Name: anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

המחברים מודים לבנק אוניברסיטת Office של מחקר ותוכניות במימון על תמיכתם.

1. מכינים את המדיה לתרבות אנאירובית של קווי בתרבית של תאים שונים
<ol><li>
להפוך את המדיום PS-74656 מלאה עבור התרבות תאים אנאוקסיים25.
	<ol>
<li>להפוך את הפתרון מניות חנקיתי סטרילי (5 מ'; 100 x) על ידי המסת 17.25 גר' חנקיתי ב 50 מ של מים מזוקקים יונים, ואז לסנן לחטא זה.</li>
		<li>להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון מניות חנקיתי לכל 50 מ של גלוקוז נמוך DMEM (1 g/L של גלוקוז) עם 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 584 mg/L של נתרן פירובט, סרום שור עוברית 10% (FBS; לא פעיל-חום). הערה: השימוש FBS ריכוזים הגדול מ- 10% הם רעילים. ראוי לציין, סרטן התא בשורה אחת נבדק היו רגישות נמוכה עבור מדיה עם חנקיתי (מד א-MB-231, השד סרטן תאים בטור) והוא, לפיכך, גדל, בהעדר חנקיתי. בנוסף, למרות PS-74656 בינוני נתמך הגידול של כל הקווים תא שנבדקו (n = 9), וודאי שורות תאים (למשל, תאים Vero) הציג ריכוז גבוה של התא ואת הכדאיות גבוה יותר ב- PS-74656 עם גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) DMEM 25.</li>
		<li>מקום 20 מ"ל של מדיום שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ. אין לחזק את הכובע; זה צריך להיות חופשי.</li>
		<li>דה-גז המדיום על-ידי הצבת את הצינורית בתוך צנצנת ואקום-כ 45 ° זווית, להגדיל את שטח הפנים בינוני.</li>
		<li>החל ואקום באמצעות משאבת ואקום או שווה ערך, בטמפרטורת החדר. לשמור על שואב האבק עד בועות הם כבר לא נצפו (24-48 שעות).</li>
		<li>להסיר את הצינור מצנצנת וסגור מיד את הכיפה, איטום צינור כדי למזער את המבוא של אוויר לתוך האמצעי.</li>
		<li>מקם את הצינור בבית הבליעה אנאירובית מסחרי.</li>
		<li>שחרר את הצינורית ולאפשר את האווירה בצינור כדי equilibrate עם זה של תערובת הדלק אנאירובית בבית הבליעה לפחות 24 שעות. הערה: המדיום צריכים להישאר בחדר עד שהוא משמש. להאצת התהליך, סומק הצינור לפחות 3 x עם תערובת גז אנאוקסיים באמצעות פיפטה העברה סטרילי מלא גז אנאוקסיים, אשר מורכב של H2, CO2ו- N2-
</li>
		<li>דגה לכל הצינורות (10-15 דקות) ממוקמים בבית הבליעה אנאירובית כמתואר לעיל לפני איטום הצינור והצבת בבית הבליעה. לפני השימוש, לשטוף את זה עם תערובת גז אנאירובית באמצעות פיפטות העברה 1.5 – 2 מ"ל או טיפים פיפטה כי יש כבר סמוקות עם אנאוקסיים גז לפחות 3 x.</li>
		<li>בעוד בבית הבליעה אנאירובית, הוצא 100 µL של המדיום לרכבת התחתית מיקרו-צנטריפוגה degassed סטרילי ובדוק זה עבור החמצן המומס באמצעות בדיקה של חמצן בתוך החדר. הערה: האלקטרודה חמצן מכויל לכל פרוטוקול של היצרן לפני השימוש. קריאות של התקשורת תערובת גז אנאירובית כראוי degassed ו equilibrated הם 0. התראה: אם הקריאות מעל 0.3 ppm של חמצן, להמשיך דגירה התקשורת בבית הבליעה אנאירובית מאז נדרש יותר זמן equilibrate של המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אנאוקסיים טיפוח של קווים בתרבית של תאים שונים
<ol><li>
ביום המיועד-1
	<ol>
<li>לגדול תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) בבקבוקון T150 90% זרימה עבור הפקד תרבות אנאוקסיים ו- normoxic לספק מספר מספיק של תאים עבור 24-ובכן שלושה לוחות (80% זרימה). הערה: במחקר זה, תאים הלה 229 ו- Vero שימשו. פרוטוקול זה היה גם נבדק, עלתה יפה הצמיחה ותחזוקה של שבעה אחרים תא שורות25.</li>
		<li>להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה, לשטוף אותו עם 10 מ"ל של HBSS.</li>
		<li>החלף את המדיום עם 5 מ של טריפסין. להתסיס את הבקבוק עד התאים נובע באופן חזותי הפלסטיק. תשאף רוב טריפסין, ולאחר מכן הקש את הבקבוקון מכך התאים חסיד. להוסיף 10 – 15 מ של גלוקוז גבוהה DMEM (4.5 g/L של גלוקוז, 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 10% FBS, 50 µg/mL של גנטמיצין) כדי להשבית את טריפסין.</li>
		<li>Triturate התאים באמצעות פיפטה 25 מ ל עד כל תא גושים הם שיבשו.</li>
		<li>לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות את hemocytometer הרגיל, שיטת הדרה trypan צבע כחול או המקבילה אוטומטית.</li>
		<li>להשעות התאים גלוקוזה גבוהה DMEM כאמור לעיל את צפיפות התאים של 2.24 x 105 תאים למ"ל.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של התליה תא הבארות של צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (2.24 x 105 תאים/טוב; 80% זרימה). צלחת זרע 1 עבור התרבות אנאוקסיים ואחר עבור פקד normoxic תרבות.</li>
		<li>דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים normoxic (5% CO2) במשך 24 שעות ביממה. הערה: יכול להיות מצופה התאים בתוך צלחות היטב בגדלים שונים. עם זאת, זריעת תאי לצמיחה אנאוקסיים ב מבחנות מסתכנת המבוא של חמצן למערכת, אלא אם כן טיפול וננקט לחשוף לחלוטין גז באטמוספירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום המיועד 0
	<ol>
<li>לאחר 24 שעות של normoxic הדגירה, למקם את הצלחות לצמיחה אנאוקסיים תא אנארובי (תא אנארובי מסחרי; איור 1).</li>
		<li>מיד לשנות את המדיום לבינונית תרופתיים נודף דה-גז PS-74656 אשר יש כבר שאמבטיה במשך 24 שעות ביממה אל התא אנאירובית. מקם את הצלחת במיכל עם מגבת, באופן רופף לסגור אותו כדי לשמור על הלחות. הערה: הלוחות לצמיחה normoxic מטופלים באופן זהה עם היוצא מן הכלל אשר כל הטיפולים נעשים תחת תנאים אטמוספיריים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביום המיועד 1
	<ol>
<li>יום 1 של הדגירה אנאירובית מתחיל לאחר 24 שעות של הדגירה בבית הבליעה אנאירובית מסחרי אשר מכיל תערובת גז אנאירובית סטנדרטי של 10% H2, 10% CO2ו- 80% N2.</li>
		<li>תקופת דגירה התאים בפרקי זמן שונים.</li>
		<li>נטר אמצעי אנאירובית עבור שינוי הצבע לאורך זמן. הערה: שינוי צבע של אדום כתום מגנטה אותות הזמן לשנות את המדיום. זה יכול לקחת עד שבועיים להתרחש. שינוי צבע במדיום של אדום כתום לצהוב מעיד על קיומם של זיהום חיידקי.</li>
		<li>כאשר המדיום משתנה מאדום מגנטה, להסיר את התאים runagate על ידי השאיפה.</li>
		<li>המקום התקשורת בילה aspirated עם תאי runagate degassed ואנאירוביים גז equilibrated microfuge צינורות, קרוב הצינורות תוך הקפדה כי החותם הוא מאובטח, ואז centrifuge אותם (326 x g; בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות). מיד להחליף את המדיה aspirated בבאר 1 מ"ל של מדיום חדש PS-74656 degassed.</li>
		<li>מקם את הצינור microfuge עם תאים מגורען בבית הבליעה אנאירובית לפני פתיחתה. האחות המדיום בילה ולהחליפו טריים בינוניים PS-74656 degassed הנפח הכולל של 1 מ"ל בצינור microfuge.</li>
		<li>להחזיר את התאים מהצינור באר בצלחת תרביות רקמה 24-. טוב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הערכה של התא פנוטיפי בידול באמצעות מיקרוסקופ של תאים בתרבית Anaerobically
<ol><li>
בעוד בבית הבליעה אנאירובית, למקם את הצלחת בקופסה לסגירה חוזרת סמוקות עם תערובת גז אנאירובית ולסגור את תיבת. הערה: תיבת להכיל במגבת נייר לחה כדי לספק לחות ולמנוע את הצלחת ממנו להתייבש. מיקרוסקופ, בשקיות סנדוויץ עובד הכי טוב מאז שהם דקים.<ol>
<li>כדי לבחון את התאים במיקרוסקופ, לחלוטין לסגור את התיק, להסיר אותו מן החדר.</li>
		<li>בזהירות למתוח את שקית הניילון יניף, בוחנים תאים באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב הפוך עם הקובץ המצורף מצלמה ולקחת photomicrographs-הגדלה שונות.</li>
		<li>להחזיר את הצלחת בשקית אטומה לתא ולהמשיך הדגירה כפי שמתואר בשלב 2.3.3.</li>
		<li>כדי לנתח בנפרד התאים runagate הם ההשעיה, בצע את השלבים המתוארים שלב 2.3.5. הערה: תאים אלה יכולים לשמש לאחר מכן לבדיקה אירובי או שאפשר יהיה להחזיר את תא אנארובי לבדיקה של אוכלוסייה מסוימת זו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+tumours:+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants?.">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?.</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors.">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li><li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+microbiota:+its+role+in+health+and+disease.">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li><li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells.">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells.">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423 (1977).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer.">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>D&#246;me, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., T&#243;v&#225;ri, J., T&#237;m&#225;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Vascularization+Mechanisms+in+Cancer.">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1&#945;+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1&#945; in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)alpha:+its+protein+stability+and+biological+functions.">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li><li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etaypoxia-inducible+factor-1alpha,+von+Hippel-Lindau+protein,+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva.">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li><li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat.">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307 (2017).</li><li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+Ethanol+Pathway+in+Carp+Following+Exposure+to+Anoxia.">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).</li><li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment.">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li><li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+toxicity+induced+by+anticancer+agents+in+cardiomyocyte+culture.">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li><li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes.">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite:+NO+reductase.">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance.">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li><li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria.">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li><li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase.">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li><li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis.">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li><li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability.">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li><li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture.">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה זו מייצגת בפעם הראשונה בתרבית של תאים היו תרבותי לתקופות ממושכות של זמן בהעדר חמצן. על סמך תצפיות הנוכחי, הצמיחה אנאוקסיים יכולת דרך שביל fermentative נראה אוניברסלי בין תאים בתרבית של שורות28, שבו הגידול אנאירובית, גרמו פנוטיפ גאוס. זה נצפתה עבור כל השורות תא נבדק. עם טיפוח...

קיימים תאים של גידולים מוצקים, נישות תאי גזע אלה המצפים את המשטחים הרירית בסביבות חווים רמות חמצן מופחתת, כולל אנוקסיה1,2,3,4. בארצות הפיזיולוגיות נורמלי, חמצון משתנה מעבר לזה של היפוקסיה אנוקסיה (העדר מוחלט של חמצן)5,6. ההבנה כי חמצן אטמוספרי משפיע לרעה על שכפול בתרבית של תאים, את צמיחת תאים במבחנה ניתן למטב בתנאים חמצן מדולדל דווח בשנות השבעים המוקדמות. . ריכטר ואח 7 הראה כי רמות החמצן (היפוקסיה)-1-3% משופרת ציפוי יעילות לעומת חמצן אטמוספרי (20%). תוחלת החיים של האדם תא דיפלואידי נמתח גם התנאים תרבות ובשפתיים8.
In vivo, תנאים ובשפתיים להתרחש כאשר חנויות חמצן מדולדל (למשל, במהלך פעילות גופנית אינטנסיבית), שבו ייצור ATP הוא החליף בשריר השלד של נשימה אירובית כדי התסיסה (נשימה אנאירובית) עם המוצר הסופי של חומצה לקטית9. פתולוגית, בגידולים סרטניים, הפנים של הגידול בנפח גדול הוא ובשפתיים כדי אנאוקסיים בשל עניים vascularization10. השפעת זלוף מוגבלת על הגידול פנים תאומת באופן עצמאי על-ידי הגידול פנים בידי אווירני anaerobes1. Mechanistically, גידול התא הישרדות היפוקסיה נחשב להיות תלויים אך ורק הביטוי של הגן גורם היפוקסיה-inducible 1-אלפא (HIF1-alpha), וזו התגובה הספונטנית הראשונית היפוקסיה4,11 , 12. HIF1-אלפא הנגרמת מחוסר חמצן בתנאים על ידי חלבוני הלם חום לאגד את HIF1-מקדם אלפא ו upregulate שעתוק גנים12. אלו חלבונים הלם חום הם האמינו כדי לסייע אינדוקציה של פנוטיפים שונים אצל microenvironment שתקבעו הגידול. אלה פנוטיפים התערוכה ביטוי מוגבר של קרום התא הגלוקוז למעליות, הקצב של גליקוליזה (אפקט ורבורג)13. התוצאה היא מתג מ מיטוכונדריאלי זרחון חמצוני כדי לקטט תסיסה.
הישרדות אנאוקסיים יכולים לנצל גם חלופות גלוקוז כדי לתמוך את התופעה14,של הישרדות15. הדוגמה יונקים למד בצורה הטובה ביותר היא העכברוש השומה, אשר יכול לשרוד במשך כמעט 20 דקות בלי חמצן דרך מסלול מונחה פרוקטוז תסיסה glycolytic14. עיבוד חלופיות מתרחשת אצל דגים מסוימים (למשל, קרפיון [קרסיוס sp.], אשר יכול לשרוד באופן משמעותי יותר פרקי זמן שימוש גליקוליזה עם אתנול תוצר לוואי מסוף)15. בשני המקרים, תסיסה מניע את חילוף החומרים הפעלת הישרדות בהיעדר חמצן. ההשערה הנוכחי להישרדות אנאוקסיים זה כל כך הרבה זמן כמו HIF1-אלפא מופעל במהלך היפוקסיה, נשימה מיטוכונדריאלי, ללא צורך חמצן, מתרחשת תחת תנאים אנאירוביים16. יתר על כן, זה הוא שמהווה השימוש שביל fermentative להישרדות ובשפתיים/אנאוקסיים משפר הישרדות הגידול מאז התאים למנוע סטרס חמצוני, אשר יכול להוכיח להיות מזיקה הישרדות תא17. אקסיומת זה נתמך על ידי מחקר שנערך לאחרונה, אשר מראה כי בעוד cardiomyocytes, היפוקסיה מפחית את הלחץ חמצוני על ה תא הגידול17.
עד כה, מהות חיוני שביל fermentative להישרדות אנאוקסיים בתרבית של תאים יש כבר טבוע עמוק בספרות, בשל, במידה רבה, עד לחוסר בתאים בתרבית של תרבות העדר מוחלט של חמצן במשך יותר מ- 3 ימים. עם זאת, אלטרנטיבה גליקוליזה למען הישרדות אנאירובית מתרחשת אצל חיידקים. בחיידקים מסוימים, חנקן או סולפט (בין תרכובות אחרות) יכול לשמש acceptors אלקטרון מסוף עבור מערכת ציטוכרום אוקסידאז בהיעדר חמצן18. למרות ההתפתחות בקטריאליים ו האיקריוטים התרחשה במקביל מאז מתפצל מן האב נפוצות הקדמון, ההערכה היא כי המיטוכונדריה שאתם מספקים אנרגיה לתאים 1.542 מיליון שנה לפני חמצון של האוקיינוסים19 . מאז חוקרים יש הראו כי המיטוכונדריה מבודד יכול לייצר ATP בהעדר חמצן, עם חנקיתי כמו מקבל אלקטרון מסוף, סביר להניח כי תאים שיכלה לשמש לפרקי זמן ארוכים יותר מ-3 ימים בהיעדר חמצן 20 , 21 , 22 , 23. המתודולוגיה המתוארים במחקר זה יש כלי הגידול אנאירובית בתרבית של תאים של שורות תאים רבים.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

ביותר הרירית משטחים יחד עם האמצע בין גידולים בתאי גזע נישות הם אזורים גיאוגרפיים של הגוף שאינן אנאוקסיים. מחקרים קודמים מראים כי הדגירה ב- normoxic (5% CO2 באוויר) או מחוסר חמצן (רמות חמצן נמוכות) תנאים ואחריו תוצאות אנאוקסיים דגירה (היעדרות של חמצן חופשי) ב מוגבלת הכדאיות (2-3 ימים). מתודולוגיה הרומן פותחה המאפשרת של הטיפוח סלולריים אנאוקסיים (עבור פחות 17 ימים; משך הזמן המרבי נבדק). ההיבט הקריטי ביותר של מתודולוגיה זו היא להבטיח כי אין חמצן הוא הציג לתוך המערכת. זה מתקבל על ידי degassing של התקשורת, ועל ידי צינורות שטיפה, מאכלים, מבחנות, פיפטות עם תערובת גז אנאירובית (H2, CO2, N2) ואחריו המתיר את החומרים כדי equilibrate לסביבה (ללא חמצן) אנאוקסיים לפני השימוש. טיפול נוספים החייבים אימון בעת רכישת photomicrographs על מנת להבטיח כי micrographs שהושגו אינם מכילים ממצאים. בהעדר חמצן, מורפולוגיה תאים זה שינו באופן משמעותי. שני morphotypes נפרדים מצוינים עבור כל התאים תוצרת anaerobically. ניתן להחיל את היכולת לגדול ולתחזק בתרבית של תאים, בהעדר חמצן לניתוח של פיזיולוגיה של התא polymicrobial אינטראקציות, אפיון biosynthetic הוחלף נגזר מסלולים עבור פיתוח תרופות הסרטן הרומן.

הכוח של פרוטוקול זה שקרים תמיכתה תוחלת החיים וגידול של שורות תאים מרובים, ההכרה כי יש שינוי מעמיק עם סטייה מורפולוגיה תא25. האלמנט הקריטי ביותר של מחקר זה היא העברת תחזוקת התאים תחת anaerobiosis קפדנית. פעולה זו דורשת תא אנארובי מאורגנת על מנת למקסם את הפרוטוקול (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת טיפוח לטווח ארוך אנאירובית של שורות תאים הוקמה. הזמן המרבי הישרדות שבו נבדקה הוא 17 ימים. שיטה זו מתאימה בדיקה של סוכנים ציטוטוקסיות, חקר הפיזיולוגיה של anoxically שכפול התאים.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

anaerobic-growth-and-maintenance-of-mammalian-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Midwestern University. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת טיפוח לטווח ארוך אנאירובית של שורות תאים הוקמה. הזמן המרבי הישרדות שבו נבדקה הוא 17 ימים. שיטה זו מתאימה בדיקה של סוכנים ציטוטוקסיות, חקר הפיזיולוגיה של anoxically שכפול התאים.

Video: Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medicine

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengineering

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Biochemistry

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Immunology and Infection

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

קצירת שרירי שלד עכברים לתרבית תאי גזע והנישה שלהם

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

מחבר זרקור: פרוטוקול Ex Vivo לטיפוח תאי גזע שריר שקטים עם רכיבי נישה 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

רביה של

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע