Name: anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

Yazarlar Midwestern Üniversitesi araştırma Office ve sponsorlu programlar onların destek için teşekkür ederiz.

1. çeşitli memeli hücre satırlarını anaerobik kültür için ortam hazırlamak
<ol><li>
Anoksik hücre kültür25tam PS-74656 orta yapmak.
	<ol>
<li>17.25 g nitrit 50 ml distile deiyonize su ile çözülerek steril nitrit hisse senedi çözüm (5 M; 100 x) yaptıktan sonra bu sterilize etmek için filtre.</li>
		<li>Nitrit hisse senedi çözüm düşük glikoz DMEM (glikoz 1 g/L) 50 mL başına 0.5 mL 110 mg/L L-glutamine, 584 mg/L sodyum pyruvate ve % 10 fetal Sığır serum ile ekleyin (FBS; ısı-inaktive olur). Not: FBS konsantrasyonu % 10 toksik büyük kullanımı. Not, bir kanser hücre satır test nitrit (MDA-MB-231, meme kanseri hücre satır) ile media için düşük tolerans vardı ve böylece, nitrit, yokluğunda büyüdü. Buna ek olarak, PS-74656 orta test edildi tüm hücre satırlarını büyüme desteklenen rağmen (n = 9), belirli hücre hatları (Örneğin, Vero hücreleri) sergilenen daha yüksek hücre konsantrasyonları ve yüksek glikoz (4,5 g/L) DMEM ile daha yüksek bir canlılık içinde PS-74656 25.</li>
		<li>Orta 20 mL steril 50 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin. Kap sıkın değil; gevşek olmalıdır.</li>
		<li>Orta de-gaz tüp bir vakum çan kavanoza koyarak bir yaklaşık 45 ° açılı orta yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için.</li>
		<li>Bir vakum pompası veya eşdeğeri, oda sıcaklığında kullanarak bir vakum uygulanır. Kabarcıklar artık (24-48 h) gözlenir kadar vakum korumak.</li>
		<li>Kavanozdan tüpü çıkarması ve mühürleme hava giriş Orta içine en aza indirmek için tüp kap, hemen kapatın.</li>
		<li>Tüp ticari anaerobik odasına koyun.</li>
		<li>Tüp kapağı gevşetin ve atmosfer bu en az 24 saat için odasında anaerobik gaz karışımı ile equilibrate için tüp izin vermek. Not: Bu kullanılana kadar orta odasında kalır. Tüp işleminizi, floş hızlandırmak için steril transfer pipet kullanarak anoksik gaz karışımı ile en az 3 x H2, CO2ve N oluşan anoksik gazı ile doldurulmuş2.
</li>
		<li>Tüm borular (10-15 dk) tüp mühürleme ve odasında yerleştirmeden önce yukarıda açıklandığı gibi anaerobik odasında yerleştirilen degas. Kullanmadan, 1.5-2 mL transfer pipetler kullanarak anaerobik gaz karışımı ile temizleme veya en az 3 x ile anoksik temizlenen pipet İpuçları gaz.</li>
		<li>Odasında anaerobik iken, steril degassed mikro-santrifüj tüpü için orta 100 µL kaldırmak ve bir oksijen sondası odası içinde kullanarak çözünmüş oksijen için test edin. Not: Oksijen elektrot kullanmadan üreticinin Protokolü önce kalibre edilmiş. Düzgün bir şekilde degassed ve denge anaerobik gaz karışımı medya okumaları 0. Dikkat: 0.3 ppm oksijen okumaları, orta equilibrate için daha fazla zaman gerekli olduğundan anaerobik odası medyada kuluçkaya devam.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anoksik çeşitli memeli hücre satırlarını tarımı
<ol><li>
Belirlenen gün -1
	<ol>
<li>Hücreler (37 ° C, % 5 CO2) % 90 izdiham hücreleri yeterli sayıda üç 24-şey tabak (% 80 izdiham) sağlamak anoksik ve normoxic kültür kontrolü için bir T150 şişeye büyümeye. Not: Bu çalışma için HeLa 229 ve Vero hücreleri kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı ayrıca test ve büyüme ve yedi diğer hücre hatları25bakımı için başarılı oldu.</li>
		<li>Orta balonun aspirasyon tarafından kaldırmak ve HBSS 10 mL ile yıkayın.</li>
		<li>Orta tripsin 5 mL ile değiştirin. Hücreleri görsel olarak plastik ayırmak kadar şişeye kışkırtmak. Tripsin çoğunu Aspire edin sonra şişeye yapışık hücreleri çıkarmak için dokunun. Yüksek glikoz DMEM 10-15 mL ekleyin (4,5 g/M glikoz, 110 mg/L L-glutamine, % 10 FBS, gentamisin 50 µg/mL) tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için.</li>
		<li>Tüm hücre kümeleri bozulduğu kadar 25 mL pipet kullanarak hücreleri triturate.</li>
		<li>Hücreleri saymak ve standart hemasitometre ve trypan mavi boya hariç tutma yöntemini veya otomatik eşdeğer kullanarak canlılığı belirlemek.</li>
		<li>Yüksek glikoz DMEM hücrelerde askıya alma 105 hücre/mL x 2,24 hücre yoğunluğu için yukarıda belirtildiği gibi.</li>
		<li>24-iyi doku kültürü plaka wells için hücre süspansiyon 1 mL ekleyin (2,24 x 105 hücreleri/iyi; % 80 izdiham). Anoksik kültür ve başka bir denetim normoxic kültür için tohum 1 plaka.</li>
		<li>Normoxic koşulları (%5 CO2) için 24 saat içinde 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Not: Hücreleri çeşitli iyi ölçekli levha kaplama. Bakım tamamen atmosferik gaz temizlemek için icra sürece ancak hücreleri şişeler anoksik büyüme için tohum oksijen getirilmesi riskini sisteme çalışır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Belirlenen gün 0
	<ol>
<li>Normoxic kuluçka 24 saat sonra plakaları anoksik büyüme için anaerobik odasına (ticari anaerobik odası; yerleştirin. Şekil 1).</li>
		<li>Hemen hangi anaerobik odasına 24 h için iklime alıştırılacağı antibiyotik ücretsiz de-gazla PS-74656 orta orta değiştirin. Nemli bir havlu ile bir kapta plaka yerleştirin ve gevşek nem korumak için kapatın. Not: Tabakları normoxic büyüme için aynı şekilde tüm tedaviler atmosferik koşullar altında yapılır özel durum ele alınır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Belirlenen gün 1
	<ol>
<li>Gün 1, anaerobik Kuluçka kuluçka %10 H2, % 10 CO2ve % 80'i N2standart anaerobik gaz karışımı içeren ticari anaerobik odasında 24 saat sonra başlar.</li>
		<li>Hücreleri çeşitli süreler için kuluçkaya.</li>
		<li>Zaman içindeki renk değişimi için anaerobik orta izlemek. Not: Kırmızı-turuncu pembe bir renk kayması zaman orta değiştirmek için sinyal gönderir. Bu gerçekleşmesi için 2 hafta sürebilir. Bir renk vardiya orta kırmızı-turuncu sarı bir bakteriyel kontaminasyon varlığını gösterir.</li>
		<li>Orta için pembe kırmızıdan değiştiğinde, runagate hücreleri tarafından aspirasyon kaldırın.</li>
		<li>Yer degassed ve anaerobik gaz runagate hücrelerde emişli harcanan ortamıyla microfuge tüpler equilibrated, tüpler mühür güvenli ve sonra onları (326 gx; 10 dakika oda sıcaklığında) santrifüj kapasitesi emin yaparken yakın. Hemen iyi emişli ortamı yeni degassed PS-74656 orta 1 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Microfuge tüp pelleted hücrelerle açmadan önce anaerobik odası yerleştirin. Harcanan orta Aspire edin ve taze degassed PS-74656 orta ve 1 ml microfuge tüp toplam hacmi ile değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri tüm tüpünden 24-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda dönün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fenotipik hücre farklılaşması anaerobik kültürlü hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>
Anaerobik odası ise, plaka anaerobik gaz karışımı ile boşaltılan resealable kutusuna yerleştirin ve kutusunu kapatın. Not: Nem ve plaka kurumasını önlemek için nemli kağıt havlu kutusu içermelidir. Onlar ince olduğundan Mikroskopi için sandviç paketi en iyi iş.<ol>
<li>Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek için tamamen çanta mühür ve odasından kaldırın.</li>
		<li>Dikkatle plastik torba plaka üzerinde streç, bir ters faz kontrast mikroskobu ile fotoğraf makinesi eki kullanarak hücreleri incelemek ve photomicrographs farklı büyütme oranlarında al.</li>
		<li>Plaka mühürlü çantada odasına dönün ve kuluçka 2.3.3. adımda anlatıldığı gibi devam etmemiz gerekiyor.</li>
		<li>Süspansiyon içinde olan runagate hücreler ayrı ayrı analiz için 2.3.5. adımda anlatılan adımları izleyin. Not: Bu hücreler daha sonra aerobik test etmek için kullanılabilir veya bu belirli nüfusu testleri için anaerobik odasına döndü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+tumours:+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants?.">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?.</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+(iPS)+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors.">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li><li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia.">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li><li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+microbiota:+its+role+in+health+and+disease.">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li><li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells.">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li><li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells.">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423 (1977).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer.">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>D&#246;me, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., T&#243;v&#225;ri, J., T&#237;m&#225;r, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Vascularization+Mechanisms+in+Cancer.">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1&#945;+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1&#945; in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)alpha:+its+protein+stability+and+biological+functions.">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li><li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etaypoxia-inducible+factor-1alpha,+von+Hippel-Lindau+protein,+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva.">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li><li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat.">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307 (2017).</li><li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+Ethanol+Pathway+in+Carp+Following+Exposure+to+Anoxia.">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).</li><li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment.">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li><li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+toxicity+induced+by+anticancer+agents+in+cardiomyocyte+culture.">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li><li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li><li>M&#252;ller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes.">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite:+NO+reductase.">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li><li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance.">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li><li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria.">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li><li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase.">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li><li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis.">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li><li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability.">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li><li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture.">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li><li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen:+Characterization+of+cell+replication,+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production.">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntem için uzun bir süre oksijen yokluğu kültürlü ilk memeli hücreleri temsil eder. Geçerli gözlem dayalı, anoksik büyüme özelliği üzerinden fermantatif olmayan bir yol nereye fenotip sapma anaerobik büyüme sonuçlandı memeli hücre hatları28arasında evrensel gibi görünüyor. Bu test tüm hücre hatlarında gözlendi. Anaerobik ekimi ile artan oranlarda hücreleri yuvarlak oldu, süspansiyon gibi nüfus geliştirilen ve çoğaltmak başardık. Orta hücre tipi i...

Solid tümör, kök hücre nişler ve bu mukozal yüzeylerde astar hücrelerden düşük oksijen düzeylerinde, kanda oksijen azlığı1,2,3,4de dahil olmak üzere ortamlarda adlı biri yok. Normal fizyolojik Birleşik Devletleri, hipoksi, kanda oksijen azlığı (oksijen olmaması)5,6ötesinde oksijenasyonu değişir. Atmosferik oksijen olumsuz memeli hücre çoğaltma etkiler ve o vitro hücre büyümesini tükenmiş oksijen koşullar altında optimize edilebilir gerçekleşme 1970'lerde bildirildi. Richter vd. 7 1-%3 oksijen düzeyleri (hipoksi) kaplama verimliliği ile karşılaştırıldığında atmosferik oksijen (% 20) gelişmiş gösterdi. İnsan diploit hücre ömrü hipoksik kültür koşulları8' de genişletilir.
Vivo, hipoksik koşullar ortaya oksijen depoları tükenmiş (Örneğin, yoğun egzersiz sırasında), olduğunda neyin ATP üretimi fermantasyon (anaerobik solunum) için gelen aerobik solunum kas iskelet ile açık olduğundan laktik asit9son ürünü. Patolojik olarak, kanserli tümörleri, iç içinde kitle için zavallı vaskülarizasyon nedeniyle anoksik hipoksik10tümördür. Tümör iç sınırlı perfüzyon etkisi bağımsız olarak zorunlu anaerobik1tarafından kolonize tümör iç tarafından doğrulanır. Mechanistically, tümör hücre hayatta hipoksi hipoksi-indüklenebilir faktörü 1-alfa Gen ifadesinin yalnızca bağımlı olduğu düşünülmektedir (HIF1-alfa), ilk spontan yanıt hipoksi4,11 olduğu , 12. HIF1-Alfa HIF1bağlamak Isı şok proteinleri tarafından hipoksik koşullarda indüklenen-Alfa organizatörü ve upregulate Gen transkripsiyonu12. Bu ısı şok proteinleri tümör hipoksik microenvironment görülen çeşitli fenotipleri indüksiyon yardım inanılıyor. Bu fenotipleri hücre zarı Glikoz taşıyıcı artan bir ifadesidir ve glikoliz (Warburg etkisi)13oranı sergi. Mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon fermantasyon laktat anahtarından sonucudur.
Anoksik hayatta kalma glikoz hayatta kalma fenomen14,15desteklemek için alternatifler de kullanabilir. En iyi okudu memeli yaklaşık 20 dakika oksijen ile fruktoz tahrik glycolytic fermantasyon yolu14olmadan yaşayabilir kör fare örnektir. Alternatif bir uyum içinde belirli balık oluşur (Örneğin,'önemli ölçüde daha uzun hayatta kalabileceği sazan [Carassius sp.], zaman glikoliz etanol ile terminal yan ürün kullanarak dönemleri)15. Her iki durumda da, fermantasyon oksijen yokluğunda yaşama etkinleştirme metabolizma kullanıyor. Geçerli anoksik hayatta kalmak için bu kadar uzun HIF1hipotezdir-Alfa hipoksi, mitokondrial solunum sırasında aktif oksijen ihtiyacını ortaya çıkar olmadan anaerobik16altında. Ayrıca, hücreleri hücre hayatta kalma17' ye zararlı olarak kanıtlamak olabilir oksidatif stres önlemek bu yana fermantatif bir yol kullanımı hipoksik/anoksik hayatta kalmak için tümör hayatta kalma artırır öne ise. Bu postülatı cardiomyocytes, hipoksi tümör hücre17tarihinde yerleştirilen oksidatif stresi azaltır gösteren bir çalışmada tarafından desteklenmektedir.
Bugüne kadar bir fermantatif yol anoksik memeli hücre hayatta kalmak için temel doğası literatürde, kusura bakma ama, bir yetersizlik kültür memeli hücreleri oksijen 3 günden uzun olmaması için büyük ölçüde kökleşmiş. Ancak, bakteriler glikoliz anaerobik hayatta kalmak için bir alternatif oluşur. Bazı bakteriler, azot veya sülfat (arasında diğer bileşikleri) yokluğunda sitokrom oksidaz sistemi oksijen18elektron alıcısı olarak hizmet verebilir. Her ne kadar son evrensel ortak atadan uzaklaşan beri paralel olarak bakteriyel ve ökaryotik evrim oluştu, bu mitokondri 1.542 milyon yıl önce okyanuslarda19 oxygenation hücrelere enerji sunuyorlardı tahmin edilmektedir . Hücreler zaman oksijen yokluğu 3 gün daha uzun süreler için işlev olabilir varsaymak makul çünkü araştırmacılar izole mitokondri elektron alıcısı olarak nitrit ile oksijen yokluğu ATP üretebilir göstermiştir 20 , 21 , 22 , 23. Bu çalışmada açıklanan metodoloji anaerobik memeli hücre büyüme çok sayıda hücre hatları için bir yardımcı program vardır.

<table><tbody><tr><td>Whitney A35 anaerobic chamber</td><td>Don Whitley Scientific&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr><tr><td>pipet aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>sterile transfer pipets</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterile conical centrifuge tubes</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>vaccum jar</td><td>Nalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose (4.5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterile pipets</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75 or T150)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture treated dishes</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad ziplock sandwich bags</td><td>Ziploc</td><td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin microtiter pipets</td><td>Mettler Toledo</td><td>Rainin Classic Pipette PR-100</td><td></td></tr><tr><td>microtiter tips</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-213233 &amp;amp; sc-201717&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test tube rack (50cc tubes)</td><td>The Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>sodium nitrite</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&amp;amp;region=US</td><td></td></tr><tr><td>clear boxes with lids</td><td>Rosti Mepal</td><td>Rubber maid</td><td></td></tr><tr><td>paper towels</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>In house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tubes sterile</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr><tr><td>biohazard bags with holder (desktop)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Gloves</td><td>VWR</td><td>89428</td><td></td></tr><tr><td>oxygen electrode</td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>pH paper/ pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines

En mukozal yüzeyler tümörler ve kök hücre nişler degradelerin yanı sıra, anoksik vücudun coğrafi alanlardır. Önceki çalışmalar gösteriyor ki kuluçka normoxic (%5 CO2 havada) içinde veya hipoksik (düşük oksijen düzeyleri) koşulları takip bir anoksik kuluçka (ücretsiz oksijen yokluğu) sonuçlarına göre sınırlı canlılık (2-3 gün). Roman bir metodoloji sağlayan bir anoksik hücre ekimi (en az 17 gün; en uzun süre test için) geliştirilmiştir. En önemli bir özelliği Bu metodoloji, oksijensiz sisteme giriliyor sağlamaktır. Bu medya ve reçeteye göre sarf tüpler, yemekler, şişeler ve pipetler bir anaerobik gaz karışımı (H2, CO2, N2) ile malzeme anoksik (oksijen olmayan) ortamına equilibrate izin vererek takip gaz giderme tarafından elde edilir kullanım öncesinde. Ne zaman elde photomicrographs elde edilen filmler eserler içermediğinden emin olmak için ek bakım uygulanmalıdır. Oksijen yokluğunda, hücre morfolojisi önemli ölçüde değişmiş. İki farklı morphotypes tüm hücreler için anaerobik yetiştirilen belirtilmiştir. Yeteneği büyümeye ve oksijen yokluğu memeli hücreleri korumak için Hücre fizyolojisi, polymicrobial etkileşimleri ve Roman kanser ilaç geliştirme biyosentetik yollar karakterizasyonu analizlerine uygulanabilir.

Bu iletişim kuralı gücünü verdiği destek, uzun ömürlü ve birden çok hücre satırı büyüme ve bir derin değiştirme ve ıraksak evrim süreçleri sonucu hücre morfolojisi25vardır tanıma yatıyor. Bu çalışmanın en önemli unsuru transfer ve sıkı anaerobiosis altında hücrelerin bakımı sağlamaktır. Bu bir anaerobik odası (Şekil 1) iletişim kuralının en üst düzeye çıkarmak için düzenlenen ve hücreler...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines at JoVE.com

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Burada, kurulan hücre hatları anaerobik uzun vadeli ekimi sağlar yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Test edildi en fazla yaşam süresi 17 gün var. Bu yöntem sitotoksik ajanlar test ve anoxically hücreleri çoğaltma Fizyoloji keşfetmek için uygundur.

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

anaerobic-growth-and-maintenance-of-mammalian-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  Midwestern University. Burada, kurulan hücre hatları anaerobik uzun vadeli ekimi sağlar yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Test edildi en fazla yaşam süresi 17 gün var. Bu yöntem sitotoksik ajanlar test ve anoxically hücreleri çoğaltma Fizyoloji keşfetmek için uygundur.

Video: Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Tıp

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Biyomühendislik

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Biyokimya

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Biyoloji

Kök hücreleri ve nişlerini kültürlemek için fare iskelet kasının toplanması

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

Yazar Spotlight: Niş Bileşenlerle Hareketsiz Kas Kök Hücrelerini Kültürlemek için Ex Vivo Protokolü 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Anaerobik büyüme ve bakım memeli hücre hatları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir In Vitro Sistem

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Yayılması

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü