يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين الخلايا إلى الخلية مثل أي مستقبلات تتوسط التصاق أو التعرف في اتصالات الخلية إلى الخلية وما إذا كانت يغاند محددة تؤدي إلى تفاعلاتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لأحد للتحقيق في مثل هذه التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تثبيت الخلايا أو تعطيل. على الرغم من أن يتم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا المستزرعة، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على النظم الأخرى أحادية الغشاء vesicles أو حتى الكائنات الحية نموذج صغير.
عموما الأفراد الجدد لهذا الأسلوب يجب أن تحقق من أن العينة مستقرة بما فيه الكفاية للسماح اكتساب على مدى بضع دقائق عن طريق فحص بعناية حركة الخلية وبطء الاختلافات إشارة. أولاً، بذور العدد المناسب من الخلايا في ما لا يقل عن أربعة آبار من لوحة ستة جيدا في اليوم قبل نقل. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون في متوسط DMEM تكمل مع 10٪ FBS و 1٪ L-الجلوتامين.
لتنفيذ تجربة أساسية عبر البلازميدات لبروتين الفائدة تنصهر إلى البروتين الأخضر أو الأصفر الفلورسنت والبروتين الفلورسنت الأحمر في آبار منفصلة. بعد أربع ساعات إزالة متوسطة النمو وغسل كل جيدا بلطف مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها المغنيسيوم والكالسيوم إسقاط برنامج تلفزيوني على حافة البئر لمنع انفصال الخلايا أثناء الغسيل. ثم إزالة برنامج تلفزيوني.
إضافة ما يقرب من 50 ميكرولترات من EDTA حل إسقاط الحكمة إلى كل بئر لتسهيل انفصال الخلايا. بعد احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، هز ببطء لوحة ستة جيدا في شكل آخر لفصل الخلايا. المقبل، إضافة 950 ميكرولتررس من متوسطة النمو لكل بئر وإعادة ضغط الخلايا عن طريق الأنابيب عدة مرات صعودا وهبوطا وبالتالي فصل جميع الخلايا من أسفل جيدا.
تأكد من أن الخلايا يتم إعادة اعتمادها بشكل صحيح وفصلها عن بعضها البعض عن طريق التحقق بصرياً من عدم وجود مجاميع خلايا كبيرة بعد إعادة التراكم. نقل حل الخلية من بئر واحد إلى البئر المقابلة. مزيج بلطف عن طريق الأنابيب عدة مرات صعودا وهبوطا.
ثم بذور الخلايا المختلطة على طبق القاع الزجاج 35 ملليمتر والثقافة الخلايا المصنفة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون ليوم واحد. في الليزر المسح الضوئي المجهر برنامج إعداد المسار البصري. لتجنب التوك عبر الطيفية حدد مسارين منفصلين لإثارة واكتشاف mEGFP أو mEYFP و mCherry أو mCardinal بشكل تسلسلي وحدد تبديل المسارات كل خط.
للكشف عن استخدام عوامل التصفية المناسبة لكلا القنتين. ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المختلطة على حامل العينة. بعد الانتظار 10 دقيقة لضمان توازن درجة الحرارة وتقليل الانجراف التركيز، والتركيز على الخلايا باستخدام ضوء انتقال في القائمة تحديد موقع.
البحث عن زوج من الخلايا الحمراء والخضراء في اتصال مع بعضها البعض. بعد ذلك، حدد مسار فحص عمودي على جهة اتصال من خلية إلى خلية باستخدام زر الاقتصاص. التكبير لتحقيق حجم بكسل من 50 إلى 200 نانومتر وحدد خط في وضع المسح الضوئي.
تعيين حجم الإطار إلى 128 بكسل واحد. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى الحد الأقصى المسموح به للقيمة. ثم تعيين دورات إلى 100، 000 إلى 500،000.
بعد ذلك، اختر القوى الليزر المناسبة. تعيين أجهزة الكشف عن الفوتون وضع العد. اضغط على تجربة البدء لبدء عملية الاستحواذ.
قم بتصدير ملفات البيانات الأولية إلى صورة RGB TIF بتنسيق بيانات أولية. هذا الملف سوف يحتوي على kymograph مع البيانات قناة الأخضر والأحمر في قناة يطلق عليها G و R من الصورة، على التوالي. بعد ذلك، استيراد الملف TIF مع برنامج التحليل المناسب ثم تابع لتنفيذ التحليل.
قم بمحاذاة الخطوط عن طريق تنفيذ متوسط وقت من فئة مع كتل من 500 إلى 1000 خط. تحديد موضع الغشاء في كل كتلة. ثم تحول جميع الكتل إلى نفس الموقف الجانبي.
تلخص جميع الخطوط المحاذية على طول محور الوقت وتلائم متوسط الكثافة باستخدام وظيفة غاوسية. تعريف بكسل المقابلة للغشاء كما كل بكسل داخل زائد أو ناقص 2.5 سيغما من موقف الغشاء، وخلاصة كثافة هذه بكسل في كل خط الحصول على قيمة إشارة الفلورسنت واحد لكل نقطة زمنية. إذا لوحظ تبييض الصورة، وتطبيق تصحيح التبييض عن طريق تركيب سلسلة زمنية الغشاء fluorescence مع وظيفة أسية مزدوجة وتطبيق صيغة التصحيح المناسبة.
حساب وظائف السيارات والارتباط المتبادل وفقا للمعادلات المناسبة. لتحسين موثوقية التحليل وتجنب القطع الأثرية تنفيذ العمليات الحسابية ل 10 إلى 20 قطاعات متساوية من القياس الكلي. فحص سلسلة زمنية fluorescence ووظائف الارتباط في كل قطعة وإزالة شرائح مشوهة بشكل واضح.
وأخيراً، متوسط جميع الشرائح غير المشوهة. أثناء تحليل البيانات الخاصة بك، قم بفحص سلسلة وقت الشدة ووظائف الارتباط من كل جزء بعناية لتجنب التشوهات، على سبيل المثال، بسبب وجود تحويصلات داخل الخلايا في محيط الغشاء. تظهر هنا صورة كثافة لخلايا HEK 293T تعبر عن myristolyated-palmitoylated-mEYFP أو mCardinal.
ولوحظ ارتباط بين تقاطعي نسبي قريب من الصفر في حين أن وظائف العلاقات الذاتية تظهر أوقات اضمحلال مميزة من 10 إلى 20 مللي ثانية لنشر myristolyated-palmitoylated-mEYFP و mCardinal في غشاء البلازما. وظائف الارتباط المتبادل من قياسات sFCCS من خلايا HEK 293T التعبير عن الغشاء الرسو heterodimer myristolyated-palmitoylated-mCardinal-mEYFP كان السعات الإيجابية وأظهرت أوقات تسوس مماثلة وظيفة التوثيق التلقائي. وقد أدت قياسات sFCCS على اتصالات الخلية إلى الخلية بين APLP1-mEYFP وAPLP1-mCardinal-التعبير عن الخلايا إلى ارتباط نسبي إيجابي من 0.45.
وأظهرت وظائف الارتباط sFCCS التي تم الحصول عليها من القياسات عبر مجموعات APLP1 في اتصالات الخلية ديناميات انخفضت بقوة كما يتضح من أوقات الاضمحلال الكبيرة في التذبذبات في أوقات التأخر الكبير. وعند إضافة أيونات الزنك، زاد الارتباط النسبي المتبادل إلى متوسط قيمة قدره 0.8. كذلك زاد السطوع الجزيئي بشكل كبير من القلة الصغيرة إلى التعدد الأكبر التي تتكون من 10 إلى 50 مونومرات على كل خلية.
قد يؤدي عدم استقرار عابر في دالة عبر الارتباط وجود قيم سالبة أو عالية خطأ تبادلية إيجابية الارتباط. عادةً ما تنحرف وظائف الارتباط المقابلة بشدة عن وظائف غالبية الشرائح. كما يمكن استخدام نهج مكمل لsFCCS عبر الارتباط عدد والسطوع للكشف عن التفاعلات البروتين البروتين.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن خلط الخلايا المصابة هو خطوة حاسمة. بلطف مزيج الخلايا وتحسين كفاءة transfection لزيادة فرصة العثور على الخلايا الحمراء والخضراء في اتصال. بعد تطورها تم استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف تفاعلات جزيئات الإشارة في نقاط الاشتباك العصبي المناعي.
