שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהערכת השפעות תרופתיות טיפוליות בתחום אנדומטריוזיס, כגון ההשפעות של תרכובות אנטי אנדרוגנית על גודל נגעים אנדומטריוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ההשפעות של תרופות ספציפיות ניתן להעריך במודלים של בעלי חיים של אנדומטריוזיס בזמן אמת, ולא בסוף. הדגמת ההליך תהיה ג'סיקה מרטינז, שהיא טכנאית מהמעבדה שלי, כמו גם ויויאנה ביסבל ונרה מרין, שהם וטרינרים מסטרו דה אינטיגאצ'יון פרינסיפה פליפה והם משתפי פעולה קרובים עם הצוות שלנו.
יומיים עד שלושה ימים לפני ניתוח השתל, מעבירים שברי ביופסיה של רקמת רירית לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה מדיום מלא, ולהשתמש באזמלים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קוביות של חמישה עד 10 מילימטרים. באמצעות micropipette, להוסיף 30 עד 50 טיפות microliter של DMEM על פני החלק התחתון של צלחת תרבות חדשה 10 ס"מ, משאיר מספיק מקום בין כל טיפה, כך שהם לא באים במגע אחד עם השני. כאשר כל הטיפות הונחו, השתמש במחט מזרק כדי למקם חתיכה אחת של שבר רקמת ביופסיה לתוך כל טיפה.
לאחר מכן, להוסיף 100 כדי 200 microliters של אדנו-mCherry מוכן טרי ל הבאר אחת של צלחת 96 גם לכל שבר רקמה, בתוספת שלוש בארות עם DMEM חינם אדנווירוס כבקרה שלילית. לאחר מכן השתמש במחט כדי להעביר דגימת רקמה אחת לתוך כל באר של פתרון אדנו-mCherry עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. למחרת בבוקר מניחים את הצלחת על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולהשתמש לייזר 568 ננומטר כדי לבדוק את השברים עבור תיוג אופטימלי.
באמצעות הדילול המתאים של להדביק אדנווירוס mCherry הוא המפתח לתיוג יעיל של הרקמה. אז כדי לקבוע את הריכוז המתאים, כמה עבור דילול mCherry, עבור כל ניסוי בודדים, יש להעריך. לאחר מכן להעביר את השברים המבריקים ביותר לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה 96 גם המכיל טרי, מדיום שלם.
לפחות שבעה ימים לאחר כריתת אופורקטום, decant שברי רקמת רירית הרחם לתוך צלחת פטרי, ולאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל חיים הרדמה, oophorectomized. עם העכבר במצב supine לחטא את אזור הגחון ולעשות חתך אורך 1.5 ס"מ בבטן. להפריד את העור מן השריר ולעשות חתך שני 1.5 ס"מ בשריר כדי לגשת לחלל צנית.
מחזיק את הקצה השמאלי של דופן שרירי הבטן עם מאלץ מיני, לקפל את השריר כדי לחשוף את הפנים הפנימיות של הצפק בצד החיצוני של החיה. השתמשו במיני פינצטה כדי להשרות בקצרה שתל רירית רירית ריחיים אחד בבקתת n-butyl ester cyanoacrylate ולצרף את השבר לצפא. כאשר דבק מיובש, מניחים שתל שני בצד הנגדי של ההקפאה כפי שהוכח רק.
השתמש בתפר 6-0 נספג כדי לסגור את שכבת השריר ותפר 6-0 שאינו נספג כדי לסגור את העור. לאחר מכן לנקות את חתך העור עם פתרון חיטוי ולמקום את החיה באזור ההתאוששות עם ניטור עד שיקום מלא. עבור הדמיה פלואורסצנטי in-vivo של שברי הרקמה המושתלת, 24 עד 48 שעות לאחר ניתוח ההשתלה להפעיל את מערכת ההדמיה in-vivo, לאתחל את התוכנה, ולאפשר למצלמת CCD להתקרר במשך כמה דקות.
לאחר המכשיר מוכן למקם את העכבר ההרדמה הראשון לתוך כלוב מערכת הדמיה in-vivo, בתמקמת סופין, עם הראש בתוך צינור מחובר למכונת ההרדמה, ולסגור את המכסה. לאחר מכן לחצו על 'רכוש' ושמור את חמש התמונות המתקבלות. כדי לכמת את הפלואורסצנטיות in-vivo, בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה לחץ על עיון ובחר את קובץ העניין הבלתי מעורער שיש לנתח.
יופיע חלון חדש. לחץ על הוסף לרשימה כדי לכלול את כל הקבצים שאינם מעוכים מכל חיה בנקודות זמן שונות ולחץ על טען כקבוצה. כל התמונות אמורות להופיע ברצף אחד.
בחלון לוח הכלים, בטל את הבחירה בתיבת הסימון קנה מידה בודד כדי להתאים את כל התמונות לאותו קנה מידה, ולחץ פעמיים על תמונה אחת של הרצף. ליצירת אזור מעניין, באזור כלי העניין בחרו באפשרויות קווי המתאר וה האוטומטיים, ולחצו על צורת המעגל כדי למקם את המעגל במרכז האות הפלואורסצנטי. לחץ על צור כדי ליצור את אזור העניין ולהעתיק ולהדביק את אזור העניין על רקע שבו אין אות.
לאחר מכן לחץ על למדוד אזורים מעניינים ובחר הכל כדי להציג ערכים עבור עוצמת הפלואורסצנטיות של כל אזור ולהעתיק ולהדביק ערכים אלה בגיליון אלקטרוני. התיוג של שברי רירית האנדומטריה מושגת על ידי זיהום עם אדנווירוס מהונדס לבטא mCherry, חלבון פולט פלואורסצנטיות בסעיף כמעט אינפרא אדום כי הוא משמעותית חזק יותר מאשר autofluorescence רקמת רירית רירית האנדומטריה שאינם נגועים. במהלך הניטור, בנוסף לאורך גל הייחוס עבור mCherry, תמונות פלואורסצנטיות נלקחות עם זוגות שונים של מסנני אורך גל של פליטת בעירור.
כדי להגדיר את פרופילי פליטת הרקמות הפלואורסצנטיות האופייניות של הנגעים מרקע, ואת שפעת אוטומטית הנפלטת על ידי הרקמות המארחות, תמונות הניטור המכילות פלואורסצנטיות גולמית הנפלטת על ידי בעלי החיים במהלך כל נקודת זמן מובאים יחד, לא מתומלים, בקובץ אחד. לאחר מכן, הפלואורסצנטיות אינה ממורמלת, מנורמלת ומיוצגת כתמונה צבעונית כוזבת, ואזורי האינטרסים המתאימים לאותות לגיון ורקע ספציפיים מזוהים באופן אוטומטי על-ידי התוכנית ומכומתים. אזור הרקע של איתות עניין הוא מופחת מאזור הלגיון של איתות עניין.
ותוצאות האינטנסיביות בכל נקודת זמן מנורמלות כנגד נקודת הזמן שבה האינטנסיביות היא מקסימלית. לאחר מספר שבועות של ניטור, ניתן לשחזר את השתלים קיימא לניתוח במורד הזרם. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבחור את הריכוז של Ad-mCherry המספק את האות המבריק ביותר מבלי להתפשר על הכדאיות של הרקמה.
בעקבות הליך זה, הנגעים ניתן לשחזר ושמש ללמוד פרמטרים ייחודיים נוספים. הליך זה מותאם לניטור לא פולשני של נגעים אנדומטריוזיס אנושיים קסנוגרפט. עם זאת, זה יכול להיות בקלות להסתגל להערכת ההשפעות של תרופות ספציפיות של עניין באתרים של xenograft בזמן אמת.
