כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבודד תא אנדוקרדיאלי ותאי אנדותל כליליים בנפרד מהלב כדי לעזור לאנשים להבין את ביטוי ותפקוד הגנים הספציפיים לסוג התא. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם טוהר גבוה וכדאיות של EEC ו- CECs מבודדים, כי התאים לשמור על המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם עם הבידוד. CECs ו- EECs שונים בהיבטים רבים, ולכן היכולת לחקור באופן עצמאי אוכלוסיות תאים אלה מאפשרת לחקור מנגנונים ספציפיים לסוג התא במחלות לב שונות.
שיטה זו יכולה להקל על המחקר של גורמים transcriptonomic ו epigenetic אחראי על מחלות לב רבות באופן ספציפי לסוג התא. החלקים המסובך ביותר של שיטה זו הם קביעת חלקים שונים בלב ותזמון העיכול כראוי, כדי למנוע זיהום סוג התא. הדגמת ההליך תהיה Yifei מיאו, מדען מחקר מהמעבדה שלי.
לאחר קצירת לבבות משישה 50 עד 100 גרם חולדות ספראג דאולי, לשטוף את האיברים עם 50 מיליליטר של HBSS קר שלוש פעמים כדי להסיר כל דם עודף ולמקום לב אחד תחת מיקרוסקופ ניתוח. מקם את הלב על הפנים האחוריות המחמיאות שלו כדי לזהות את הצדדים השמאליים והימין של הרקמה ולאתר את עורק הריאה. השתמש במספריים כדי לחתוך דרך עורק הריאה עד לתא החדר הימני לחתוך לאורך מחיצה עד לשיא הוא הגיע.
המשיכו לחתוך מהגג במעלה הצד האחורי של הלב לאורך מחיצת עד צומת של עורק הריאה ואת החדר הימני הוא הגיע. החל מנקודה זו, חותכים הן את הצדדים האחוריים והן את הצדדים האחוריים של הלב בניצב לנקודת הניתוח הקודמת והן הרחק מהמ מחיצה עד שהקיר החופשי בחדר הימני משוחרר משאר הלב. לאחר מכן מניחים את הקיר הימני ללא חדרית לתוך צינור חמישה מיליליטר של DMEM ולאתר את האביזר שוב כדי להקל על איסוף הקיר השמאלי החדר החופשי באותו אופן כמו רק הפגינו.
כאשר כל הקירות ללא חדריים נאספו, להעביר את דגימות הרקמה לתוך צלחת תרבות 60 ס"מ עם המשטחים הפנימיים שלהם שוכבים עם הפנים כלפי מטה בצלחת. באמצעות קצה פיפיטר אחד מיליליטר, להוסיף 0.5 כדי מיליליטר אחד של חיץ העיכול לצלחת ישירות מתחת לחתיכות הרקמה עד רק את המשטחים הפנימיים של הרקמות שקועים. כדי למנוע זיהום תאים לא רצויים, חשוב שרק המשטח הפנימי של החדר יהיה שקוע במאגר העיכול והוא מתעכל בדיוק חמש דקות.
לאחר חמש דקות באינקובטור תרבות התא, לעצור את העיכול עם חמש פעמים את הנפח של מדיום תא אנדותל. לאחר מכן השתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי לשטוף את פני השטח הפנימיים של כל חדר עם מדיום טרי העברת נגר דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף 50 מיליליטר על קרח. לעיכול תאי אנדותל כליליים, חותכים לאורך המשטח החיצוני של החדר השמאלי ללא זיהום מהשכבה הפנימית ומ מניחים כל שבר צינור בצינור נפרד של חמישה מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ עיכול.
כדי למנוע זיהום מ- EECs, חשוב לחתוך רק מפני השטח החיצוניים של החדר. באמצעות מספריים ניתוח, טחון את הקיר חדרית לחתיכות קטנות מילימטר מעוקב אחד ולמקום את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות עם מערבולת כל שתיים עד שלוש דקות. כאשר החלקים הטחון הם קטנים אך גלויים, מוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום תא אנדותל לצינור ולהשתמש פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר להעביר את כל נפח הפתרון באמצעות מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף 50 מיליליטר על קרח.
כדי לבודד את אוכלוסיות התאים החיוביים CD31 לאחר העיכול שלהם, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ושואפים את supernatants. אם כדוריות כלשהן הן אדומות, תן שימוש חוזר בתאים באחד עד שני מיליליטר של חיץ תותלי דם אדומים לכל צינור עבור דגירה של חמש דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לעצור את תמוגה עם 10 מיליליטר של PBS ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה שנייה.
לאחר מכן, להוסיף 90 microliters של חיץ מיון ו 10 microliters של נוגדן נגד CD31 PE לכל צינור של תאים. לאחר המערבולת, הדגירה את התאים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ מיון לצינורות עם ערבוב יסודי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
תן את הכדורים ב 80 microliters של חיץ מיון לכל צינור, ואחריו תוספת של 20 microliters של microbeads נגד PE. לאחר מערבולת, מניחים את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, ואחריו לשטוף 10 מיליליטר של חיץ מיון על ידי צנטריפוגה כפי שהוכח רק. תן שימוש חוזר בכדורים ב-500 מיקרוליטרים של חיץ מיון על קרח והצב עמוד המכיל כדורים סופר-פרמגנטיים למפריד מגנטי.
שטפו את העמודה בשלושה מיליליטר של מאגר מיון. כאשר העמודה התרוקנה, להוסיף 500 microliters של ההשעיה תא אנדוקרדיאלי תא לעמודה, ואחריו ארבע שטיפות עם שלושה מיליליטר של חיץ מיון לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את העמוד לתוך צינור אוסף חדש 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה עמודה וחמישה מיליליטר של תא אנדותל טרי בינוני כדי לשטוף את התאים החיוביים CD31 מתוך העמודה לתוך צינור האוסף.
ואז לאסוף את תאי אנדותל מבודד חרוזים על ידי צנטריפוגה. כצפוי, PCR כמותי מגלה כי ביחס בטא actin, תאים אנדוקרדיאליים אנדותל ביטא רמות גבוהות יותר של סמני אנדוקרדיאלי Npr3, Hapln1, ו Cdn11 לעומת תאים אנדותל כלילי. כמו כן, תאי אנדותל כליליים הביעו רמות גבוהות יותר של סמנים כליליים Fabp4, Mgll, ו Cd36 בהשוואה לתאי אנדותל אנדוקרדיאלי.
בנוסף, שני סוגי התאים ביטאו את הגן סמן תא מחבת-אנדותל Cdh5 עם רמות מעט גבוהות יותר שנצפו בתאי אנדותל כלייליים. אנחנו יכולים להמשיך לטהר את התאים באמצעות FACS ונוגדנים ספציפיים לאוכלוסיות התאים. לדוגמה, אנו יכולים להשתמש ב- anti-Npr3 כדי למיין EECs ואנטי-Cd36 כדי למיין CECs.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את תפקידם של EEC ו- CECs בהתפתחות הלב ומחלות באופן ספציפי לסוג התא.
