの異なる流れの cytometers を使いました: セルソーターと現場適用5に適して表示されます ii) アプリケーション ベンチのトップ アナライザー i) 洗練された高価な研究が中心します。BC は、PC や ASC はセルソーターで測定されたベンチ トップ アナライザーで測定しました。3 つの模範的なサンプルの分析は、最適化された再現性、サンプルの安定性とワークフローの利便のため必要な異なったプロシージャを設定します。次のプロトコルは 3 つの異なるシステムのセクションを指定します。

<table><tbody><tr><td>Milli-Q system Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&amp;nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier tubes R928 and R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m&amp;nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 blue fluorescent</td></tr><tr><td>2 &amp;mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 blue fluorescent</td></tr><tr><td>1 &amp;micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 yellow-green fluorescent beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&amp;nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&amp;ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Build number: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&quot;&gt;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing microbiome dynamics &#8211; flow cytometry based workflows from pure cultures to natural communities

純粋培養の調査と微生物群集の動態のモニタリングは、理解し、自然の生態系と微生物によって駆動される技術的なアプリケーションを制御することが重要です。次世代配列方法は広く、内細菌叢解析を解決する利用が、彼らは、一般的にリソースと時間がかかるほとんど質的情報を提供します。フローサイト マイクロバイそれらの欠点に苦しまないし、相対サブコミュニティ微量含有量と絶対に提供することができます携帯番号ラインで。それは直接の系統情報を提供しないが、分析深さとアプローチをシーケンスの解像度が向上します。医療研究のルーチンの設定とは対照的に、フローサイトメトリーはまだ広くマイクロバイ分析に使用されます。サンプル準備およびデータ解析パイプラインの不足している情報は、よく教科書の流れ cytometry アプリケーションになるマイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入障壁を作成できます。ここでは、純粋培養のための 3 つの包括的なワークフローを提案する、複雑なコミュニティがそれぞれ挑戦的な行列の中で複雑なコミュニティをクリアします。我々 は個々 のサンプリングと固定の手順を記述する、それぞれのサンプルのセットのプロトコルを汚すを最適化します。手の込んだ複雑な研究の中心とフローサイトメトリー解析とアプリケーション集中ベンチ トップ デバイス、プロシージャを並べ替えセルを記述する、データ分析パッケージを提案します。さらに重要な実験的コントロールを提案し、, それぞれのサンプル セットに提示されたワークフローを適用します。

次の代表的な結果複製の必要性を強調し、3 つのサンプル セットのそれぞれに異なるデータの可視化と解析テクニックを例示します。彼らはそれぞれのセットについて標準的な研究の質問に適したデータ評価パイプラインの結果を表示します。ただし、本技術はで示されているサンプル セットに排他的ではありません。流れの cytometry の生データはで、FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 公に利用可能にしました。以前アップロードした ASC データは ID FR FCM ZYD7 の下で利用です。
生物的および技術的なレプリケートされた撮影、準備、公開プロトコル11によると分析します。PC と ASC から生物の複製は、3 つの並列のフラスコから撮影されました。紀元前の生物の複製は、パイロット プラントで 1 つの場所で 3 つの後続サンプリングとして撮影されました。1 つのサンプルの 3 つの因数が固定、染色、技術の再現性を確保するために分析します。以前公開された手順11によると方法の再現性を評価しました。ゲート当たりの標準偏差 (%) を計算するため、1 つのサンプル セット (補足ファイル 1-S6) のすべてのサンプル ゲート テンプレートの使用。
PC の相対的な豊かさの最大の標準偏差は 3.44% 平均の標準偏差は 2.13% (図 1)。ASC と BC は、相対的存在量の最大の標準偏差では、標準偏差の平均値, 2.13% 0.21% (補足ファイル 1-S8) 間 1.27% 0.88% とあった。
標準的な手順、純系文化を調査するときは成長曲線の遅れ位相、世代時間、特定の条件下で細胞密度を分析するための準備です。我々 は、システム (図 2) のより深い理解を達成するためにフローのフローサイトメトリーによる解析のワークフローとこの手順を組み合わせます。DAPI 対 FSC 蛍光プロットでは、バッチ文化のさまざまな時点で文化の細胞周期の状態を明らかにします。マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立 (c1n)、1 つの細胞の割合を定量化する 2 つ (c2n) と複数の染色体 (cXn、図 2 b)。接種の細胞の支配的な割合は、1 つだけの染色体 (93.7 %0 h) を持っていた。これは指数関数的成長は、ほぼすべての細胞に含まれる 1 つ以上 (4 h、99.6%)、(53.1%) の人口の半分はさらに 2 つ以上の染色体を含んでいた以上の間に大きく変化しました。これは、その生成時よりその染色体を複製するP. putidas 機能を示しています。
フローサイトメトリーによる解析は、微生物群集の進化を監視するため非常に役立っています。それは群集の動態をより多くのリソース集中的な分子法5,10よりはるかに近いを従うことができます。我々 は映画でこれらのダイナ ミックスを強調表示され、時間の経過とともに活性汚泥コミュニティ シフトの概要を得た。各 1 秒のフレームは、サンプル ポイント (補足ファイル 2) の FSC 対 DAPI 蛍光プロットを示しています。0 日目と 4 日目の間の非常に明確なシフトは 7 日後コアの共同体の設立が続いた。21 日目に追加サブコミュニティが思い付いた。サブコミュニティ レベルの微生物動態解析を有効なマスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立しました。実験のさまざまな段階で支配的なサブコミュニティは、CyBar ツール (図 3) を使用して明確に特定されました。興味深い (キーの時点でトリガーされる豊富で重要な変更) は、ゲートを選択するために助けたと実行可能な相対サブコミュニティ元素の分布とそれを組み合わせること (以上 5% 相対量) の並べ替え、さらに解析22。
工業規模バイオリアクター アプリケーション動揺制限のための潜在的な不に直面できます。彼らは頻繁にまた非合成基板の質の交替のような操作上のパラメーターを変更するのに公開されます。紀元前は、このようなシステムを表し、動的なプラグ流反応器で異なる場所からサンプリングされました。模範的なサンプル ポイントの DAPI 対 FSC 蛍光プロット (図 4) のみ少し空間が発音的異質性を示します。BC は両方を使用してさらに調べた、高速自動シックなより詳細なマスター ゲート テンプレート ベースの CyBar アプローチ。
自動で高速かつ公平な本来産業設定で現地管理バイオ プロセスのために特に興味深いシックをなります。すべての使用可能なサンプルの生 .fcs データを比較します。これらの比較の 2 つの図 5で表示されます。非類似度計算結果では、時空の不均一性に関する前の観察を確認してください。NMD 作成されたプロット フォーム シックなツールの非類似度行列 (図 6) はさらにこの結果を実証し、それに応じてそれを可視化します。
さらに、マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を使用して紀元前の 23 サブコミュニティの相対的な存在量を算出しました。微生物群集の機能の関係を理解する 48 サンプルを 1 年の期間からの相関分析を行った。これはさらなる調査 (4 セルの並べ替え) のための興味の門を識別するために助けることができます。非生物的パラメーターを正または負の強い相関が好き価が理解して生態系やバイオ テクノロジーの手法を最適化する助けることができる製品です。この相関関係 (図 7) に含まれている有機物負荷率は、このような非生物的パラメーターを例証します。G10、G4 G5 強い正の相関関係を展示し、G8 に負の相関がメタン生成アーキアの方にヒントがあります、おそらく、発酵種を含めることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> 図 1: 純粋培養のフローサイトメトリーによる解析の再現性です。FSC 対 DAPI の蛍光は、誤差 ± 1 標準偏差 (C, D) を表すしてコントロール ビーズ (A, B) とバーの 3 サブコミュニティ微量含有量 [%] のプロットを印刷します。相対的な存在量は、補助ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートから決定しました。A、B および C は、4 h で成長曲線の撮影された 3 つの生物学的複製と 3 技術的複製 P1、P2、P3 サンプル A から準備ができていたし、三度、それぞれ測定: M1、M2、M3 で彼らのそれぞれの標準偏差であります。50,000 イベントがセル ゲートに記録されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> 図 2: 成長カーブの時に撮影した純粋培養の細胞周期解析実験 (A) 以上 12 h..FSC 対 DAPI の蛍光は、指数関数的成長段階で DNA 量の変化を示す双方向時間サンプリングのプロットします。この測定シリーズは、ビーズ (補足ファイル 1 S3 を参照) には含まれません。(B).光密度ベースの成長曲線と誤差範囲 ± 1 標準偏差と、サブコミュニティの相対的な存在量を時間をかけて表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> 図 3: 活性汚泥の群集構造 24 日間にわたって進化。(A) flowCyBar 傾向の類似性によって並べられたそれぞれのゲートのひげで視覚化される周波数分布を重ねることで、対応するカラー キー (B) と NMD プロット ウィット R の類似性解析 < 0.001 (C). 基になるプロットが補足のファイル 2 のフィルム順序で表示されます。補足ファイル 1-S6 でゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> 図 4: 産業規模で微生物群集構造の空間的で、一時的な不均一性プラグ フローリアクター バイオガス。4 つの微生物群集構造の比較 (A) サンプリング ポート I ~ IV 223 日。(B) 日 384 ポートの 0 日から時間依存の社会構造の変化の比較 II。ノイズは、可視化を強化する遅ればせながら切断されています。250,000 イベントはセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で測定した.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> 図 5: フローサイトメトリーによるヒストグラム イメージ比較-シックな。シックなアルゴリズムの原理は、それぞれ時空の不均一性を表す 2 つのサンプルを比較することによって例証されます。(i) シックなイメージは、(FSC 対 DAPI 蛍光) を表示する 2 つのパラメーターを選択した後、.fcs ファイルから作成されます。グレースケール (0-255) のピクセルのイベント カウントをコードします。(セルが含まれる領域を指定した後 ii) シックなサブセットが生成されます (ここで: 200 < < 4000、200 x < < 2200 y)。(iii) XOR 組み合わせイメージがサブセット間のピクセルを比較することによって作成されます。差は 0 に等しく、黒として表示されます。差の最大値は 200 に等しい、白として表示されます。対応する XOR 値は、XOR イメージのすべてのピクセルのグレースケール値を追加することによって計算されます。(iv) オーバーレイの組み合わせイメージがサブセットのピクセルのグレースケール値を追加することによって作成されます。対応するオーバーレイの値は、ゼロにしないし、そのための情報が含まれているオーバーレイ イメージのピクセルを数えることによって計算されます。(v) 非類似度の値は、XOR とオーバーレイの値で除して計算されます。これらは、図 6の NMD のプロットのための基礎です。非類似度の値と両方 NMD のプロットをごくわずか空間- と顕著な一時的なコミュニティ不均質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> 図 6: シックに基づくバイオガスのコミュニティ サンプルの類似性解析します。0 日のサンプルは、歪曲的な分析 (補足ファイル 1 S11) 非常に異なるコミュニティ構造のためこのプロットから除かれました。NMD のプロットは、低空間についての仮定を確認する-より高い間的異質性シックなツールを使用して、図 5で説明します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> 図 7: バイオガス コミュニティ相関分析します。マトリックスはスピアマンの順位係数を算出したし、補足ファイル 1 S6 マスター ゲート テンプレートで決定された 23 のサブコミュニティの相対的な存在量に基づきます。1 年の期間からの 48 のサンプルの有機物負荷率 (OLR) と相関します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> 図 8: 浮遊性 (P) と汚泥の類似性解析による排水中 (S) コミュニティ。プライマリ浄水 (PCL) 活性化汚泥盆地 (AS) と本格的な廃水処理プラント (補足ファイル 1 - s10 ドット プロット) のダイジェ スター タンク (DT) から採取しました。補足ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。これらのサブコミュニティ元素 CyBar (補助ファイル 1-S10) と NMD を作成する flowCyBar ツールを使って解析したプロット (R < 0.01)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> 図 9: 純粋培養の固定安定性。0 h で撮影した成長曲線の実験からのサンプルは、15% のグリセロールの固定後は-80 ° C で 28 日間で格納されていました。FSC 対 DAPI の蛍光は、ビーズが表示されますコントロールして印刷します。計測のシリーズでは、ビーズ (補足ファイル 1 S3) は含まれません。50,000 イベントがセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で記録されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ファイル 1:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
2 の補足ファイル:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

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Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

JoVE Journal

Environment

11.8K ビュー.  Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ. フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

免疫・感染学

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

環境学

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

生物工学

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

生化学

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

医学

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body>スクロース分泌シアノバクテリアと真菌パートナーとの共培養のためのプロトコール

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

要約

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の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

フローサイトメトリーにおける枯草菌胞子の計数と標識解析の改善

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

要約

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の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

フローサイトメトリーにおける枯草菌胞子の計数と標識解析の改善