Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pharmacologie de la sécurité cardiaque. Par exemple, un nouveau médicament humain risque-t-il de modifier le rythme cardiaque normal? Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut évaluer un grand nombre de composés rapidement et à un coût modéré.
Camille Forny, associée de recherche dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour se préparer à la mesure des contractions de syncytie des cardiomyocytes pluripotents dérivés de cellules souches induites par l’homme, ou HIPSCCMs, commencez par placer des CryoTube contenant des cellules congelées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Transférer toute la suspension décongelée de chaque tube dans un seul tube conique frais de 50 millilitres.
Pour récupérer les restes de cellules, lavez chaque tube avec un millilitre de 37 degrés Celsius milieu de placage préchauré et ajoutez ce milieu au tube conique de 50 millilitres contenant des cellules décongelées. Ajouter huit millilitres de placage chaud moyen au tube et mélanger délicatement la suspension. Utilisez la méthode d’exclusion bleue trypan et un hémocytomètre pour compter les cellules vivantes.
En ajoutant un milieu de placage chaud, ajustez la concentration à 50 000 cellules par millilitre. Pour répartir les cellules en deux nouvelles plaques de culture cellulaire de 384 puits, ajoutez 25 microlitres à chaque puits, ce qui donnera environ 12 500 cellules par puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans des plaques de 384 puits dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone pendant un total de trois à quatre semaines.
Le lendemain, remplacer le milieu de placage par 50 microlitres de milieu d’entretien chaud. Ensuite, remplacez la moitié du milieu d’entretien tous les deux à trois jours. Les jours 7, 14 et 21, remplacez entièrement le milieu.
Une fois que les cellules ont été maintenues en culture pendant trois à quatre semaines, elles se sont formées spontanément contractant la syncytie, et l’effet des composés sur ces contractions peut être mesuré. Le jour de l’analyse, au moins deux heures avant que la première plaque cellulaire ne soit placée à l’intérieur du lecteur de plaque pour la mesure, allumez le lecteur et réglez le système de chauffage à 37 degrés Celsius. Pour préparer les plaques composées, réchauffer à température ambiante 40 millilitres de milieu d’entretien complété par 1% de streptocotomycine pénicilline volume par volume.
Pendant que le milieu se réchauffe, distribuez les composés d’essai et les commandes en deux plaques composées de 384 puits en ajoutant 1,5 microlitres de solution de stock par puits. Centrifuger les plaques composées à 100 G pendant une minute. Ajouter 37 microlitres de milieu d’entretien à chaque puits et centrifuger les plaques à nouveau à 100 G pendant une minute.
Pour préparer le colorant fluorescent, réchauffer 100 millilitres de milieu d’entretien complété par 1% de streptomycine de pénicilline volume par volume dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres du milieu réchauffé au mélange de colorant fluorescent sensible au calcium et de quencher pour les reconstituer comme milieu de fluorescence des stocks. Démarrez le logiciel de lecteur de plaques.
Préparez le logiciel à enregistrer un segment de deux minutes d’ondes calciques avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 hertz. Pour faire du milieu de fluorescence pour chaque plaque cellulaire, diluer trois millilitres de milieu de fluorescence de stock avec 12 millilitres de milieu d’entretien chaud avec des antibiotiques. Remplacer 20 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque cellulaire par 30 microlitres de milieu de fluorescence et mélanger en pipetting de haut en bas une fois.
Immédiatement après cela, placez la plaque dans un lecteur de plaque afin de laisser les HIPSCCMs s’adapter à la température du lecteur pendant 60 minutes. Ensuite, démarrez le logiciel de lecteur de plaques. Enregistrez un segment de deux minutes d’ondes calciques avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 hertz pour définir le taux de battement de base pour chaque puits.
Il est important de s’assurer que la plaque cellulaire n’est pas transférée hors de l’appareil après l’acquisition des données. Avec certaines versions logicielles, vous devez arrêter l’enregistrement avant qu’il ne se termine complètement. Utilisez le robot lecteur de plaque pour pipette cinq microlitres de l’essai et les composés de référence bien-à-bien de la plaque composée dans la plaque cellulaire.
Après cela, commencer l’acquisition de données dans le logiciel lecteur de plaque pour enregistrer deux segments de minute d’ondes de calcium à partir de cinq, 15, 30, 45, et 60 minutes après l’ajout composé. Pour commencer l’analyse des données, exportez les données brutes pour chaque période d’enregistrement à partir du logiciel de lecteur de plaques dans les fichiers texte ASCII. Et puis les importer dans un logiciel d’analyse de données.
À partir du logiciel d’analyse des données, exportez les fréquences de battement primaires pour chaque période d’enregistrement sous forme de copies de presse-papiers. Extraire la fréquence de battement primaire pour chaque puits et chaque point de temps. Enfin, importez les fréquences de battement dans un logiciel de feuille de calcul par le passé de presse-papiers et continuez l’analyse des données telle que décrite dans le protocole texte.
L’enregistrement des ondes calciques à la ligne de base sur une plaque de 384 puits montre que, dans la plupart des cas, tous les puits révèlent un taux de battement régulier avec peu de variabilité dans la plaque. Lorsque des bloqueurs de canaux irionaux cardiaques sont ajoutés, ils affectent le rythme des cardiomyocytes. L’amlodipine, un bloqueur des canaux calciques lents, accélère le rythme à plus de 100% d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à un micromolaire.
Et au-dessus de cela, amlodipine arrête le passage à tabac. E-4031, un bloqueur des canaux de potassium rectifier rapidement retardés ralentit le rythme d’environ 65 à 70%, d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à 10 micromolaires. La tétrodotoxine, un bloqueur des canaux de sodium rapide décélére le rythme d’environ 15% d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à un à 30 micromolaires, tandis qu’au-dessus de 30 micromolaires, la tétrodotoxine arrête le passage à tabac dans les cinq premières minutes.
Bepridil, un bloqueur mixte de canaux cardiaques de sodium, de calcium et de potassium produit également un effet tout ou rien, suggérant que le bloc de canal de sodium est l’action primaire du bepridil. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être extrêmement doux lors de pipetting dans la plaque de culture cellulaire. Ces tissus sont très fragiles et facilement endommagés s’ils sont touchés par des pipettes.
N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines et des médicaments actifs peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants de sécurité et de lunettes doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
