Bu yöntem, hücreden hücreye etkileşim alanında, hücreden hücreye temaslarda hangi reseptörlerin yapışma veya tanıma ya da tanıma aracı olduğu ve belirli ligandların etkileşimlerini tetikleyip tetiklemediği gibi anahtar soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre fiksasyonu veya bozulmaya gerek kalmadan canlı hücrelerde bu tür etkileşimleri doğrudan araştırmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem kültürlü hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmasına rağmen, diğer sistemlere mono-membran veziküller ve hatta küçük model organizmalar uygulanabilir.
Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler, hücre hareketini ve yavaş sinyal varyasyonlarını dikkatle inceleyerek numunelerinin birkaç dakika içinde edinimi sağlayacak kadar kararlı olup olmadığını kontrol etmelidir. İlk olarak, transfection bir gün önce altı kuyu plaka en az dört kuyularda hücrelerin uygun sayıda tohum. Kültür 37 santigrat santigrat% 5 karbondioksit DMEM orta% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ile desteklenmektedir.
Yeşil veya sarı floresan protein ve ayrı kuyularda kırmızı floresan protein erimiş ilgi proteiniçin temel bir deney transfect plazmidler gerçekleştirmek için. Dört saat sonra büyüme ortamını kaldırın ve yıkama sırasında hücrelerin ayrılmasını önlemek için iyi kenarında magnezyum ve kalsiyum bırakarak PBS ile desteklenen pbs bir mililitre ile her iyi iyi yıkayın. Sonra PBS kaldırın.
Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için her kuyuya yaklaşık 50 mikrolitre EDTA çözeltisi ekleyin. İki dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yattıktan sonra, hücreleri ayırmak için yavaşça altı kuyulu plakayı yavaşça sallayın. Daha sonra, her kuyuya 950 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek hücreleri yeniden askıya alın ve böylece tüm hücreleri alttan ayırın.
Yeniden askıya alındıktan sonra büyük hücre agregalarının yokluğunu görsel olarak kontrol ederek hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden askıya alınmasını ve birbirlerinden ayrıldığından emin olun. Bir kuyunun hücre çözeltisini ilgili kuyuya aktarın. Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile yavaşça karıştırın.
Sonra 35 milimetrelik cam alt çanak ve kültür bir gün için% 5 karbondioksit 37 santigrat derece tohumlu hücreleri karışık hücreleri tohum. Lazer tarama confocal mikroskop yazılımı optik yolu kurmak. Spektral crosstalk önlemek için heyecanlandırmak ve mEGFP veya mEYFP ve mCherry veya mCardinal sırayla tespit etmek ve her Satırı parça anahtarı seçin iki ayrı parça seçin.
Algılama için her iki kanal için de uygun filtreler kullanın. Karışık hücreleri içeren kabı numune tutucunun üzerine yerleştirin. Sıcaklık dengesini sağlamak ve odak kaymasıazaltmak için 10 dakika bekledikten sonra, Bul menüsündeki iletim ışığını kullanarak hücrelere odaklanın.
Birbiriyle temas halinde olan bir çift kırmızı ve yeşil hücre arayın. Ardından, Kırpma düğmesini kullanarak hücreden hücreye birbağlantıya dik bir tarama yolu seçin. 50 ila 200 nanometre piksel boyutuna ulaşmak için yakınlaştırın ve Scan modunda Çizgi'yi seçin.
Kare boyutunu bir piksele 128 olarak ayarlayın. Scan hızını izin verilen maksimum değere ayarlayın. Sonra döngüleri 100,000 ile 500, 000 olarak ayarlayın.
Bunu takiben, uygun lazer güçlerini seçin. Dedektörleri Foton Sayma moduna ayarlayın. Satın almayı başlatmak için Başlat Deneyi'ne basın.
Ham veri dosyalarını ham veri biçiminde bir RGB TIF görüntüsüne dışa aktarın. Bu dosya, görüntünün G ve R olarak adlandırdığı kanaldaki yeşil ve kırmızı kanal verilerinin bulunduğu bir kymograph içerir. Ardından, Uygun analiz yazılımı ile TIF dosyasını içe aktarın ve çözümlemesi gerçekleştirmeye devam edin.
500 ile 1000 satırlık bloklarla segment açısından bir zaman ortalaması gerçekleştirerek satırları hizala. Her bloktaki membran pozisyonunu belirleyin. Sonra tüm blokları aynı yanal konuma kaydırın.
Zaman ekseni boyunca hizalanmış tüm çizgileri özetleyin ve Gaussian işlevini kullanarak ortalama yoğunluk profiline sığdırın. Membrana karşılık gelen pikselleri, membran pozisyonunun artı veya eksi 2,5 sigma içindeki tüm pikseller olarak tanımlayın ve her bir zaman noktası için tek bir floresan sinyal değeri elde ederek her satırdaki bu piksellerin yoğunluğunu özetleyin. Fotoğraf beyazlatma gözlenirse, membran floresan zaman serisini çift üstel fonksiyona takarak ve uygun düzeltme formülü uygulayarak bir beyazlatma düzeltmesi uygulayın.
Otomatik ve çapraz korelasyon fonksiyonlarını uygun denklemlere göre hesaplayın. Analizin güvenilirliğini artırmak ve yapıtlardan kaçınmak için toplam ölçümün 10 ila 20 eşit segmenti için hesaplamalar yapın. Her segmentteki floresan zaman serilerini ve korelasyon işlevlerini inceleyin ve açıkça bozulmuş segmentleri kaldırın.
Son olarak, tüm bozuk olmayan kesimlerin ortalaması. Verilerinizi analiz ederken, örneğin membran çevresinde hücre içi veziküller nedeniyle bozulmaları önlemek için her segmentteki yoğunluk zaman serilerini ve korelasyon fonksiyonlarını dikkatle inceleyin. Myristolyated-palmitoylated-mEYFP veya mCardinal ifade HEK 293T hücrelerinin bir yoğunluk görüntüsü burada gösterilmiştir.
Otokorelasyon fonksiyonları plazma zarında miristolyated-palmitoylated-mEYFP ve mKardinal difüzyonu için 10 ila 20 milisaniye karakteristik bozunma süreleri gösterirken sıfıra yakın göreceli bir çapraz korelasyon gözlendi. Membran bağlantılı heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP'yi ifade eden HEK 293T hücrelerinin sFCCS ölçümlerinin çapraz korelasyon fonksiyonları pozitif genliklere sahipti ve otokorelasyon fonksiyonu na benzer bozunma sürelerini gösterdi. APLP1-mEYFP ve APLP1-mKardinal ifade eden hücreler arasındaki hücreden hücreye temaslarda sFCCS ölçümleri 0,45 pozitif göreceli çapraz korelasyon ile sonuçlandı.
Hücre-hücre temaslarında APLP1 kümeleri arasındaki ölçümlerden elde edilen sFCCS korelasyon fonksiyonları, büyük gecikme sürelerinde salınımlarda büyük bozunma sürelerinden belirgin olarak güçlü bir şekilde azaltılmış dinamikler göstermiştir. Çinko iyon ilavesi üzerine, bağıl çapraz korelasyon ortalama değeri 0.8'e yükselmiştir. Moleküler parlaklık küçük oligomerlerden her hücrede 10 ila 50 monomerden oluşan daha büyük multimerlere kadar önemli ölçüde artmıştır.
Geçici kararsızlıklar, negatif değerlere veya yüksek yanlış pozitif çapraz korelasyona sahip çapraz korelasyon işlevine neden olabilir. Karşılık gelen korelasyon işlevleri genellikle segmentlerin çoğunluğundan güçlü bir şekilde saptamak. SFCCS çapraz korelasyon numarası ve parlaklık için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılabilir.
Bu prosedürü denerken transfected hücrelerin karıştırılması kritik bir adım olduğunu hatırlamak önemlidir. Hücreleri yavaşça karıştırın ve temas halinde ki kırmızı ve yeşil hücreleri bulma şansını artırmak için transfeksiyon verimliliğini optimize edin. Gelişiminden sonra bu teknik immünoloji alanında araştırmacılar tarafından immünolojik sinapslarda sinyal moleküllerinin etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır.
