Name: anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

저자는 그들의 지원에 대 한 연구의 중서부 대학 사무실 및 후원 프로그램을 감사합니다.

1. 다양 한 포유류 세포 라인의 혐 기성 문화에 대 한 미디어 준비
<ol><li>
무산 소 셀 문화25에 대 한 완전 한 PS 74656 매체를 확인 합니다.
	<ol>
<li>아 질산염 이온 증류수 50 ml에서의 17.25 g을 용 해 하 여 살 균 아 질산염 재고 솔루션 (5 M; 100 배)를 확인 한 다음 그것을 소독 필터.</li>
		<li>110 mg/l L-글루타민, 나트륨 pyruvate 그리고 10% 태아 둔감 한 혈 청의 584 mg/L의 낮은 포도 DMEM (1 g/L의 포도 당)의 50 mL 당 아 질산염 재고 솔루션의 0.5 mL을 추가 (FBS; 열 비활성화). 참고: FBS 농도 10%는 독성 보다 큰 사용 합니다. 메모의 한 암 세포 라인 테스트 아 질산염 (MDA-MB-231, 유 방 암 세포 선)와 미디어에 대 한 낮은 내성을 했 그리고, 따라서, 아 질산염의 부재에서 성장 했다. 또한, PS 74656 매체 지원 테스트 모든 셀 라인의 성장 (n = 9), 특정 셀 라인 (예를 들어, Vero 세포) 전시 높은 세포 농도 높은 포도 당 (4.5 g/L) DMEM과 PS-74656에서 더 높은 생존 능력 25.</li>
		<li>살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 매체의 20 mL를 배치 합니다. 모자; 강화 하지 마십시오 그것은 느슨하게 해야 합니다.</li>
		<li>진공 벨 항아리에 튜브를 삽입 하 여 탈 가스 매체는 약 45 ° 각도, 중간 영역을 최대화 하기 위해.</li>
		<li>실 온에서 진공 펌프 또는 해당을 사용 하 여 진공을 적용 합니다. 거품은 더 이상 (24-48 h) 관찰 때까지 진공을 유지 합니다.</li>
		<li>항아리에서 튜브를 제거 하 고 즉시 매체에 공기의 도입을 최소화 하기 위해 튜브 씰링 뚜껑을 닫습니다.</li>
		<li>상업적인 혐 기성 챔버에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>튜브 캡을 풉니다 하 고 적어도 24 h에 대 한 챔버에 혐 기성 가스 혼합물의 equilibrate를 튜브에 분위기를 허용 합니다. 참고: 매체 있어야 챔버에 때까지 그것 사용 합니다. 튜브 플러시 프로세스를 속도 대 한 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 무산 소 가스 혼합물과 적어도 3 배 H2, CO2, 그리고 N 구성 된 무산 소 가스로 가득 차2.
</li>
		<li>모든 튜브 (10-15 분) 튜브 씰링과 챔버에 배치 하기 전에 위에서 설명한 대로 혐 기성 챔버에 배치 드 사용 하기 전에, 1.5-2 mL 전송 펫을 사용 하 여 혐 기성 가스 혼합물으로 그것을 플러시 또는 무산 소를 플러시는 피 펫 팁 가스 적어도 3 배.</li>
		<li>혐 기성 챔버에 살 균 degassed 마이크로 원심 관에 매체의 100 µ L을 제거 하 고 산소 프로브를 사용 하 여 챔버 내에 용 존된 산소에 대 한 테스트. 참고: 산소 전극은 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 사전 당 보정 됩니다. 제대로 degassed equilibrated 혐 기성 가스 혼합 미디어의 수치는 0입니다. 주의: 수치는 산소의 0.3 ppm 이상, 계속 equilibrate 매체에 더 많은 시간 필요 이므로 혐 기성 챔버에 미디어를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 무산 소 재배 다양 한 포유류 세포 라인의
<ol><li>
지정 된 날-1
	<ol>
<li>T150 플라스 크에 세 24-잘 접시 (80% 합류)에 대 한 세포의 충분 한 번호를 제공 하는 무산 소 및 normoxic 문화 컨트롤에 대 한 90% 합류 (37 ° C, 5% CO2) 세포를 성장. 참고:이 연구를 위해 헬러 229과 Vero 세포 사용 되었다. 이 프로토콜은 또한 테스트 하 고 성장 및 7 다른 셀 라인25의 유지 보수에 대 한 성공을 증명 했다.</li>
		<li>포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 HBSS의 10 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>5 mL의 트립 신 매체를 바꿉니다. 셀은 시각적으로 플라스틱에서 분리 될 때까지 플라스 크를 교 반 하십시오. 트립 신의 대부분 발음 다음 꺼내 부착 세포를 플라스 크를 누릅니다. 높은 포도 DMEM의 10-15 mL을 추가 (4.5 g/L의 포도 당, L-글루타민, 10%의 110 mg/L FBS, gentamicin의 50 µ g/mL) 비활성화는 트립 신을.</li>
		<li>모든 세포 덩어리는 중단 될 때까지 25 mL 피 펫을 사용 하 여 셀 triturate</li>
		<li>셀을 계산 하 고 표준 hemocytometer 고 trypan blue 염료 제외 방법 또는 자동된에 해당 하는 사용 하 여 생존을 결정 합니다.</li>
		<li>105 셀/mL x 2.24의 셀 밀도를 위에서 언급 한 대로 높은 포도 당 DMEM 셀을 일시 중단 합니다.</li>
		<li>24-잘 조직 배양 접시의 우물에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 (105 셀/잘 x 2.24; 80% 합류). 무산 소 문화와 다른 제어 normoxic 문화에 대 한 종자 1 접시.</li>
		<li>24 h에 대 한 normoxic 조건 (5% CO2) 37 ° C에서 세포를 품 어. 참고: 셀 다양 한 잘 크기의 접시에 도금 될 수 있다. 그러나, 플라스 크에서 무산 소 성장에 대 한 셀을 시드 위험을 실행 산소의 소개의 시스템으로, 치료 대기 가스를 플러시 완전히 행사 하지 않는 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
지정된 일 0
	<ol>
<li>Normoxic 외피의 24 h 후 혐 기성 챔버 (상업 혐 기성 챔버;에 무산 소 성장에 대 한 번호판을 배치 그림 1)입니다.</li>
		<li>즉시 항생제 무료 드 기름된 PS 74656 매체는 혐 기성 챔버를 24 h에 대 한 acclimated 되었습니다 매체를 변경 합니다. 젖은 수건으로 컨테이너에 접시를 놓고 느슨하게 수 분을 유지 하기 위해 그것을 닫습니다. 참고: normoxic 성장 위한 접시는 동일 하 게 모든 치료 대기 조건 하에서 행해진다 예외 처리 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
지정된 일 1
	<ol>
<li>혐 기성 배양의 1 일 10% H2, 10%의 CO2, 그리고 80% N2의 표준 혐 기성 가스 혼합물을 포함 하는 상업 혐 기성 챔버에 외피의 24 시간 후 시작 합니다.</li>
		<li>다양 한 기간에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>시간이 지남에 따라 색 변경에 대 한 혐 기성 매체를 모니터링 합니다. 참고: 마젠타 레드-오렌지에서 색상 변화 신호 매체를 변경 하는 시간. 이 발생 2 주까지 걸릴 수 있습니다. 노랑 빨강 주황색에서 매체에 색상 변화 세균 오염 물질의 존재를 나타냅니다.</li>
		<li>매체 마젠타 레드에서 변경 때 포부에 의해 runagate 셀을 제거 합니다.</li>
		<li>장소 degassed 혐 기성 가스에서 runagate 셀 aspirated 보냈다 미디어 equilibrated microfuge 관, 인감, 안전 하 고 그들 (326 gx; 10 분 동안 실내 온도에) 원심 튜브 닫습니다. 즉시 우물에 있는 발음된 미디어를 바꿉니다 새로운 degassed PS 74656 매체의 1 mL.</li>
		<li>그것을 열기 전에 혐 기성 챔버에 수송과 셀 microfuge 관을 넣습니다. 보낸된 중간 발음 하 고 신선한 degassed PS 74656 매체 microfuge 관에 1 ml의 총 볼륨을 바꿉니다.</li>
		<li>튜브에서 24-잘 조직 문화 접시에 잘 셀을 반환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Anaerobically 배양된 세포의 현미경에 의해 Phenotypic 세포 분화의 평가
<ol><li>
혐 기성 챔버에 접시 혐 기성 가스 혼합물으로 플러시 resealable 상자에 놓고 상자를 닫습니다. 참고: 상자 습기를 제공 하 고 밖으로 건조에서 접시를 방지 젖은 종이 타월을 포함 해야 합니다. 이후 그들은 얇은 현미경 검사 법, 샌드위치 가방 최고 작동.<ol>
<li>현미경 세포 관찰, 완전히 가방을 봉인 하 고 상공에서 그것을 제거 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 접시 위에 비닐 봉투를 스트레칭, 카메라 부착으로 거꾸로 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 검토 하 고 다양 한 배율에서 photomicrographs를 받아.</li>
		<li>실로, 봉인된 봉투에 접시를 반환 하 고는 인큐베이션 단계 2.3.3에서에서 설명한 대로 계속.</li>
		<li>별도로 runagate 세포 현 탁 액에 있는 분석, 2.3.5 단계에서 설명 하는 단계를 따릅니다. 참고: 이러한 셀 에어로빅 테스트에 사용할 수 있습니다 또는이 특정 인구의 테스트에 대 한 혐 기성 챔버에 반환 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+tumours:+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants?.">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?.</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors.">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li><li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+microbiota:+its+role+in+health+and+disease.">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li><li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells.">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells.">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423 (1977).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer.">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>D&#246;me, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., T&#243;v&#225;ri, J., T&#237;m&#225;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Vascularization+Mechanisms+in+Cancer.">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1&#945;+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1&#945; in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)alpha:+its+protein+stability+and+biological+functions.">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li><li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etaypoxia-inducible+factor-1alpha,+von+Hippel-Lindau+protein,+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva.">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li><li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat.">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307 (2017).</li><li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+Ethanol+Pathway+in+Carp+Following+Exposure+to+Anoxia.">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).</li><li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment.">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li><li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+toxicity+induced+by+anticancer+agents+in+cardiomyocyte+culture.">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li><li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes.">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite:+NO+reductase.">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance.">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li><li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria.">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li><li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase.">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li><li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis.">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li><li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability.">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li><li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture.">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 메서드는 산소의 부재에서 시간의 연장된 기간에 대 한 교양 했다 처음 포유류 세포를 나타냅니다. 현재 관측을 바탕으로는 무산 소 성장 기능을 통해 비 발효 통로 나타납니다 포유류 세포 라인28, 사이 보편적인 혐 기성 성장 형 분기에서 결과. 이 테스트는 모든 셀 라인에 대 한 관찰 되었다. 혐 기성 경작 셀의 비율을 증가 되었다 둥근, 서 스 펜 션 같은 인구 개발과 ?...

고체 종양, 줄기 세포 벽 감, 안 감 점 막 표면 세포 anoxia1,2,,34를 포함 하 여 감소 산소 수준, 경험 하는 환경에 존재 한다. 정상 생리 상태에서 산소 anoxia (산소의 완전 한 부재)5,6산소 보다 다릅니다. 대기 산소는 포유류 세포 복제에 부정적인 영향을 미치는 그 체 외에서 세포 성장이 고갈된 산소 조건에서 최적화 될 수 있습니다 실현 1970 년대 초반에 보고 되었다. 리히터 외. 7 1-3% 산소 수준 (hypoxia)의 대기 산소 (20%) 도금 효율 향상을 보여주었다. 인간 2 중 세포 수명 또한 hypoxic 문화 조건8에 확장 됩니다.
Vivo에서, hypoxic 조건이 발생할 때 산소 매장 고갈 (예를 들어를 강렬한 운동 동안)와 함께 발효 (혐 기성 호흡) 호 기성 호흡에서 골격 근육에 ATP 생산은 전환 하는 점에서 젖 산9의 최종 제품. 병 적, 암 종양, 내부에에서는 종양의 질량은 산소 가난한 vascularization 인해 무산 소를10. 종양 내부에 제한 된 관류의 효과 독립적으로 유효성을 검사 하지 종양 인테리어 의무 anaerobes1에 의해 식민지에 의해. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 알파 유전자의 표현에 전적으로 종속 hypoxia에서 종양 세포 생존은 생각 하는 mechanistically, (HIF1-알파), 산소4,11 초기 자발적인 응답은 , 12. HIF1-알파 hypoxic 조건 하에서 HIF1를 바인딩할 열 충격 단백질에 의해 유도 된다-알파 발기인 및 upregulate 유전자 전사12. 이 열 충격 단백질 종양 hypoxic microenvironment에서 본 다양 한 고기의 유도에 도움으로 추정 된다. 이 고기 세포 막 포도 당 운송업의 증가 표현과 분해 (바르 부르 크 효과)13의 속도 전시 한다. 결과 발효 젖이 나올를 미토 콘 드 리아 산화 인 산화에서 스위치입니다.
무산 소 생존 또한 대안 생존 현상14,15를 지원 하기 위해 포도 당을 활용할 수 있습니다. 최고의 공부 포유류입니다 두더지 쥐과 당 구동 glycolytic 발효 통로14통해 산소 없이 거의 20 분 동안 살아남을 수 있습니다. 특정 생선에 발생 하는 다른 적응 (예를 들어, 훨씬 더 이상 살아남을 수 있는 잉어 [떡 sp.], 기간 터미널 부산물로 에탄올 분해를 사용 하 여)15. 두 경우 모두, 발효 드라이브 활성화 산소의 부재에서 생존 하는 대사. 무산 소 생존에 대 한 현재 가설은 오랫동안으로 HIF1-알파16혐 기성 조건 발생 하는 산소에 대 한 필요 없이 hypoxia, 미토 콘 드리 아 호흡 하는 동안 활성화 됩니다. 또한, 그것은 가정 하는 hypoxic/무산 소 생존을 위한 발효 경로 사용 하 여 셀 셀 생존17에 해로운 증명할 수 있는 산화 스트레스 방지 이후 종양 생존을 향상. 이 공준 cardiomyocytes에서 hypoxia 종양 세포17에 배치 하는 산화 스트레스 감소를 보여주는 최근 연구에 의해 지원 됩니다.
날짜 하려면, 무산 소 포유류 세포 생존에 대 한 발효 통로의 본질은 되었습니다에 배어 든 문학, 인해, 3 일 이상 산소의 완전 한 부재에 문화 포유류 세포의 무 능력에 큰 부분에서. 그러나, 혐 기성 생존을 위한 분해 대신 박테리아에서 발생합니다. 특정 박테리아에 질소 또는 황산 (다른 화합물) 중 산소18시 토 크롬 산화 효소 시스템 부재에 대 한 터미널 전자 수락자로 사용할 수 있습니다. 세균과 진 핵 진화 마지막 보편적인 일반적인 조상에서 분기 이후 병렬로 발생, 비록 미토 콘 드리 아 1.542 백만 년 전에 바다19의 산소 세포에 에너지를 제공 했다 추정 된다 . 연구원은 고립 된 미토 콘 드리 아 터미널 전자 수락자로 아 질산염으로 산소의 부재에서 ATP를 생성할 수 있다 나타났습니다 그것 이므로 세포 산소의 부재에 3 일 이상 기간에 대 한 기능 수를 가정 하는 합리적 20 , 21 , 22 , 23.이 연구에서 설명 하는 방법론은 수많은 셀 라인의 혐 기성 포유류 세포 성장에 대 한 유틸리티.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

대부분 점 막 표면 종양에 줄기 세포 벽 중간점 함께 무산 소는 신체의 지리적 영역이 있습니다. 이전 연구 결과 부 화 normoxic (5% CO2 공기에서)에 또는 hypoxic (낮은 산소 수준) 조건 제한 가능성 (2-3 일)에 무산 소 인큐베이션 (자유로운 산소의 부재) 결과 옵니다. 새로운 방법론은 (적어도 17 일, 최대 시간 테스트)에 대 한 무산 소 세포 배양을 가능 하 게 개발 되었다. 이 방법론의 가장 중요 한 측면 산소 시스템에 도입 하는 것입니다. 이 기체 제거 미디어, 그리고 세 정 튜브, 요리, 플라스 크, 및 혐 기성 가스 혼합물 (H2, CO2, N2)와 함께 펫 자료 무산 소 (산소) 환경에 equilibrate를 허용 하 여 뒤에 의해 얻어진 다 이전에 사용. 현미경 얻은 아티팩트를 포함 하지 않도록 하려면 photomicrographs 인수 하는 경우 추가 관리를 행사 해야 합니다. 산소의 부재에서 셀 형태학 크게 변경 됩니다. 두 가지 morphotypes anaerobically 성장 하는 모든 셀에 대 한 설명 되어 있습니다. 성장 하 고 산소의 부재에 포유류 세포를 유지 하는 능력의 세포 생리학, polymicrobial 상호 작용, 그리고 소설 암 약물 개발에 대 한 생 합성 통로의 특성 분석에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 강점 장 수 및 여러 셀 라인의 성장 지원 및 깊은 변경 및 셀 형태학25에서 분기는 인식입니다. 이 연구의 가장 중요 한 요소는 전송 및 엄격한 anaerobiosis 아래 세포의 유지 보수입니다. 이 혐 기성 챔버를 프로토콜 (그림 1)을 극대화 하기 위해 조직과 셀 현미경 또는 다른 테스트에 대 한 제거 하는 보증 된 환경에서 보?...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

anaerobic-growth-and-maintenance-of-mammalian-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K 조회수.  Midwestern University. 여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.

비디오: Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

연구

의학

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

생체공학

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

생화학

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

면역학 및 감염병학

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

생물학

줄기세포와 그 틈새를 배양하기 위한 쥐의 골격근 수확

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

저자 스포트라이트: Niche Components를 이용한 정지 근육 줄기 세포 배양을 위한 Ex Vivo 프로토콜 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

체외에서 시스템

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

의 전파

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양