שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרמקולוגיה של בטיחות הלב. לדוגמה, האם תרופה אנושית חדשה נושאת סיכון לשינוי קצב הלב הרגיל? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי זה יכול להעריך מספר גדול של תרכובות במהירות ובמחיר מתון.
הדגימה של ההליך תהיה קמיל פוני, עמיתת מחקר במעבדה שלי. כדי להתכונן למדידת הצירים של סינקטיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי אדם, או HIPSCCMs, להתחיל על ידי הצבת CryoTubes המכיל תאים קפואים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. העבר את כל ההשעיה המופשרת מכל צינור לצינור חרוט אחד, טרי 50 מיליליטר.
כדי לאחזר את שאריות התאים, לשטוף כל צינור עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס מראש ציפוי בינוני ולהוסיף את המדיום הזה לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל תאים מופשרים. מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום ציפוי חם לצינור ומערבבים בזהירות את ההשעיה. השתמש בשיטת אי-הכללה כחולה של trypan ובהמוציטומטר כדי לספור תאים חיים.
על ידי הוספת מדיום ציפוי חם, להתאים את הריכוז ל 50, 000 תאים למיליליטר. כדי להפיץ את התאים לשני לוחות תרבות תאים חדשים של 384 בארות, הוסף 25 מיקרוליטרים לכל באר, אשר יניבו כ -12, 500 תאים ל הבאר. הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 384 צלחות גם באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני במשך סך של שלושה עד ארבעה שבועות.
למחרת, להחליף את המדיום ציפוי עם 50 microliters של מדיום תחזוקה חמה. לאחר מכן, החלף מחצית מדיום התחזוקה כל יומיים עד שלושה ימים. בימים שבע, 14 ו-21, החלף את המדיום לחלוטין.
לאחר התאים נשמרו בתרבות במשך שלושה עד ארבעה שבועות, הם יצרו באופן ספונטני התכווצות syncytia, ואת ההשפעה של תרכובות על התכווצויות אלה ניתן למדוד. ביום ההסקה, לפחות שעתיים לפני לוחית התא הראשונה היא להיות ממוקם בתוך קורא הלוח למדידה, להפעיל את הקורא ולהגדיר את מערכת החימום ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הלוחות המורכבים, חם לטמפרטורת החדר 40 מיליליטר של אמצעי תחזוקה בתוספת 1% נפח לפי נפח פניצילין סטרפטומיצין.
בעוד המדיום מתחמם, להפיץ את תרכובות הבדיקה ואת הפקדים לתוך שתי 384 צלחות מורכבות היטב על ידי הוספת 1.5 microliters של פתרון מלאי ל הבאר. צנטריפוגה צלחות המתחם ב 100 G לדקה אחת. מוסיפים 37 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה לכל באר וצנטריפוגה את הצלחות שוב ב 100 G לדקה אחת.
כדי להכין את הצבע הפלואורסצנטי, חם 100 מיליליטר של מדיום תחזוקה בתוספת 1% נפח לפי נפח פניצילין סטרפטומיצין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיליליטר של המדיום החם לתערובת של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן וקוונצ'ר כדי להפוך אותם מחדש כמדיום פלואורסצנטי מלאי. הפעל את תוכנת קורא הלוחות.
הכינו את התוכנה לתיעוד קטע של שתי דקות של גלי סידן בתדירות רכישה של לפחות 10 הרץ. כדי להפוך את הפלואורסצנטיות לבינונית עבור כל צלחת תא, לדלל שלושה מיליליטר של מדיום פלואורסצנטי מלאי עם 12 מיליליטר של מדיום תחזוקה חם עם אנטיביוטיקה. החלף 20 microliters של בינוני בכל באר של צלחת התא עם 30 microliters של מדיום פלואורסצנטי ומערבבים על ידי צינורות למעלה ולמטה פעם אחת.
מיד לאחר מכן, מקם את הלוחית לקורא לוחות כדי לאפשר ל- HIPSCCMs להתאים את עצמם לטמפרטורת הקורא למשך 60 דקות. לאחר מכן, הפעל את תוכנת קורא הלוחות. הקלט קטע של שתי דקות של גלי סידן עם תדירות רכישה של לפחות 10 הרץ כדי להגדיר את קצב המכות הבסיסי עבור כל באר.
חשוב לוודא שלוח התא אינו מועבר אל מחוץ למכשיר לאחר רכישת נתונים. עם גירסאות תוכנה מסוימות, עליך להפסיק את ההקלטה לפני שהיא מסתיימת לחלוטין. השתמש ברובוט קורא הלוחות כדי pipette חמישה microliters של הבדיקה התייחסות תרכובות היטב לתוך הלוח מורכב לתוך לוח התא.
לאחר מכן, התחל את רכישת הנתונים בתוכנת קורא הלוחות כדי להקליט שני מקטעים דקה של גלי סידן החל מחמש, 15, 30, 45 ו - 60 דקות לאחר התוספת המורכבת. כדי להתחיל בניתוח נתונים, יצא את הנתונים הגולמיים עבור כל תקופת הקלטה מתוכנה של קורא הלוחות בקבצי טקסט של ASCII. ואז לייבא אותם לתוכנה לניתוח נתונים.
מתוך תוכנת ניתוח הנתונים, יצא את תדרי המכות העיקריים עבור כל תקופת הקלטה כ עותקי לוח. לחלץ את תדירות המכות העיקרית עבור כל באר ובכל נקודת זמן. לבסוף, יבא את התדרים המכות לתוכנה גיליון אלקטרוני על-ידי הדבקת הלוח והמשך בניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הקלטה של גלי סידן בבסיס על פני צלחת אחת 384 היטב מראה כי ברוב המקרים כל הבארים לחשוף שיעור מכות רגיל עם שונות קטנה על פני הצלחת. כאשר חוסמי תעלות יון לב מתווספים, הם משפיעים על הקצב של cardiomyocytes. Amlodipine, חוסם של תעלות סידן איטי, מאיץ את הקצב יותר מ 100% באופן תלוי ריכוז עד מיקרומולר אחד.
ומעל זה, אמלודיפין עוצר את המכות. E-4031, חוסם של תעלות אשלגן מתקן מושהה מהירה מטהר את הקצב על 65 עד 70% באופן תלוי ריכוז עד 10 micromolar. Tetrodotoxin, חוסם של תעלות נתרן מהירה מאט את הקצב על 15% באופן תלוי ריכוז עד אחד עד 30 micromolar, ואילו מעל 30 micromolar, tetrodotoxin עוצר את המכות בתוך חמש הדקות הראשונות.
Bepridil, חוסם מעורב של תעלות נתרן לב, סידן ואשלגן מייצר גם אפקט של הכל או כלום, מה שמרמז כי בלוק ערוץ נתרן הוא הפעולה העיקרית של bepridil. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין מאוד בעת צינורות בצלחת תרבות התא. רקמות אלה הם שבירים מאוד פגום בקלות אם נגע על ידי פיפטים.
אל תשכח כי עבודה עם תאים אנושיים וסמים פעילים יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בטיחות ומשקפיים תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.
