Os autores agradecer o centro-oeste Universidade escritório de pesquisa e programas patrocinados pelo seu apoio.

1. preparar a mídia para cultura anaeróbia de várias linhas de células de mamíferos
<ol><li>
Fazer o meio de PS-74656 completo para uma cultura de célula anóxica25.
	<ol>
<li>Faça a solução estoque de nitrito estéril (5m; x 100) dissolvendo 17,25 g de nitrito em 50 mL de água destilada deionizada e, em seguida, filtrar para esterilizá-lo.</li>
		<li>Adicionar 0,5 mL da solução estoque de nitrito por 50 mL de glicose baixa DMEM (1 g/L de glicose) com 110 mg/L de L-glutamina, 584 mg/L de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino (FBS; inactivadas pelo calor). Nota: O uso de concentrações de FBS maiores do que 10% são tóxicos. Digno de nota, uma linhagem de células de câncer testada tinha uma baixa tolerância à mídia com nitrito (MDA-MB-231, linha de células de câncer de mama) e, assim, foi cultivada na ausência de nitrito. Além disso, embora o PS-74656 médio suportado o crescimento de todas as linhas de células que foram testadas (n = 9), certas linhas de células (por exemplo, células Vero) exibiram concentrações mais elevadas de célula e uma maior viabilidade no PS-74656 com glicose alta (4,5 g/L) DMEM 25.</li>
		<li>Coloca 20 mL do meio em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL. Não aperte a tampa; deve ser solto.</li>
		<li>De gás do meio, colocando o tubo em uma redoma de vidro a vácuo em um ângulo de 45 ° aproximadamente, para maximizar a área de superfície média.</li>
		<li>Aplica um vácuo usando uma bomba de vácuo, ou seu equivalente, à temperatura ambiente. Manter o vácuo até que as bolhas já não são observadas (24-48 h).</li>
		<li>Retire o tubo do frasco e fechar imediatamente a tampa, vedação do tubo para minimizar a introdução de ar no meio de.</li>
		<li>Coloca o tubo na câmara anaeróbica comercial.</li>
		<li>Solte a tampa do tubo e permitir que a atmosfera no tubo para equilibrar com o da mistura de gás anaeróbio na câmara pelo menos 24 h. Nota: O meio deve permanecer na câmara até é usado. Para acelerar o processo de descarga, tubo de pelo menos 3 x com a mistura de gás anóxica usando uma pipeta de transferência estéril cheia de gás anóxico, que consiste de H2, CO2e N2.
</li>
		<li>Desgaseifica todos os tubos (10-15 min) colocados na câmara anaeróbica, como descrito acima, antes da selagem do tubo e colocar na câmara. Antes da utilização, nivelá-lo com a mistura de gás anaeróbio usando pipetas de transferência de 1,5-2 mL ou pontas de pipetas que tem sido lavadas com anóxica gás pelo menos 3x.</li>
		<li>Enquanto na câmara anaeróbica, remover 100 µ l do meio de um tubo estéril de microcentrífuga desgaseificado e testá-lo para o oxigênio dissolvido usando uma sonda de oxigênio dentro da câmara. Nota: O eletrodo de oxigênio é calibrado por prévia de protocolo do fabricante para usar. Leituras da mídia mistura gás anaeróbio corretamente desgaseificado e equilibrada são 0. Atenção: Se as leituras estiverem acima de 0,3 ppm de oxigênio, continue a incubar os meios de comunicação na câmara anaeróbica, já que mais uma vez para equilibrar o meio é necessária.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anóxico cultivo de várias linhas de células de mamíferos
<ol><li>
Designado dia -1
	<ol>
<li>Desenvolvem-se células (37 ° C, 5% CO2) num balão T150 a confluência de 90% para o controle de cultura anóxica e normoxic fornecer um número suficiente de células para três placas de 24 poços (80% confluência). Nota: Para este estudo, foram utilizadas células HeLa 229 e Vero. Este protocolo também foi testado e provou ser bem sucedido para o crescimento e a manutenção de sete outras células linhas25.</li>
		<li>Remover o meio do balão por aspiração e lavá-lo com 10 mL de HBSS.</li>
		<li>Substitua o meio com 5 mL de tripsina. Agite o frasco até que as células visualmente desanexar do plástico. Aspire a maior parte da tripsina, em seguida, toque o balão para desalojar as células aderentes. Adicionar 10 a 15 mL de glicose alta DMEM (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de L-glutamina, 10% FBS, 50 µ g/mL de gentamicina) para inactivar a tripsina.</li>
		<li>Triture as células usando uma pipeta de 25 mL, até que todos os grupos de célula são rompidos.</li>
		<li>Contar as células e determinar a viabilidade usando o padrão hemocytometer e o método de exclusão do corante azul de Tripan ou o equivalente automatizado.</li>
		<li>Suspenda as células a glicose alta DMEM como mencionado acima, a densidade celular de 2,24 x 105 células/mL.</li>
		<li>Adicione 1 mL da suspensão celular aos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (2,24 x 105 células/poço; 80% confluência). Placa de semente 1 para a cultura anóxica e outro para uma cultura de normoxic de controle.</li>
		<li>Incube as células a 37 ° C em condições de normoxic (5% CO2) por 24 h. Nota: As células podem ser chapeadas em várias placas bem dimensionadas. No entanto, semear as células de crescimento anóxica em balões corre o risco de introdução de oxigênio no sistema, a menos que cuidado para limpar completamente o gás atmosférico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Designado dia 0
	<ol>
<li>Após 24h de incubação a normoxic, colocar as placas para o crescimento anóxica na câmara anaeróbia (uma câmara anaeróbica comercial; A Figura 1).</li>
		<li>Imediatamente altere o meio para sem antibióticos de intoxicar médio PS-74656 que tem sido aclimatado para 24h à câmara anaeróbica. Colocar a placa em um recipiente com uma toalha úmida e vagamente fechá-lo para manter a umidade. Nota: As placas de crescimento normoxic são manipuladas com a exceção de que todos os tratamentos são feitos sob condições atmosféricas de maneira idêntica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Designado dia 1
	<ol>
<li>1 dia de incubação anaeróbica inicia após 24h de incubação na câmara anaeróbica comercial que contém a mistura de gás anaeróbio padrão de 10% H2, 10% CO2e 80% N2.</li>
		<li>Incube as celulas por vários períodos de tempo.</li>
		<li>Monitore o meio anaeróbio para a mudança de cor ao longo do tempo. Nota: Uma mudança de cor do vermelho-alaranjado para magenta sinaliza o tempo para mudar o meio. Isto pode demorar até 2 semanas para ocorrer. Uma mudança de cor no meio de vermelho-laranja para amarelo indica a presença de uma contaminação bacteriana.</li>
		<li>Quando o meio muda de vermelho para magenta, remova as células runagate por aspiração.</li>
		<li>Lugar aspirada mídia gastava com as células runagate desgaseificado e anaeróbia gás incubado tubos de microcentrífuga, feche os tubos ao mesmo tempo certificando-se que o selo é seguro e em seguida centrifugá-los (326 x g; à temperatura ambiente durante 10 minutos). Substitua imediatamente os meios de comunicação aspirados no poço com 1 mL de meio de PS-74656 desgaseificado novo.</li>
		<li>Coloca o tubo de microcentrífuga com células peletizadas na câmara anaeróbia antes de abri-lo. Aspirar o gasto médio e substituí-lo por meio de PS-74656 desgaseificado fresco para um volume total de 1 ml no tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Retorno as células do tubo para um poço na placa de cultura de tecidos de 24-bem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. avaliação da diferenciação fenotípica celular pela microscopia de pilhas cultivadas anaerobicamente
<ol><li>
Enquanto na câmara anaeróbica, colocar a placa numa caixa resealable liberada com a mistura de gás anaeróbio e fechar a caixa. Nota: A caixa deve conter uma toalha de papel úmida para fornecer a umidade e impedir que a placa de secagem. Para a microscopia, sacos do sanduíche o melhor trabalham desde que eles são finos.<ol>
<li>Para observar as células sob o microscópio, completamente selar o saco e removê-lo da câmara.</li>
		<li>Cuidadosamente esticar o saco de plástico sobre a placa, examinar células usando um microscópio de contraste de fase invertido com o acessório de câmera e levar fotomicrografias em várias ampliações.</li>
		<li>Devolve a chapa no saco selado para a câmara e continuar a incubação, conforme descrito na etapa 2.3.3.</li>
		<li>Para analisar separadamente as células runagate que estão em suspensão, siga as etapas descritas na etapa 2.3.5. Nota: Estas células podem ser usadas para o teste aeróbio ou podem ser devolvidas à câmara anaeróbia para o teste desta população específica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este método representa pela primeira vez células mamíferas que foram cultivadas por longos períodos de tempo na ausência de oxigênio. Baseado nas observações atuais, o crescimento anóxica capacidade através de um caminho não-fermentativa parecem ser universal entre linhas de células de mamíferos28, onde o crescimento anaeróbico resultou em divergência de fenótipo. Isto foi observado para todas as linhas celulares testadas. Com o cultivo de anaeróbio, aumentar as proporç?...

Existem células de tumores sólidos, nichos de células-tronco e aqueles que revestem as superfícies mucosas em ambientes que experimentam níveis reduzidos de oxigênio, incluindo anóxia1,2,3,4. Em Estados fisiológicos normais, oxigenação varia além da hipóxia, anóxia (completa ausência de oxigênio)5,6. A realização que oxigênio atmosférico afeta negativamente a replicação de células de mamíferos e o crescimento de células em vitro pode ser otimizado sob condições de oxigênio empobrecido foi relatada na década de 1970. Richter et al . 7 mostrou que 1-3% dos níveis de oxigênio (hipóxia) reforçada chapeamento eficiência em comparação com o oxigênio atmosférico (20%). A expectativa de vida de célula diploide humana também é estendida na cultura hipóxica condições8.
In vivo, hipóxicos condições ocorrem quando oxigênio lojas estão esgotados (por exemplo, durante o exercício intenso), no qual a produção de ATP é alternada no músculo esquelético da respiração aeróbia de fermentação (respiração anaeróbia) com o produto final de ácido láctico9. Patologicamente, em tumores cancerosos, o interior do tumor, massa é hipóxica para anóxica devido à pobre vascularização10. O efeito da perfusão limitada no interior do tumor independente é validado pelos interiores de tumor colonizadas por anaeróbios obrigatórios1. Mecanicamente, a sobrevivência de células de tumor em hipóxia é pensada para ser unicamente dependente da expressão do gene hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF1-alfa), que é a resposta inicial espontânea de hipóxia4,11 , 12. HIF1-alfa é induzida em condições de hipóxicos por proteínas de choque do calor que ligam o HIF1-alfa promotor e upregulate de transcrição do gene12. Estas proteínas de choque do calor são acreditadas para ajudar na indução dos vários fenótipos visto no microambiente hipóxico do tumor. Estes fenótipos apresentam um aumento da expressão dos transportadores de glicose a membrana celular e a taxa de glicólise (o efeito Warburg)13. O resultado é um interruptor da fosforilação oxidativa mitocondrial para fermentação de lactato.
Anóxica sobrevivência também pode utilizar alternativas para glicose para apoiar o fenômeno de sobrevivência14,15. O melhor exemplo de mamíferos estudado é a toupeira, que podem sobreviver por quase 20 min sem oxigênio através de uma fermentação glicolítico orientado a frutose via14. Uma alternativa adaptação ocorre em certos peixes (por exemplo, carpa [SP.Carassius ], que pode sobreviver por significativamente mais períodos de tempo usando a glicólise com etanol como subproduto o terminal)15. Em ambos os casos, a fermentação impulsiona o metabolismo, permitindo a sobrevivência na ausência de oxigênio. A hipótese atual para sobrevivência anóxica é que tanto tempo como HIF1-alfa é ativado durante a hipóxia, respiração mitocondrial, sem a necessidade de oxigênio, ocorre sob condições anaeróbicas16. Além disso, postula-se que o uso de uma via fermentativa para sobrevivência hipóxica/anóxica aumenta sobrevivência do tumor, desde que as células evitar stress oxidativo que poderia para ser prejudicial para a célula de sobrevivência17. Este postulado é suportado por um estudo recente que mostra que em cardiomyocytes, hipóxia reduz o estresse oxidativo, colocado sobre o tumor de célula17.
Até à data, a natureza essencial de uma via fermentativa para a sobrevivência da pilha mamíferas anóxica tem sido entranhada na literatura, devido, em grande parte, a uma incapacidade de células de mamíferos de cultura na ausência completa de oxigênio por mais de 3 dias. No entanto, uma alternativa à glicólise para a sobrevivência anaeróbica ocorre em bactérias. Em certas bactérias, nitrogênio ou sulfato (entre outros compostos) pode servir como aceitadores de electrões terminal para o sistema do citocromo oxidase na ausência de oxigênio18. Embora a evolução bacteriana e eucariótica ocorreu em paralelo desde divergindo o último ancestral comum universal, estima-se que as mitocôndrias foram fornecendo energia para as células para 1,542 milhões de anos antes da oxigenação dos oceanos19 . Desde que os pesquisadores têm mostrado que as mitocôndrias isoladas podem produzir ATP na ausência de oxigênio, com nitrito como o aceitador terminal do elétron, é razoável supor que as células poderiam funcionar por períodos de tempo mais de 3 dias na ausência de oxigênio 20 , 21 , 22 , 23. a metodologia descrita neste estudo tem uma utilidade para o crescimento da pilha mamífera anaeróbico de numerosas linhas de célula.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

Mais superfícies mucosas, juntamente com os pontos médios em tumores e nichos de células-tronco são áreas geográficas do corpo que são anóxica. Estudos anteriores mostram que a incubação em normoxic (5% CO2 no ar) ou hipóxia condições (baixos níveis de oxigênio) seguiram por um resultados de incubação anóxica (ausência de oxigênio livre) na viabilidade limitada (2 – 3 dias). Uma nova metodologia foi desenvolvida que permite a um cultivo celular anóxica (pelo menos 17 dias, o tempo máximo testado). O aspecto mais importante desta metodologia é garantir que não há oxigênio é introduzido no sistema. Isso é obtido, a desgaseificação de mídia e por tubos de irrigação, pratos, balões e pipetas com uma mistura de gás anaeróbio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que os materiais para equilibrar ao ambiente anóxico (não-oxigênio) antes do uso. Cuidados adicionais devem ser exercido quando adquirir fotomicrografias para garantir que as micrografias obtidas não contêm artefatos. Na ausência de oxigênio, a morfologia celular é significativamente alterada. Dois morfotipos distintos são anotados para todas as células cultivadas anaerobicamente. A capacidade de crescer e manter pilhas mamíferas na ausência de oxigênio pode ser aplicada à análise da fisiologia celular, interações polymicrobial e a caracterização das vias biossintéticas para desenvolvimento de drogas câncer romance.

A força deste protocolo encontra-se em seu apoio a longevidade e o crescimento de várias linhagens celulares e o reconhecimento de que há uma alteração profunda e divergência na morfologia celular25. O elemento mais crítico deste estudo é a transferência e a manutenção das células sob anaerobiose estrita. Isto requer uma câmara anaeróbica organizada para maximizar o protocolo (Figura 1) e a garantia de que as células rem...

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Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

Aqui, descrevemos um novo método que permite o cultivo de longo prazo anaeróbico de linhagens celulares estabelecidas. O tempo máximo de sobrevivência que foi testado é 17 dias. Este método é adequado para o teste de agentes citotóxicos e explorando a fisiologia da anoxically replicação de células.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.0K visualizações.  Midwestern University. Aqui, descrevemos um novo método que permite o cultivo de longo prazo anaeróbico de linhagens celulares estabelecidas. O tempo máximo de sobrevivência que foi testado é 17 dias. Este método é adequado para o teste de agentes citotóxicos e explorando a fisiologia da anoxically replicação de células.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medicina

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengenharia

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Bioquímica

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Imunologia e Infecção

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Biologia

Colheita do músculo esquelético de camundongos para cultivar células-tronco e seu nicho

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Autor em destaque: Protocolo Ex Vivo para Cultura de Células-Tronco Musculares Quiescentes com Componentes de Nicho 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

Resumo

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Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

Propagação de

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco