תפקידן של מתכות המעבר בהתפתחות היונקים אינו מוערך כראוי. ראיות המתעוררים מראים כי הונוסטזיס מתכת ממשיך להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של תאים ורקמות. יתר על כן, היעדים הסלולריים הספציפיים של מתכות גם זנים בפיתוח, וכמובן, זה מאתגר לזהות את מיקומם.
עד כה פותחו טכניקות אנליטיות שונות לכימות מתכות, אך רובן יקרות או בלתי נגישות. מחקר אינטנסיבי מתמקד בשיפור קביעות המתכת בצורה נגישה ויעילה יותר. ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית של תנור גרפיט, GF-AAS, יש שני יתרונות עיקריים.
הוא מספק מגבלות נמוכות של זיהוי עבור אבץ, המאפשר ניתוח אבץ עקבות מדויק. זוהי גם טכניקה שאינה דורשת כמויות גבוהות של מדגם, microliters של פתרון נוטים להיות מספיק כדי לבצע את הניתוח. השילוב של שני יתרונות אלה הופך את GF-AAS לאידיאלי לניתוח רכיבי מעקב בדגימות בנפח נמוך.
מספר מצבים פתולוגיים אנושיים קשורים לחוסר איזון מתכתי. כמה דוגמאות הן אנמיה, אקרובמטיטיס enteropathica, ומחלות וילסון ומנקס. לכן, חשוב לפתח שיטות יעילות ואמינות למדידת רמות מתכות המעבר בדגימות ביולוגיות עם רגישות ודיוק גבוהים.
GF-AAS היא דוגמה מצוינת על טכנולוגיה המאפשרת קביעה של כל מתכת נתון בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, במקרים פתוגניים. השיטה מאוד רב-תכליתית. זה יכול להיות מיושם על מערכות רבות ורכיבים רבים יכולים להיות ניתוח באמצעות GF-AAS.
האתגרים הם לקבוע את מגבלת השיטה של זיהוי במציאות, ולוודא כי הדגימות נופלות בתוך מגבלה זו. בהתחשב בעובדה כי נפח הדגימות הוא נמוך, אין הרבה מקום לבדיקה, כך בזהירות בדיקה של נתונים צריך להתקיים מההתחלה. לאחר הניתוח הראשון של דגימות, אנחנו צריכים לקבוע מה הוא גורם הדילול הדרוש כדי להביא את הדגימות למגבלות הנדרשות לכימות.
ודא כי אתה יכול לשבר את הגרעינים כראוי לפני שאתה הולך AAS. כתמים מערביים הם תמיד אימות טוב לפני הניתוח הספקטרוסקופי. בעוד GF-AAS דורש אמצעי אחסון נמוכים, מאגרים תאיים נמצאים באמצעי אחסון נמוכים כבר.
זה נותן מעט מקום לבדיקות. המדידות הראשונות צריכות להיעשות בקפידה ולבדוק, כך שניתן למזער את הטיפול המדגם לגורם דילול אחד. כדי להתחיל, תרבות התאים של עניין 55 צלחות סנטימטר מרובע.
השתמש במלכודת ואקום כדי לשאוב את המדיה התרבותית. הקפד להסיר את כל עקבות המדיה. השתמש PBS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום כדי לשטוף את התאים מנקודות הזמן הרצויות, או תנאי תרבות, שלוש פעמים.
לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של קרח קר PBS לצלחת, ולגרד את התאים מהצלחת. העבר את מתלי התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולשמור אותו על קרח. צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G, ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה.
אם ניתוח מתכת של שברים ציטופלסמיים וגריניים רצוי, תן שימוש חוזר לכדור התא ב-400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח המכיל 0.1%NP-40, חומר ניקוי לא יוני. מעבירים 100 מיקרוליטרים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש כדגימה של התא כולו, ומאחסנים אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבודד גרעינים, השתמש בקצה מיקרופיפיט P1000 כדי לפעום את ההשעיה של תא 400 מיקרוליטר למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים על קרח.
לאחר מכן, לחלץ חמישה microliters של ההשעיה התא ולהעביר אותו לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. מניחים את חמשת המיקרוליטרים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה של פי 40 כדי לאמת את שלמות הגרעינים. צנטריפוגה הנותרים 395 תא microliter lysate השעיה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G.Transfer supernatant המכיל את השבר הציטוסולי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של PBS המכיל 0.1%NP-40 כדי לשטוף את גלולה עם שבר גרעיני, ו צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G.Remove את supernatant, ו resuspend גלולה המכילה את הגרעינים ב 100 מיקרוליטרים של אותו פתרון. כדי ללקט את התאים, השתמש בביורופטור כדי להפוך את התא כולו ואת הגרעינים המכילים פתרון שלוש פעמים, כל אחד במשך חמש דקות. המשך לבצע בקרת איכות של טוהר השברים על ידי כתם מערבי, באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור שברים גרעיניים או ציטוסוליים.
ראשית, להוסיף נפח שווה של חומצה חנקתית מרוכזת של כיתה מתכת קורט לתא כולו, שברים ציטופלסמיים וגריוניים המכילים 100, 500 ו 100 microliters של השעיית התא ב 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר, ולמקום אותם בלוק תרמי ב 80 מעלות צלזיוס כדי מינרליזציה של תרבות התא במשך שעה אחת. לאחר מכן, להוציא את הצינורות מן הבלוק התרמי למקם אותם במדף כדי להמשיך את עיכול החומצה לילה ב 20 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה על ידי הוספת 30% של נפח המדגם של מי חמצן.
הביאו את נפח הדגימה ל-500 מיקרוליטר עם 18 מגה מים מטוהרים של Ohm. לאחר מכן, בצינור פלקון 15 מיליליטר לדלל תחמוצת חנקן סטנדרטית כיתה אנליטית במים מטוהרים ב 18 מגה Ohms להכין שני נפח אחוז חומצה חנקתית פתרון כפתרון ריק במהלך הכיול. לאחר מכן, השתמש בתסגם החומצה החנקתית של שני נפחים כדי לדלל פתרון מלאי אבץ זמין מסחרית של 1,000 עמודים לדקה עם ריכוז של 1,000 חלקים למיליארד.
הכן פתרונות סטנדרטיים לעבודה מהפתרון הסטנדרטי של 1,000 חלק למיליון אבץ, פתרון 1,000 חלק למיליארד ולאחר מכן לדלל אותו ל 5, 8, 10, 15, 20 ו 25 ppb ישירות עם 2 נפח אחוז חומצה חנקתית פתרון. מניחים מיליליטר אחד של 0.1% מגנזיום חנקתי מגביל לתוך כוסות מדגם פוליפרופילן, ולאחר מכן לטעון את ה כוסות לתוך קרוסלת מדגם אוטומטי. תכנת את ספקטרומטר הספיגה האטומית כדי להוסיף באופן אוטומטי חמישה מיקרוליטרים של מגביל המטריצה לתקני האבץ וריק.
הגדר את אותו מצב אופטימיזציה על ספקטרומטר הספיגה האטומית עבור הפתרונות הסטנדרטיים ואת הדגימות, עם קצב זרימה מבוא ב 250 מיליליטר לדקה, טמפרטורת הזרקה ב 20 מעלות צלזיוס, וטמפרטורת תנור גרפיט להגיע 1, 800 מעלות צלזיוס בתהליכים ארבעה שלבים. יש למדוד את כל הסטנדרטים והדגימות של ניסוי יחיד בו זמנית כדי למנוע טעויות עקב הבדלי כיול או אידוי. מטב את המנורה C-HCL לזרם של 20 אמפר, אורך גל של 213.9 ננומטר וחותך של 0.7 ננומטר.
פיפטה הדגימות ב כוסות מדגם פוליפרופילן, והמקום אותם לתוך קרוסלת מדגם אוטומטי. הגבול התחתון של זיהוי אבץ הוא 0.01 חלקים למיליארד. על ידי הגדלת הריכוז של התקנים, הגבול העליון של זיהוי אבץ נקבע להיות 20 חלקים למיליארד.
לאחר מתקבלת עקומת אבץ סטנדרטית, למדוד את הדגימות מינרלים כדי לקבוע את התוכן מתכת. אם הנתונים המתקבלים הם מעבר לגבול הגילוי, לדלל את הדגימות עם 18 מגה Ohm מים מטוהרים שטופלו 0.1% חומצה חנקתית כיתה אנליטית. בבידוד מהיר זה של פרוטוקול הגרעינים, כתם מערבי מייצג מהבדלת מיובלסטים ראשוניים מראה את טוהר שברי התת-תאיים.
אנזים שיפוץ הכרומטין Brg1 שימש לזיהוי השבר הגרעיני, וטאבולין שימש לזיהוי החלק הציטוסולי. איור זה מציג מיקרוגרפים מייצגים של אור למיקרו-שכבות מתרבות ומובחנות או תואמות של כל סוג תא, ואת תוכן האבץ המתאים בתמציות תאים שלמים, שברים ציטוסוליים וגריוניים. כל קווי התאים שנותחו במחקר זה הראו ריכוזי אבץ בטווח הננו-מולארי.
מיוטובים ראשוניים מובחנים הציגו רמות גבוהות יותר של אבץ מאשר תאים מתרבים. התפלגות תת-תאית דומה של אבץ זוהתה בקו התאים המופק נוירובלסטומה N2A. מצד שני, קו התאים 3T3-L1 שהוקם הפגין רמות גבוהות יותר של אבץ כאשר הקדם-אדיפוזיטים היו מתרבים מאשר כאשר הם היו המושרים או מובחנים.
תאי MCF10A הראו רמות שוות של אבץ בין שברים ציטוסוליים וגריניים בתאים מתרבים. לאחר שתאי MCF10A הגיעו למנזר, זוהתה ירידה של 40% ברמות האבץ של התא כולו, והמתכת נמצאה מרוכזת ביותר בשבר הציטוסולי. ספקטרומטריית ספיגה אטומית של תנור גרפיט היא טכניקה רגישה ביותר למדידת מעבר ומתכות כבדות בדגימות ביולוגיות וסביבתיות.
טיפול מיוחד וניקיון בהכנת שברים תת תאיים יש לקחת, כמו זיהום מינימלי צפוי להפריע הניתוח, בשל הרגישות של הציוד. בהתחשב בנפחים הנמוכים וברמות העקבות של מתכות בכל ניסוי, קשה לחשוב על טכניקה טובה ומדויקת יותר למדידת אבץ מאשר GF-AAS. אין טכניקות נוכחיות שיכולות לספק את גבולות הזיהוי ונפח נמוך הנדרשים בעלות נמוכה יחסית של GF-AAS.
ספקטרומטריית ספיגת אטומית של תנור גרפיט מדויקת, רגישה, חסכונית ונגישה. טכניקה אנליטית זו תמשיך להשתפר ככל שטכנולוגיות הזיהוי היסודי ימשיכו להתקדם. יישום עתידי לגילוי אבץ ומתכות אחרות על ידי GF-AAS יכלול איברים, רקמות המתקבלות ממודלים של בעלי חיים, וביופסיות מחולים עם מחלה הקשורה לחוסר איזון מתכתי מערכתי.
חומצה חנקתית היא חומצה קורוזיבית מאוד המסוגלת לגרום לכוויות כימיות חמורות במהירות רבה. כימיקל זה יכול גם להגיב באלימות עם תרכובות מסוימות כגון אבקות מתכתיות. בגלל הסכנה שמציבה חומצה חנקתית, חשוב לנקוט באמצעי בטיחות מחמירים בכל פעם שמטפלים בחומצה חנקתית.
בעת טיפול בחומצה חנקתית אנו ממליצים בחום להרכיב משקפיים כימיים בטיחותיים, מגן פנים להגנה מפני התזה, כפפות ונשימה מאושרת של אדים אם האוורור אינו מספיק.
