Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zell-zu-Zell-Interaktionsfeld zu verstehen, z. B. welche Rezeptoren Adhäsion oder Erkennung in Zell-zu-Zell-Kontakten vermitteln und ob bestimmte Liganden ihre Wechselwirkungen auslösen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht, solche Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen zu untersuchen, ohne dass eine Zellfixierung oder -störung erforderlich ist. Obwohl diese Methode verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen kultivierten Zellen zu untersuchen, kann es auch auf andere Systeme Monomembran-Vesikeln oder sogar kleine Modellorganismen angewendet werden.
Im Allgemeinen sollten Personen, die neu bei dieser Methode sind, überprüfen, ob ihre Probe stabil genug ist, um eine Erfassung über ein paar Minuten zu ermöglichen, indem sie die Zellbewegung sorgfältig und langsame Signalvariationen überprüfen. Erstens, Samen der entsprechenden Anzahl von Zellen in mindestens vier Brunnen einer Sechs-Well-Platte einen Tag vor der Transfektion. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius 5%Kohlendioxid in DMEM Medium ergänzt mit 10%FBS und 1%L-Glutamin.
Um ein grundlegendes Experiment durchzuführen, transsektierende Plasmide für das Protein von Interesse verschmolzen zu einem grünen oder einem gelben fluoreszierenden Protein und einem roten fluoreszierenden Protein in separaten Brunnen. Nach vier Stunden entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie jeden Brunnen sanft mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit Magnesium und Kalzium tropfenden PBS auf der Brunnenkante, um eine Ablösung der Zellen während des Waschens zu verhindern. Entfernen Sie dann die PBS.
Fügen Sie etwa 50 Mikroliter EDTA-Lösung Tropfen weise zu jedem Brunnen, um die Ablösung der Zellen zu erleichtern. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten, langsam schütteln Sie die Sechs-Gut-Platte seitlich, um die Zellen zu lösen. Als nächstes fügen Sie 950 Mikroliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen hinzu und suspendieren Sie die Zellen, indem Sie ein paar Mal nach oben und unten pfeifen und dadurch alle Zellen vom Brunnenboden lösen.
Stellen Sie sicher, dass Zellen ordnungsgemäß resuspendiert und voneinander getrennt werden, indem Sie visuell überprüfen, ob große Zellaggregate nach der Resuspension fehlen. Übertragen Sie die Zelllösung eines Brunnens auf den entsprechenden Brunnen. Mischen Sie sanft durch Pipettieren ein paar Mal nach oben und unten.
Dann säen Sie die Mischzellen auf einer 35-Millimeter-Glasbodenschale und kultiieren die gesäten Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für einen Tag. In der Laserscanning Konfokalmikroskop-Software richten Sie den optischen Pfad. Um zu vermeiden, spektrale Übersprechen wählen Sie zwei separate Spuren zu begeistern und zu erkennen mEGFP oder mEYFP und mCherry oder mCardinal sequenziell und wählen Sie Switch Tracks jede Linie.
Für die Erkennung sollten Sie geeignete Filter für beide Kanäle verwenden. Legen Sie die Schale mit den gemischten Zellen auf den Probenhalter. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, um den Temperaturausgleich zu gewährleisten und die Fokusdrift zu reduzieren, konzentrieren Sie sich auf die Zellen, indem Sie das Übertragungslicht im Menü Locate verwenden.
Suchen Sie nach einem Paar roter und grüner Zellen, die miteinander in Kontakt sind. Wählen Sie als Nächstes einen Scanpfad senkrecht zum Zell-zu-Zellen-Kontakt mit der Schaltfläche Zuschneiden aus. Zoomen Sie, um eine Pixelgröße von 50 bis 200 Nanometern zu erreichen, und wählen Sie Linie im Scan-Modus aus.
Legen Sie die Framegröße auf 128 x 1 Pixel fest. Legen Sie die Scangeschwindigkeit auf den maximal zulässigen Wert fest. Stellen Sie dann die Zyklen auf 100.000 bis 500.000.
Wählen Sie anschließend die entsprechenden Laserstärken aus. Stellen Sie die Detektoren auf den Photonenzählmodus ein. Drücken Sie "Experiment starten", um die Erfassung zu starten.
Exportieren Sie die Rohdatendateien in ein RGB-TIF-Bild im Rohdatenformat. Diese Datei enthält einen Kymographen mit den grünen und roten Kanaldaten im Kanal mit den Bezeichnungen G bzw. R des Bildes. Importieren Sie anschließend die TIF-Datei mit der entsprechenden Analysesoftware, und führen Sie die Analyse durch.
Richten Sie die Linien aus, indem Sie einen segmentweisen Zeitdurchschnitt mit Blöcken von 500 bis 1000 Zeilen ausführen. Bestimmen Sie die Membranposition in jedem Block. Dann verschieben Sie alle Blöcke in die gleiche seitliche Position.
Summieren Sie alle ausgerichteten Linien entlang der Zeitachse und passen Sie das durchschnittliche Intensitätsprofil mithilfe einer Gaußschen Funktion an. Definieren Sie die Pixel, die der Membran entsprechen, als alle Pixel innerhalb von plus oder minus 2,5 Sigma der Membranposition, und summieren Sie die Intensität dieser Pixel in jeder Linie, die einen einzelnen fluoreszierenden Signalwert für jeden Zeitpunkt erhält. Wenn Fotobleichungen beobachtet werden, wenden Sie eine Bleichkorrektur an, indem Sie die Membranfluoreszenzzeitreihe mit einer doppelten Exponentialfunktion ausstatten und die entsprechende Korrekturformel anwenden.
Berechnen Sie die Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen entsprechend den entsprechenden Gleichungen. Um die Zuverlässigkeit der Analyse zu verbessern und Artefakte zu vermeiden, führen Sie die Berechnungen für 10 bis 20 gleiche Segmente der Gesamtmessung durch. Prüfen Sie die Fluoreszenzzeitreihen und Korrelationsfunktionen in jedem Segment und entfernen Sie deutlich verzerrte Segmente.
Schließlich durchschnittlich alle nicht verzerrten Segmente. Bei der Analyse Ihrer Daten sollten Sie die Intensitätszeitreihen und Korrelationsfunktionen aus jedem Segment sorgfältig prüfen, um Verzerrungen zu vermeiden, z. B. durch intrazelluläre Vesikel in der Membranperipherie. Hier wird ein Intensitätsbild von HEK 293T-Zellen gezeigt, die myristolyated-palmitoylated-mEYFP oder mCardinal exdrücken.
Eine relative Kreuzkorrelation nahe Null wurde beobachtet, während die Autokorrelationsfunktionen charakteristische Zerfallszeiten von 10 bis 20 Millisekunden für die Diffusion von myristolyated-palmitoylated-mEYFP und mCardinal in der Plasmamembran aufweisen. Die Kreuzkorrelationsfunktionen der sFCCS-Messungen von HEK 293T-Zellen, die membranverankerte Heterodimer-Myristolyated-Palmitoylated-mCardinal-mEYFP exdrückten, wiesen positive Amplituden auf und zeigten ähnliche Zerfallszeiten wie die Autokorrelationsfunktion. sFCCS-Messungen an Zell-zu-Zell-Kontakten zwischen APLP1-mEYFP und APLP1-mCardinal-exemitten Zellen führten zu einer positiven relativen Kreuzkorrelation von 0,45.
Die sFCCS-Korrelationsfunktionen, die aus Messungen über APLP1-Cluster an Zell-Zell-Kontakten gewonnen wurden, zeigten eine stark reduzierte Dynamik, wie sie durch große Zerfallszeiten in den Schwingungen bei großen Verzögerungszeiten ersichtlich ist. Bei Zinkionenzugabe erhöhte sich die relative Kreuzkorrelation auf einen Durchschnittswert von 0,8. Darüber hinaus erhöhte sich die molekulare Helligkeit signifikant von kleinen Oligomeren auf größere Multimere, die aus 10 bis 50 Monomeren auf jeder Zelle bestehen.
Vorübergehende Instabilitäten können zu einer Kreuzkorrelationsfunktion mit negativen Werten oder einer hohen falsch positiven Kreuzkorrelation führen. Die entsprechenden Korrelationsfunktionen weichen in der Regel stark von denen der meisten Segmente ab. Als komplementärer Ansatz zur sFCCS-Kreuzkorrelationszahl und -helligkeit kann verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Mischen von transfizierten Zellen ein kritischer Schritt ist. Mischen Sie die Zellen sanft und optimieren Sie die Transfektionseffizienz, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, rote und grüne Zellen in Kontakt zu finden. Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik von Forschern auf dem Gebiet der Immunologie verwendet, um die Wechselwirkungen von Signalmolekülen in immunologischen Synapsen zu erforschen.
