המחברים להכיר התוכנית עיקור כלבים UNESP-FCAV מתבקשים לספק את השחלות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים FAPESP (תהליך מס 2013/14293-0), שכמיות.

הניסוי בוצע עם השחלות של ארבעה כלבי תערובת הנשי, שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי-תוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושרה על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של UNESP-FCAV (פרוטוקול מס 026991/13).
1. הכנה ניסיוני
<ol><li>להכין או לרכוש 500 מ"ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) ללא סידן או מגנזיום.</li>
	<li>להכין את collagenase אני מדמין פתרון על ידי ערבוב µg 40 של האנזים ב 1 מ"ל של DPBS. סינון באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm ואחסן aliquots 2 מ"ל ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין את התקשורת התרבות הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז נמוך עם סרום עוברית 10%, 1% של אנטיביוטיקה.</li>
	<li>לאסוף חומרים עקר: מנות מספריים, מלקחיים, בקבוקון תרביות רקמה, צינורות, פיפטות 10 מ ל ו מ ל.</li>
	<li>השימוש בציוד מעבדה תרבות תא רגיל: בטיחות ביולוגית cabinet (BSC), חממה תרבות תא שוכן בגובה 5% CO2 ו 38 ° C וצנטריפוגה.</li>
	<li>לנקות את BSC: עם ידיים בכפפות, לעקר אותה עם 70% EtOH, באמצעות נורות UV.</li>
</ol>2. בידוד של גזע Mesenchymal מן השחלה
<ol><li>לאחר הניתוח, שמור את השחלות PBS בקרח צינור חרוטי, עד להגעתם במעבדה.</li>
	<li>ממלאים שתי צלחות פטרי 100 מ מ 10 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>להסיר את השחלות מהצינור ולהעביר אותם הפטרי הראשון עם PBS. לשטוף אותם עם ערבוב תנועות.</li>
	<li>בעדינות לאחזר את השחלה ולמקם אותו לתוך תבשיל אחר. עם פינצטה סטרילי, מספריים, מינצ הרקמה לחתיכות קטנות מאוד, בערך בגודל של 1 מ מ בלבד.</li>
	<li>להעביר את רקמת השחלה 35 מ מ פטרי ולהוסיף 2 מ של collagenase. מינצ הרקמה קצת יותר.</li>
	<li>מניחים על צלחת פטרי בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ומנערים בעדינות את צלחת פטרי עם תנועות מעגליות בכל 20 דקות.</li>
	<li>לאחר 3 שעות, הסר את הפטרי של החממה.</li>
	<li>העבר את התוכן של המנה צינור 15 מ"ל. הוסף 5 מ של התרחבות המדיה.</li>
	<li>היפוך בעדינות את הצינור לפני צנטריפוגה. Centrifuge הצינור ב g 2100 x במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 3 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
	<li>העברה בגדר בקבוק T25. מקם את הבקבוק בתוך החממה עם 5% CO2 ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הערה: החלק החשוב ביותר של ההליך היא לשנות את המדיה לאחר 3 שעות של דגירה.</li>
	<li>הסר את הבקבוק של החממה ולהסיר את התקשורת עם הרקמה הנותרת. להוסיף 3 מ"ל של התקשורת הרחבה טריים של הבקבוק.</li>
	<li>שינוי התקשורת כל 48 שעות, להתבונן בקבוק הנהרות הסלולר. הערה: השלבים העיקריים של ההליך יכול להיות שנצפו באיור1.</li>
</ol>3. הרחבה של גזע Mesenchymal מן השחלה
<ol><li>
מעבר תא
	<ol>
<li>כאשר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיה מהבקבוק.</li>
		<li>לשטוף את הבקבוק עם 3 מ"ל של PBS. הסר את PBS.</li>
		<li>להוסיף 1.5 מ של טריפסין ולשים הבקבוק בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות טפח בעדינות את הבקבוק כדי לסייע התאים כדי לנתק. הערה: תאים צריך להגיע למפגש כ 5 - 7 d לאחר ציפוי הראשונית.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של הרחבת מדיה ולהעביר את התוכן צינור חרוטי.</li>
		<li>Centrifuge הצינור ב x 2100 גרם במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
		<li>Homogenize בעדינות את התוכן של הצינור.</li>
		<li>קח את aliquot של µL 10 המדגם לבצע תא ספירת להחזיר את הצינור עם תאי החממה.</li>
		<li>מקום 10 µL של המיקס לתוך hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ספירת התאים
	<ol>
<li>להשתמש המטרה X 10 של המיקרוסקופ ולהתמקד קווי הרשת hemocytometer.</li>
		<li>לספור את התאים ב- 5 ריבועים קטנים (איור 2).</li>
		<li>הכפילו את המספר שנספרו ב- 50,000 כדי להעריך את מספר תאים למיליליטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הבידול של גזע Mesenchymal מן השחלה
הערה: מבחני בידול בוצעו על פי הנחיות נוסדה בשנת היל. et al. 9.
<ol><li>זרע 1.0 x 104 תאים לכל טוב, שהפקידים, שימוש לצלחת תרבות 4-. טוב.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
	<li>בעדינות להתסיס את המנה עם תנועות מעגליות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, להחליף את המדיה תרבות התקשורת בידול רצוי.</li>
	<li>עבור osteogenic, adipogenic, chondrogenic בידול, דגירה התאים עם התקשורת אינדוקציה עבור 30 d, עם החלפת מדיה בכל ערכות התמיינות ספציפיים ד 3 שימשו עבור כל אחד מבחני אלה.</li>
	<li>על שושלת היוחסין neurogenic בידול, דגירה את התאים עבור 10 d בתקשורת אינדוקציה, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM גלוקוז נמוך, חומצה ולפרואית 2 מ מ, הידרוקורטיזון 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר forskolin, 5 מ מ אשלגן כלורי, 5 אינסולין µg/mL ומיקרומטר 200 butylated hydroxyanisole.</li>
	<li>עבור מבשרי האנדודרם, תקופת דגירה של 5 d בתקשורת האנדודרם לפי הוראות היצרן מגיב.</li>
	<li>עבור תא הנבט הקדמוני שושלת היוחסין בידול, דגירה התאים בתקשורת אינדוקציה עבור 14d, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM, 10% FBS, 1 מ מ נתרן פירובט, 10 ננוגרם למ"ל LIF, חומצות אמינו שאינן חיוניות 1 מ"מ, 2 מ מגלוטמין, 5 אינסולין µg/mL, 0.1 מ מ β-mercaptoethanol, putrescine מיקרומטר 60, transferrin µg/mL 20, 10 ננוגרם למ"ל העכבר גורם הגדילה באפידרמיס, 1 ng/mL אנושי בסיסי פיברובלסט גורם גידול, האדם ng/mL 40 גליה התא neurotrophic קו-derived factor פניצילין 15 מ ג/ליטר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).</li><li>Zipori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+stem+cells:+state+rather+than+entity.">The nature of stem cells: state rather than entity.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).</li><li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium:+biology,+endocrinology,+and+pathology.">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).</li><li>Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+interconversions+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+ovarian+carcinomas:+an+exception+to+the+norm.">Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).</li><li>Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+cultures+derived+from+adult+human+ovaries.">Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).</li><li>Gong, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-like+cells+established+by+culture+of+adult+ovarian+cells+in+mice.">Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).</li><li>Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+follicular+renewal+in+the+postnatal+mammalian+ovary.">Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.</a> Nature. 428 (6979), 145 (2004).</li><li>Deans, R. J., Moseley, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+clinical+uses.">Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.</a> Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).</li><li>Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal-like+stem+cells+in+canine+ovary+show+high+differentiation+potential.">Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential.</a> Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).</li><li>Dominici, M. L. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).</li><li>Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+transplants+of+bone+marrow+cells.">Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.</a> Development. 16 (3), 381-390 (1966).</li><li>Kuznetsov, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-colony+derived+strains+of+human+marrow+stromal+fibroblasts+form+bone+after+transplantation+in+vivo.">Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בזאת אנו מספקים ראיות כי MSCs ניתן לבודד מרקמות השחלה הכלביים, אשר נחשב פסולת ביולוגית לאחר ovariectomy. בשל העובדה כי ניתן למצוא סוגי תאים רבים בשחלה, הצענו פרוטוקול לבחירת MSCs בהתבסס על שדבקו מהירה פלסטיק, אשר בהצלחה נבחרים תאים שגדל טפט עם מורפולוגיה פיברובלסט דמוי.
הדוח הראשון ש?...

מספר מחקרים שפורסמו להתמקד בתאי גזע גדל באופן משמעותי בעשר השנים האחרונות, מאמץ המחקר כי הושגה על ידי המטרה הקולקטיבית של גילוי טיפולי רפואה רגנרטיבית עוצמה. תאי גזע יש שני סמנים המעצב הראשי: העצמי - שיפוץ ובידול. גזע mesenchymal אחראי על תחלופת רקמת רגיל, יש קיבולת מוגבלת יותר של בידול בהשוואה בתאי גזע עובריים1. לאחרונה, מחקרים רבים הראו מגוון רחב של הבידול של MSCs, נושא בדיון אם קיימים הבדלים בין תאי גזע עובריים והוא בוגר כל2.
Ovarium פני האפיתל היא uncommitted שכבה של תאים, יחסית פחות הבדיל, אשר מבטאת שני סמנים אפיתל, mesenchymal3, שמירה על היכולת להבדיל בין סוגים שונים של תאים בתגובה אותות סביבתיים4. המיקום המדויק של תאי גזע בשחלה אינה ידועה; עם זאת, שהוא הוצע כי אבות bipotential, albuginea tunica להצמיח בתאי הנבט5. מחקרים אימונולוגי יש שיערו כי תאים אלה יש מקור סטרומה6 או ממוקם או מקורב ביותר השחלה משטח7. מאז בתאי גזע mesenchymal אקספרס קולטנים רבים יש תפקיד חשוב ב תא אדהזיה8, תוכנן ניסוי כדי לבדוק את ההשערה כי בחירת אוכלוסיה של תאים עם הדבקה מהירה לבודד אוכלוסיה של תאים בבירור characterizable כמו mesenchymal בטבע. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחו על ההטיה של MSCs מרקמות השחלה בהתבסס על הקיבולת של הדבקה על משטח הפלסטיק של המנה תרבות ב ה 3 הראשון של תרבות, על מנת לקבל אוכלוסייה מטוהרים של תאים מפגין הדבקה מהירה9. כאן נתאר שיטת שפותחו עבור בידוד תאי גזע mesenchymal של רקמת השחלה.

<table><tbody><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Tissue flask</td><td>Corning</td><td>CLS3056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>12484-010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007201</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td><td>StemCell</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2035S</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2411GA</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1036G</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1041</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Milipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Tubulin&amp;nbsp;</td><td>Milipore</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>DDX4</td><td>Invitrogen</td><td>PA5 -23378</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR80F</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR120F</td><td></td></tr></tbody></table>

derivation and differentiation of canine ovarian mesenchymal stem cells

עניין גזע mesenchymal (MSCs) גדל בעשור האחרון בשל הקלות שלהם של בידוד, הרחבת והתרבות. לאחרונה, מחקרים הוכיחו יכולת התמיינות רחב שקיימים תאים אלה. השחלה מייצג מועמד מבטיח טיפולים מבוססי תאים בשל העובדה כי הוא עשיר ב MSCs וכי לעתים קרובות נמחקים לאחר ניתוחים ovariectomy כפסולת ביולוגית. מאמר זה מתאר נהלי הבידוד, הרחבה, ואת הבידול של MSCs נגזר מן השחלה הכלביים, ללא הצורך של מיון תא טכניקות. פרוטוקול זה מייצג כלי חשוב עבור רפואה רגנרטיבית בשל תחולתה רחבה של תאים אלה מאוד דיפרנציאבילית בניסויים קליניים, משתמש טיפולית.

בידוד תאי גזע mesenchymal מן השחלה הכלבים:
ההליך בידוד MSC השחלות מסוכם באיור1. לאחר הניתוח, רקמות הא, collagenase עיכול, שינוי מדיה 3 שעות לאחר תחילת התרבות, אוכלוסיה MSC בשם עם מאפיינים פלסטיק-דבק מהיר הופרדה בהצלחה מר...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

במסמך זה, אנו מתארים שיטה עבור בידוד, הרחבה, הבידול של גזע mesenchymal מרקמות השחלה הכלביים.

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, להרחיב ולהבדיל גבעולים mesenchymal מוכר נגזר רקמת השחלות כלבים. ניסוי זה בוצע עם השחלות של ארבעה כלבים נקבה בן כלאיים שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי בתוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סאו פאולו, FVAC.תוצאות מייצגות. דיון.מסקנה.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.6K Views.  São Paulo State University (UNESP). המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, להרחיב ולהבדיל גבעולים mesenchymal מוכר נגזר רקמת השחלות כלבים. ניסוי זה בוצע עם השחלות של ארבעה כלבים נקבה בן כלאיים שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי בתוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סאו פאולו, FVA...

Video: Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Biology

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Cancer Research

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

הערכה של מאפייני תא גזע בקרצינומה של תאי השחלות אדם באמצעות Multi ומבחני Spheres מבוסס תא בודדים

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Medicine

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

בידוד ואפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

מחבר זרקור: בידוד וזיהוי של תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video